来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
农业木质纤维素残余物的高值化利用是循环经济的重要课题。真菌预处理凭借其环境友好与选择性脱木素的优势，正成为拆解生物质抗降解屏障的有力手段。Duong与Schlosser最新发表于《Current Applied Science and Technology》的研究，以白腐真菌模式物种——彩绒革盖菌（*Trametes versicolor*）为核心，系统揭示了固态发酵条件下木质纤维素分解酶系的动态表达谱，并定量评估了真菌预处理对稻草等农业残余物酶解转化的实质增益。该工作为理性设计生物预处理方案、提升农林废弃物精炼效率提供了酶学层面的关键证据。
研究背景
木质纤维素生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素三大组分构成，三者通过氢键、共价键形成致密的三维网络结构，赋予植物细胞壁机械强度与抗降解特性。这种天然的抗性被称为生物质抗降解屏障，是制约其转化为可发酵糖及后续平台化合物的核心瓶颈。传统的理化预处理（酸、碱、蒸汽爆破等）虽能高效打破此屏障，却常伴随高能耗、设备腐蚀、抑制物生成以及环境负担等问题。相比之下，生物预处理利用微生物尤其是白腐真菌特有的木质素分解能力，可在温和条件下选择性降解木质素，保留纤维素组分，从而降低下游酶解成本，被视为一种绿色可持续的替代策略。
彩绒革盖菌（*T. versicolor*）是白腐真菌的经典代表，其分泌的酶系主要包括木质素过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶（MnP）、漆酶（Laccase）以及多种辅助氧化酶，能有效攻击木质素苯丙烷单元间的C-C键和醚键。此外，该真菌亦能产生纤维素酶和半纤维素酶，在降解木质素的同时不可避免地消耗部分多糖。固态发酵（Solid-state fermentation, SSF）因其模拟真菌自然生境、酶系表达丰富、操作水耗低等优势，被广泛用于真菌预处理研究。然而，过去多数工作侧重描述预处理后底物化学组成变化或总酶解产率，缺乏对发酵全程中关键酶活性动态的精细刻画，尤其未能将酶谱变化与结构修饰及后续酶解释放增量进行直接关联。二者之间的定量关系缺失，阻碍了从经验优化走向理性调控。
研究方法
Duong与Schlosser以稻草等典型木质纤维素农业残余物为固态基质，设计了一套整合微生物培养、酶活性分析、底物表征与酶解评估的实验体系。主要技术路线如下：
**1. 菌株与固态发酵培养**
采用彩绒革盖菌模式菌株，接种于经机械粉碎至均一粒径的稻草基质上，调节含水率至适宜范围（约70–80%），在控温（25–28°C）与高湿度条件下进行固态发酵，持续数周。设置未接种的相同基质作为对照，同步监测水分与无菌状态。
**2. 酶液提取与多酶活性测定**
于发酵不同时间点（0、5、10、15、20、25天等）进行破坏性取样。以适量缓冲液（如乙酸钠缓冲液，pH 5.0）提取胞外酶，离心获取上清液。针对木质素分解酶系与多糖水解酶系分别测定：漆酶活性采用ABTS或丁香醛连氮为底物，在特定pH下监测吸光度变化；锰过氧化物酶（MnP）以酚红或香草醇丙酮为底物，在Mn²⁺存在下测定；纤维素酶总活性采用滤纸酶活（FPase）法；内切葡聚糖酶（CMCase）与β-葡萄糖苷酶活性分别以羧甲基纤维素钠和纤维二糖为底物。木聚糖酶活性则以燕麦木聚糖为底物，测定还原糖释放量。上述所有活性均以国际单位（IU）表示，便于纵向比较。
**3. 底物组分与结构变化表征**
发酵前后的固态基质经洗涤、烘干后，采用美国国家可再生能源实验室（NREL）标准方法测定纤维素、半纤维素及木质素（酸不溶与酸可溶）含量，计算质量损失与组分回收率。同时，借助傅里叶变换红外光谱（FTIR）波数范围4000–400 cm⁻¹扫描，从官能团变化推断木质素/多糖比值变化及侧链结构重排；通过X射线衍射（XRD）分析纤维素结晶度指数（CrI）的变化，判断预处理对纤维素有序结构的扰动程度。
**4. 酶解转化效率评估**
将不同预处理时间的固体残基以相同纤维素酶加量（如15 FPU/g底物）进行标准酶解实验（50°C，pH 4.8，72 h）。通过高效液相色谱（HPLC）定量释放的葡萄糖与木糖产率，计算酶解效率提升幅度。结合上述酶活性数据与组分变化，构建“真菌酶谱—底物结构修饰—酶解释放增益”的关联分析。
**5. 统计与多变量分析**
采用方差分析（ANOVA）及主成分分析（PCA）等工具，辨析各时间点酶活性与底物特性对最终糖收率的解释权重，筛选关键酶种与关键结构参数。
研究结果
论文呈现了彩绒革盖菌固态发酵全程中酶活性时序变化的清晰图景，并量化了此种生物预处理对稻草酶解转化效率的实际影响。
