来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
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**导语**
灵芝作为名贵药用真菌，其活性成分合成与发酵基质密切相关。本研究首次以农业废弃物玉米秸秆为唯一碳源基质，对灵芝（*Ganoderma lingzhi*）液体发酵过程进行全程转录组动态分析，揭示了纤维素降解和多糖、三萜等活性物质合成的关键基因表达规律。研究发现，秸秆基质不仅促进了菌体高效生长，更显著上调了多糖合成通路中多个限速酶基因的表达，为利用木质纤维素原料高值化生产灵芝活性成分提供了全新的分子理论依据，也为食药用菌发酵工艺的精准调控指明了方向。
研究背景
灵芝自古以来被誉为“仙草”，现代药理学研究证实其主要活性成分——灵芝多糖和灵芝三萜具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等多种功效。传统人工栽培周期长、品质易受环境影响，而液体深层发酵技术因生产周期短、工艺可控、产物均一等优势，成为大规模获取灵芝活性成分的重要替代方案。然而，发酵基质成本占总生产成本的较大比重，且直接决定代谢流向与目标产物得率。工业上常用葡萄糖、蔗糖等精制碳源，不仅成本高，也难以满足绿色生物制造的理念。
玉米秸秆是我国最丰富的农业废弃物之一，年产量高达数亿吨，其主要成分为纤维素、半纤维素和木质素。灵芝在自然界中生长于枯木之上，具有天然的木质纤维素降解能力，可通过分泌多种纤维素酶、半纤维素酶将秸秆转化为可发酵糖，进一步进入初级和次级代谢网络。然而，灵芝如何感知秸秆基质、激活降解酶系、并调配代谢通量偏向目标活性成分合成的分子机制，此前并不清楚。
随着高通量测序技术的普及，转录组分析能在全局水平揭示基因表达的时空变化，为阐明复杂基质条件下的代谢调控网络提供强大工具。本研究首次以玉米秸秆为唯一碳源，系统比较了灵芝液体发酵不同时间点的基因表达谱，致力于回答：秸秆基质启动了哪些纤维素降解与糖转运途径？多糖和三萜合成通路是被抑制还是激活？哪些差异表达基因具备作为代谢工程改造靶点的潜力？这些问题的解答对于以廉价秸秆替代葡萄糖，实现灵芝活性成分的低成本、可持续生产具有重要意义。
研究方法
菌株与发酵条件
研究使用灵芝标准菌株（*Ganoderma lingzhi*），经PDA斜面活化后，转接至种子培养基中获得液体种龄一致的菌丝体。以玉米秸秆为主要碳源，粉碎过筛并经碱性过氧化氢预处理以脱除部分木质素、增加纤维素酶可及性，配制为秸秆液体发酵培养基（干物质含量2%–5%）。对照采用同等碳摩尔浓度的葡萄糖培养基。发酵在三联生物反应器中进行，控制温度28±1°C，搅拌速率150 r/min，通气量1.5 vvm，初始pH 6.0，发酵周期144小时。
取样策略与RNA提取
为捕捉代谢转换的关键节点，分别在发酵第0 h（接种后即刻）、24 h（适应期/延滞期）、48 h（对数生长早期）、72 h（生长与多糖积累转折期）、96 h（三萜快速合成期）和120 h（稳定期后期）六个时间点，从试验组和对照组各采集菌丝体样品。样品立即经液氮速冻，使用TRIzol法提取总RNA，并通过琼脂糖凝胶电泳和Agilent 2100生物分析仪评估RNA完整性（RIN值≥7.0）。
转录组文库构建与测序
每个时间点设三个生物学重复，共构建36个cDNA文库。采用Illumina平台进行双末端测序（PE150），每个样本获得不少于6 Gb的clean data。原始下机数据经FastQC质量评估及Trimmomatic去除接头和低质量序列后，利用HISAT2将高质量读数比对至已发表的灵芝参考基因组。使用featureCounts计算基因表达量（FPKM），差异表达基因（DEGs）通过DESeq2筛选，标准为|log₂FoldChange| ≥ 1且校正后P值 < 0.01。
功能注释与代谢通路富集
将筛选出的DEGs比对至NR、Swiss-Prot、GO、KEGG和CAZy（碳水化合物活性酶）数据库。重点关注参与纤维素降解的糖苷水解酶（GH）、碳水化合物酯酶（CE）、辅助活性酶（AA）家族基因，以及多糖合成相关的糖基转移酶（GT）基因和三萜合成相关的甲羟戊酸（MVA）途径基因。采用KOBAS工具进行KEGG通路富集分析，通过qPCR对15个关键候选基因的表达趋势进行验证，确保转录组数据可靠性。
研究结果
玉米秸秆基质显著重塑灵芝转录谱
主成分分析显示，发酵时间点与基质类型对基因表达格局均有显著影响，秸秆发酵的生物学重复之间聚拢良好，但整体表达谱与葡萄糖组在48 h后即发生明显分离。与葡萄糖对照相比，秸秆基质下共鉴定到4112个差异表达基因（DEGs），其中上调基因2367个，下调1745个，差异表达基因数目在72–96 h达到高峰，这一阶段恰好对应菌丝体对秸秆的强降解期与多糖大量累积起始点。
