来源：Engineering central metabolism in Yarrowia lipolytica increases lipid accumulation（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作为非常规产油酵母，其乙酰-CoA供应能力备受关注。本研究系统评估了丙酮酸旁路、磷酸酮醇酶旁路和肉碱穿梭对中心碳代谢的影响，发现改造后碳流优先导向脂质合成途径。引入肉碱穿梭相关基因 YlCAT2 后获得最高脂质含量0.61 g/g DCW；而丙酮酸旁路基因组合（YlPDC1、YlALD3、YlACS1）使生产效率提升78.2%。
研究背景
解脂耶氏酵母以卓越的脂质积累能力著称，部分工程菌株脂质含量可达干重的90%以上。该菌底物利用谱广泛，近年代谢工程进展使其能够利用木酮糖等木质纤维素材料，且在高密度工业发酵环境中表现出优异的生长潜力。美国FDA授予其GRAS认证，欧洲食品安全局亦给予QPS资格，进一步巩固了其工业应用地位。
乙酰辅酶A是连接多种代谢途径的核心分子，除能量代谢外，还通过蛋白乙酰化影响基因表达和蛋白质功能。大多数关于解脂耶氏酵母的生物技术研究聚焦于乙酰-CoA衍生产物。然而，如何通过工程手段增强乙酰-CoA供应并引导碳流定向分配，仍是该领域的核心挑战。本研究通过引入三种代谢旁路，系统考察了中心碳代谢改造对脂质和β-胡萝卜素生产的影响。
研究方法
2.1 菌株、材料与培养基
质粒构建与繁殖使用大肠杆菌DH10β菌株。LB培养基配制：将10 g蛋白胨、5 g酵母提取物和5 g NaCl溶于1000 mL去离子水，高压灭菌。灭菌后加入适当抗生素用于质粒筛选。本研究所用全部解脂耶氏酵母菌株均源自YB-392野生型菌株，各菌株谱系关系见图2。
葡萄糖储备液：将600 g/L葡萄糖溶于去离子水，高压灭菌后储存于4°C。50× MES缓冲液储备液：将97.6 g 2-乙磺酸溶于500 mL去离子水，调pH至5.7，经0.22 µm滤膜过滤后储存于4°C。YPD培养基：将20 g蛋白胨和10 g酵母提取物溶于800 mL去离子水，调pH至6.5，高压灭菌后加入33.3或166.7 mL 60%葡萄糖储备液，使终浓度为20或100 g/L（分别称为YPD或YPD100）。无机盐培养基：将1.7 g酵母氮源基础培养基（不含氨基酸和硫酸铵，SIGMA）和0.4 g (NH₄)₂SO₄溶于800 mL去离子水，高压灭菌后加入33.3 mL或100 mL 60%葡萄糖储备液（分别称为SC-2或SC-5）、20 mL 50× MES缓冲液储备液，补加无菌去离子水至总体积1.0 L。酵母合成 dropout 培养基补充物（SIGMA）按制造商建议配制。显性标记筛选使用300 µg/mL诺尔丝菌素或400 µg/mL潮霉素。固体平板添加20 g/L琼脂。
【数据】LB培养基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 5 g/1000 mL；葡萄糖储备液：600 g/L；MES缓冲液：97.6 g/500 mL，pH 5.7；YPD培养基：葡萄糖终浓度20或100 g/L；SC-2/SC-5：葡萄糖终浓度20或100 g/L；筛选浓度：诺尔丝菌素300 µg/mL、潮霉素400 µg/mL；琼脂：20 g/L
2.2 克隆与转化
表达盒构建采用基于YTK工具包的两阶段Golden Gate克隆系统作为骨架，遗传元件使用相同的悬垂设计。生物体特异性元件（启动子、基因、终止子、同源臂和标记）均配备BsaI识别位点和相应悬垂。第一阶段组装利用BsaI酶制备转录单元并确定其在最终表达盒中的位置。所有转录单元均使用强组成型Php8d启动子和标准Tcyc1终止子。第二阶段利用BsmBI酶将多个转录单元组合成单个多基因表达盒。通过将适当转录单元与zeta区域和相应筛选标记结合组装表达盒。本研究所用异源基因均针对解脂耶氏酵母转录进行密码子优化，由Twist Bioscience合成，收到后经序列验证。全部基因列表见补充数据（表S1和表S2），组装表达盒列表见补充数据（表S3）。转化前，表达盒经NotI酶切线化，正确长度的线性化片段通过凝胶电泳纯化。