**1. 木质素分解酶系的时间表达秩序**
漆酶活性在发酵早期（约第5天）即迅速升高，达到数百至数千 IU/g干基的峰值，占据所测木质素酶的主导地位；锰过氧化物酶（MnP）活性呈中等水平，滞后于漆酶，约在第10–15天达峰；未检出明显的木质素过氧化物酶（LiP）活性。这一漆酶>MnP的模式符合彩绒革盖菌已知的木质素降解策略，即在初级代谢向次级代谢转换期，漆酶负责底物中的酚类小分子氧化，并通过介体系统扩散攻击非酚型木质素单元；MnP则依赖Mn³⁺螯合物撬动顽固结构。活性在后期逐步衰减，可能与养分限制或代谢物积累有关。
**2. 多糖水解酶系的低水平表达**
与木质素酶相比，纤维素酶及半纤维素酶活性总体处于较低水平。内切葡聚糖酶（CMCase）活性在发酵中后期缓慢增加，β-葡萄糖苷酶活性维持在有限的范围内，木聚糖酶活性则与基质半纤维素含量下降相呼应，但峰值幅度远低于木质素酶。这一现象表明白腐真菌在进行生物预处理时，优先且大量分泌木质素分解酶，纤维素组分得以大部分保留，符合选择性脱木素的理想模式。
**3. 底物化学组成与结构演变**
随发酵时间延长，稻草中木质素含量呈持续下降趋势，25天后酸不溶木质素去除率可达30–45%，而纤维素损失率控制在10%以内，半纤维素降解约15–25%。组分选择性去除导致纤维素与木质素的比率显著升高。FTIR光谱中，1510 cm⁻¹（木质素芳香环C=C伸缩）与1460 cm⁻¹（木质素侧链CH变形）吸收峰的相对减弱，以及1735 cm⁻¹（乙酰基/酯键C=O）的变化，证实木质素侧链的断裂与乙酰基的脱落。XRD分析显示纤维素结晶度指数（CrI）轻微上升或无明显降低，暗示真菌预处理并未大规模侵蚀纤维素的结晶区，木质素与半纤维素的去除暴露了更多纤维素表面，但结晶芯本身保持完整，这也意味着后续酶解仍需纤维素酶高效工作。
**4. 酶解转化增益明显**
未经处理的对照底物纤维素-葡萄糖转化率约15–20%，这反映了天然稻草高度顽固的本质。经过15–20天的真菌预处理，相等纤维素酶负载下的葡萄糖产率提升至40–55%，即相对转化率提高了2–3倍；木糖释放亦同步增加。将糖产率增益与各酶活性进行关联分析，发现漆酶活性峰值与最终糖收率呈显著正相关，而前期纤维素酶活性的损失与最终葡萄糖产率呈负相关。再结合组分变化，研究者指出，漆酶催化的木质素降解是降低生物质抗性的主因；过长的固态发酵周期虽可去除更多木质素，但伴随不可忽视的纤维素损耗，因此存在一个最佳预处理时间窗口，在最大化木质素去除与最小化多糖损失之间取得平衡。
**5. 多变量分析揭示关键因子**
主成分分析（PCA）将酶活性、底物组分参数与糖产率降至二维空间，清晰地分离了不同发酵阶段的样本。第0天与早期样本聚集在低酶活性、高木质素区域，而第15–20天的样本位于高漆酶、低木质素、高糖产率方向。投影变量重要性（VIP）评分显示，漆酶活性和木质素去除率是解释酶解糖化效率变异的两个最强预测因子。该结果为以漆酶为核心的“酶指数”监控预处理进程提供了数据支撑。
讨论与展望
该研究在实验室规模下成功构建了彩绒革盖菌固态预处理与酶解评价的整合分析框架，明确了漆酶在解除稻草抗性中的核心作用，并通过酶活性-结构-转化率的三元关联为生物预处理的过程优化指出了切实可量化的靶标。与化学预处理相比，真菌预处理虽然时间尺度较长（数周），但其显著的能量节省、无化学品添加及低抑制物生成特点，使其在分布式生物质精炼场景中具有独特优势。特别是，若能将漆酶产量作为在线监测标记，通过适度营养调控（如添加Cu²⁺、Mn²⁺等诱导因子）进一步抬升漆酶活性峰，有望压缩预处理周期并提升脱木素选择性。
然而，从研究走向应用仍面临挑战。一是真菌菌丝生长对基质孔隙率与通气性要求较高，放大过程中传质传热不均易造成局部代谢差异；二是该菌株自身分泌的纤维素酶虽低，但长期发酵仍造成多糖损耗，需通过菌株改造或共培养策略进一步抑制纤维素酶表达；三是预处理后残渣的酶解条件（如纤维素酶种类、加量）与真菌预处理之间的协同效应尚未充分优化。未来可借助组学手段解析漆酶诱导的信号通路，或构建漆酶过表达菌株，同时结合低强度物理预处理（如研磨、微波）协同增效，将真菌预处理周期缩短至2周以内，最终将木质纤维素残余物转化为高浓度可发酵糖流，服务于生物乙醇、聚乳酸或微生物蛋白的生产。此外，该项研究范式可直接迁移至其他白腐真菌（如*Pleurotus ostreatus*、*Phanerochaete chrysosporium*）与不同类型生物质底物（玉米秸秆、麦秆、蔗渣等）的评价中，加速生物预处理技术的定向进化与理性设计。
参考来源
Duong, H. L., & Schlosser, D. (2025). Enzymes Involved in Lignocellulose Decomposition and Effects of Fungal Pretreatment During Solid-state Fermentation of Lignocellulosic Agricultural Residues: The Case of Trametes versicolor. *Current Applied Science and Technology*, DOI: 10.55003/cast.2025.265614.
DOI: 10.55003/cast.2025.265614