纤维素酶系与糖转运蛋白基因呈时序爆发式表达
CAZy注释显示，灵芝在秸秆基质中启动了多达87个编码木质纤维素降解酶的基因显著上调。其中，属于GH5、GH6、GH7家族的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶基因在48–72 h表达量较葡萄糖组上调10–50倍，呈现典型的“共诱导”表达模式。同时，裂解多糖单加氧酶（AA9家族）基因也在同一时段高表达，可能通过氧化裂解结晶纤维素加速糖化。与之协同，5个编码葡萄糖转运蛋白（MFS超家族）的基因及2个纤维二糖转运蛋白基因在72 h达到表达峰值，保证降解产物快速进入胞内碳代谢中心。
多糖合成通路被显著激活
KEGG富集分析表明，“淀粉与蔗糖代谢”及“氨基酸糖与核苷酸糖代谢”两个通路在秸秆组极显著富集（P < 0.001）。参与灵芝多糖前体合成的关键基因，如磷酸葡萄糖变位酶（pgm）、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（ugp）、多糖合成酶（gls）及多种GT家族糖基转移酶基因，在72–96 h表达量达到对照的3.8–8.6倍。胞外多糖含量测定结果与转录数据高度吻合：秸秆组胞外多糖产量在120 h达到4.86 g/L，较葡萄糖组提高了约42%，且多糖分子量分布更趋均一。该组联分析直接证实，秸秆非但不抑制多糖合成，反而通过某种信号机制显著强化了代谢通量朝向灵芝多糖的分配。
三萜合成途径呈现“先抑后扬”动态
三萜合成的上游MVA途径关键酶基因（如hmgs、hmgr、mvk、pmk）在发酵早期（24–48 h）表达略低于葡萄糖组，但至96 h发生逆转，部分基因上调2–3倍。下游环化酶基因cyp5150l8和cyp5150l5在120 h表达量显著高于对照，表明三萜的生物合成在发酵后期被加速。灵芝酸A和灵芝酸D的定量结果显示，秸秆组总三萜产量在144 h达到428 mg/L，较对照组高出约18%。代谢轨迹分析提示，早期菌体主要分配碳代谢用于生长与纤维素降解酶的生产，当纤维素降解产物持续涌入后，碳通量才逐渐分流至三萜合成支路，呈现典型的产酶-生长-产物积累节律。
关键调控因子的共表达网络解析
通过构建加权基因共表达网络（WGCNA），鉴定出与多糖产量显著正相关的蓝色基因模块（r = 0.93, P = 2.6×10⁻⁵）。该模块包含多个转录因子基因，如Zn2Cys6型调控因子和热休克转录因子。其中，一个标注为GLZ_TF01的转录因子基因与ugp、gls表达呈严格共上调，且其启动子区包含纤维素降解产物（如纤维二糖）响应元件，推测其可能是介导秸秆信号激活多糖合成通路的中枢开关。该发现为后续通过合成生物学手段强化多糖合成提供了明确的靶点。
讨论与展望
本研究首次在全局转录层面揭示了灵芝利用玉米秸秆的分子策略，颠覆了“廉价基质必然导致活性成分产率下降”的传统认知。结果表明，灵芝能够主动感知秸秆的存在，通过程序化上调纤维素酶系和糖转运蛋白，实现木质纤维素的高效降解和摄取；同时，胞内碳代谢流向并未被不适环境所压制，反而通过特定的调控网络将过量碳流推进至多糖合成途径，提升了目标产物的产率。这种“先增容、后分流”的代谢重编程模式，体现了灵芝作为白腐真菌对木材基质的进化适应性。
该研究为秸秆等农业废弃物的高值生物转化提供了可操作的改造蓝图。未来可利用本工作鉴定的关键纤维素酶基因和转运蛋白基因，构建合成酶系分泌增强的工程菌株，进一步提高秸秆糖化速率；同时以GLZ_TF01等调控因子为切入点，设计碳通量感应-响应回路，动态调控多糖与三萜的合成比例。此外，该转录组数据还为其他木质纤维素利用真菌的代谢工程研究提供了宝贵参考。
然而，本研究仍局限于单一灵芝菌株和批次发酵条件，秸秆预处理方法对不同来源秸秆组分的影响、发酵放大过程中氧传质与剪切力对基因表达稳定性的影响尚待评估。后续研究可结合代谢组学与蛋白组学，形成多组学整合分析，并开展连续发酵或补料发酵试验，推动这一绿色工艺走向工业化。
**参考来源**
Wang, S., Li, J., Fan, Q., Wang, S., & Sun, C. (2024). Transcriptome Analysis of *Ganoderma lingzhi* Liquid Fermentation Process Using Corn Straw as Matrix. *Agriculture*, 14(8), 1271. [DOI: 10.3390/agriculture14081271](https://doi.org/10.3390/agriculture14081271)
DOI: 10.3390/agriculture14081271