解脂耶氏酵母菌株采用改良醋酸锂转化方案进行线性化片段转化。阳性转化子在适当筛选培养基上筛选，并通过诊断PCR验证基因正确整合。为评估表达水平，使用Qiagen RNA提取试剂盒从1天龄培养物中提取mRNA，按制造商说明操作。逆转录和基因组DNA消化使用Thermo Scientific逆转录试剂盒。基因组DNA提取使用Macherey-Nagel NucleoSpin DNA Yeast总DNA提取试剂盒，按制造商说明操作。qPCR分析使用Applied Biosystems qPCR仪器配合Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR预混液，三次重复。肌动蛋白编码基因（YlACT1）作为归一化对照。PCR引物见补充数据（表S4）。
【数据】Golden Gate克隆：BsaI（第一阶段）+ BsmBI（第二阶段）；启动子：Php8d；终止子：Tcyc1；线性化：NotI；转化：醋酸锂法；qPCR：三次重复；内参基因：YlACT1
2.3 48孔板培养测定亲本菌株β-胡萝卜素产量
预培养：在48孔微量滴定板每孔中加入1000 µL YPD培养基，在旋转摇床上28°C、220 rpm、70%湿度控制条件下培养24小时。24小时后，将20 µL种子培养物转移至含1000 µL新鲜SC-5培养基的48孔微量滴定板中。发酵在旋转摇床上28°C、220 rpm、70%湿度控制条件下进行四天。96小时后取样测定。
【数据】预培养：YPD培养基1000 µL/孔，28°C，220 rpm，24 h；接种量：20 µL/1000 µL SC-5；发酵：28°C，220 rpm，96 h
2.4 摇瓶发酵
预培养：将5 mL YPD培养基在旋转摇床上28°C、220 rpm、70%湿度控制条件下培养24小时。24小时后，使用Tecan Infinite M200酶标仪在600 nm处测定细胞密度。主发酵：250 mL锥形瓶含50 mL无机盐培养基，接种预培养物使初始光密度（OD₆₀₀）为0.05。摇瓶发酵在旋转摇床上28°C、220 rpm、70%湿度控制条件下进行四天。72和96小时后取样测定。
【数据】预培养：5 mL YPD，28°C，220 rpm，24 h；主发酵：50 mL无机盐培养基/250 mL锥形瓶，初始OD₆₀₀=0.05，28°C，220 rpm，72/96 h取样
2.5 类胡萝卜素提取与定量
从400 µL发酵液样品中用等体积乙酸丁酯和半体积玻璃珠提取β-胡萝卜素。混合物使用珠磨仪（FastPrep-96）中速匀浆5分钟。匀浆后，样品在14,000 rpm离心10分钟，上清液小心转移至玻璃小瓶进行分析。β-胡萝卜素定量使用Thermo Scientific Accela HPLC系统。分离在Kromasil 100–5 C18色谱柱（50×4.6 mm，5 µm粒径）上进行。流动相程序以20%二氯甲烷和80%甲醇开始，10分钟内线性梯度增加至50%二氯甲烷。流速设定为0.5 mL/min，柱温箱温度维持在25°C。β-胡萝卜素使用DAD检测器在455 nm波长处检测。
【数据】样品量：400 µL；提取溶剂：乙酸丁酯（等体积）+玻璃珠（半体积）；匀浆：FastPrep-96中速5 min；离心：14,000 rpm，10 min；HPLC：C18柱（50×4.6 mm，5 µm），流速0.5 mL/min，柱温25°C，检测波长455 nm
2.6 脂质提取与定量
细胞干重测定：将5.0 mL全发酵液转移至预称重的15 mL离心管中。离心去除上清液并洗涤细胞，重复洗涤三次。随后将离心管放入真空干燥器，在80°C、20 mbar条件下干燥12小时。称重前将真空干燥器温度降至30°C。脂质提取前，将5.0 mL发酵液样品转移至15 mL离心管中，2000 g离心10分钟去除培养基，用水洗涤三次后液氮冷冻，储存于−80°C直至进一步处理。总脂质采用Folch方案提取：样品经珠磨匀浆，用氯仿:甲醇2:1（v:v）萃取三次，有机相合并至预称重管中，最后干燥并称重。
【数据】干重测定：5.0 mL样品，80°C、20 mbar干燥12 h；脂质提取：2000 g离心10 min，氯仿:甲醇2:1（v:v）萃取×3
研究结果
解脂耶氏酵母以积累脂质作为能量储存机制而闻名。它能从环境中同化脂质，或在碳源充足时高效合成甘油三酯（TAG）。然而，不同解脂耶氏酵母菌株合成和积累脂质的能力存在显著差异。虽然许多研究团队常用W29菌株，本研究选择YB-392菌株，因其具有更优异的脂质生产能力。
为全面考察代谢旁路在菌株工程不同阶段的影响，我们制备了一组亲本菌株（图2）。CH-173菌株为中间菌株，由YB-392菌株通过删除LEU2和URA3基因并引入携带GGS1、carB和carRP基因的表达盒（表S2）制备，该表达盒使菌株具备β-胡萝卜素合成能力（BCAR表达盒）。从CH-173菌株出发，通过LEU2筛选引入额外BCAR表达盒制备TY-143菌株。为制备原养型TY-160菌株，用URA3筛选将额外BCAR表达盒转化至TY-143菌株。另制备原养型TY-183菌株，将单个BCAR表达盒引入野生型YB-392菌株。最后纳入深度工程化的CH-826菌株——该菌株在基于YPD的发酵培养基中、生物反应器条件下可产4 g/L β-胡萝卜素（图S2）。
在确定的、基于YNB的基础培养基SC-5中比较所有亲本菌株的脂质和β-胡萝卜素产量（图3）。所有亲本菌株的脂质产量稳定在约0.33 g/g DCW（图3A），而β-胡萝卜素产量出现显著变化（图3B）。携带单个BCAR表达盒的TY-183菌株产334.6 ± 41.6 mg/L β-胡萝卜素。相比之下，在leu2和ura3营养缺陷型菌株（CH-173）中表达单个BCAR表达盒仅产50.1 ± 11.3 mg/L β-胡萝卜素，远低于任何原养型菌株的β-胡萝卜素滴度（图3B和图S3）。TY-143和TY-160分别产461.4 ± 10.1 mg/L和468.5 ± 27.1 mg/L β-胡萝卜素。这一结果表明，通过引入两个BCAR表达盒，仅依靠“拉动”策略即可达到细胞β-胡萝卜素生产能力的上限，其他因素可能限制进一步增产。
【数据】亲本菌株脂质含量：约0.33 g/g DCW；TY-183：334.6 ± 41.6 mg/L β-胡萝卜素；CH-173：50.1 ± 11.3 mg/L；TY-143：461.4 ± 10.1 mg/L；TY-160：468.5 ± 27.1 mg/L；CH-826：4 g/L β-胡萝卜素（生物反应器）
本研究选择六个研究对象：两个丙酮酸旁路构建体（丙酮酸旁路#1：YlPDC1 + YlALD3 + YlACS1；丙酮酸旁路#2：YlPDC2 + YlALD5 + YlACS1）、一个磷酸酮醇酶旁路构建体（LmXPK + CkPTA）和三个肉碱穿梭构建体（ScCAT2、YlCAT2和YlYAT1）（表1）。首先选取两组解脂耶氏酵母天然基因组合，均与丙酮酸旁路相关，此前报道这两种组合对增强聚酮化合物生产有益。其次，检验一组与磷酸酮醇酶旁路相关的特定基因组合，该组合已被报道可增加脂质产量。最后，研究三个与肉碱穿梭相关的基因：酿酒酵母肉碱乙酰转移酶基因ScCAT2及其两个解脂耶氏酵母同源基因YlCAT2和YlYAT1。
在YB-392菌株中评估所选基因子集的表达水平（图4）。天然基因的表达水平以肌动蛋白编码基因YlACT1为参照进行归一化，并与天然（即未过表达）变体进行比较。异源基因的表达则与YlACT1基因比较。使用强合成启动子导致基因表达水平升高，尤其是YlYAT1基因，其表达量比天然变体高200倍以上。确认各基因表达后，制备表达质粒（表1），导入制备好的亲本菌株，并确认每个菌株中的单拷贝整合（图S4和图S5）。
【数据】YlYAT1表达量：比天然变体高200倍以上
选择三个菌株：携带单个BCAR表达盒的TY-183、携带三个BCAR表达盒的TY-160、以及携带三个BCAR表达盒并附加甲羟戊酸途径修饰的CH-826（图2）。所有制备菌株在摇瓶中用确定培养基进行一系列发酵实验。使用一种标准葡萄糖浓度培养基和一种高葡萄糖浓度培养基以模拟氮限制条件。实验过程中测定菌株的生长和脂质含量以及β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸和葡萄糖的浓度。为便于结果解读，将数据归一化至对照菌株。归一化使我们能够在评估单个修饰在不同条件下对不同菌株的影响时获得更广阔的视角。
引入中心碳代谢修饰基因后，脂质生产参数出现显著上升趋势（图5）。携带空表达盒的对照菌株脂质含量为0.36 ± 0.01 g/g DCW，脂质产率为0.037 ± 0.003 g/g葡萄糖。携带丙酮酸旁路#1表达盒（表1）的解脂耶氏酵母细胞脂质含量为0.57 ± 0.07 g/g DCW，较对照提高60.6%，脂质产率为0.066 ± 0.008 g/g葡萄糖，较对照提高78.2%，为本研究记录到的最高脂质产率。同时，过表达肉碱穿梭基因YlCAT2获得最高脂质含量0.61 ± 0.04 g/g DCW，较对照菌株高71.8%。YlCAT2过表达菌株的脂质含量略低于此前报道的数值，但本研究的菌株同时生产β-胡萝卜素，且未包含脂质生物合成途径中的任何额外修饰（如YlACC1和YlDGA1基因的过表达）。YlCAT2过表达后脂质产率为0.053 ± 0.004 g/g葡萄糖，脂质生物合成效率提高43.3%。同样，携带丙酮酸旁路#2表达盒的菌株脂质产率提高55.3%，达0.057 ± 0.007 g/g葡萄糖。ScCAT2过表达导致脂质含量为0.42 ± 0.04 g/g DCW，较对照菌株温和提高17.0%。
【数据】对照菌株：脂质含量0.36 ± 0.01 g/g DCW，脂质产率0.037 ± 0.003 g/g葡萄糖；丙酮酸旁路#1：脂质含量0.57 ± 0.07 g/g DCW（+60.6%），脂质产率0.066 ± 0.008 g/g葡萄糖（+78.2%）；YlCAT2：脂质含量0.61 ± 0.04 g/g DCW（+71.8%），脂质产率0.053 ± 0.004 g/g葡萄糖（+43.3%）；丙酮酸旁路#2：脂质产率0.057 ± 0.007 g/g葡萄糖（+55.3%）；ScCAT2：脂质含量0.42 ± 0.04 g/g DCW（+17.0%）
观察到脂质产量增加后，我们将注意力转向评估中心碳代谢修饰对β-胡萝卜素生物合成的影响。引入修饰后，我们注意到修饰菌株的生长速率略有降低，但下降幅度不超过10%（图6A）。然而，对β-胡萝卜素生产的影响更为显著。所有修饰菌株的β-胡萝卜素滴度均低于对照（图6B）。生长与β-胡萝卜素产量之间的关系表明，β-胡萝卜素含量的下降主要归因于β-胡萝卜素生物合成减少，而非生长减慢。同样，大多数修饰菌株的β-胡萝卜素产率也出现下降（图6D）。在丙酮酸旁路和磷酸酮醇酶旁路的多个基因组合的联合筛选中，我们记录了类似结果（图S6）。同时，过表达肉碱穿梭基因YlYAT1的菌株其脂质和β-胡萝卜素产量水平与对照菌株相似（图5和图6），这与最近提出的YlYAT1编码的肉碱乙酰转移酶的胞质作用一致。
【数据】生长速率下降：不超过10%；β-胡萝卜素滴度：所有修饰菌株均低于对照
讨论与解读
本研究旨在评估通向乙酰-CoA的代谢旁路对产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母的影响。通过修饰上游代谢增加乙酰-CoA供应，发现大多数中心碳代谢修饰均使菌株脂质产量增加，表明此类工程策略在提高解脂耶氏酵母脂质生产方面具有有效性。另一方面，β-胡萝卜素产量降低，表明乙酰-CoA供应增加时，碳流主要被导向脂质生物合成途径。
编译者解读：本研究巧妙利用“拉动”策略构建β-胡萝卜素报告系统，反向揭示碳流分配规律——当乙酰-CoA供应增加时，脂质合成途径在竞争中获得优先权。这一发现对合成生物学应用具有双重启示：对于脂质产品，中心代谢改造是有效增产手段；而对于乙酰-CoA衍生的高附加值产品（如类胡萝卜素、聚酮化合物），则需同时强化目标产物的“拉动”强度或削弱脂质合成竞争通路。YlCAT2的优异表现提示肉碱穿梭在乙酰-CoA跨区室转运中的关键角色，而YlYAT1的功能差异也提醒我们同源基因可能占据不同亚细胞定位，功能注释需谨慎。
参考来源
Markuš T. Engineering central metabolism in Yarrowia lipolytica increases lipid accumulation. Biochemical Engineering Journal, 2025. DOI: 10.1016/j.bej.2024.109589
DOI: 10.1016/j.bej.2024.109589