来源：Exploring lipids and citric acid production by Yarrowia lipolytica in lignocellulosic biomass hydrolysate-mimicking media: Effect of cultivation operation modes（Process Biochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质纤维素水解液是第二代生物炼制的核心碳源，但其中复杂的抑制物组成对微生物发酵构成严峻挑战。本研究以两种解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株W29和NCYC 2904为对象，在模拟桉树皮水解液培养基中系统比较了批次、补料分批和重复批次三种培养模式的油脂与柠檬酸合成潜力。结果显示，NCYC 2904在两级重复批次培养中实现最高生物量66 g·L⁻¹和油脂浓度25 g·L⁻¹，而W29在批次培养中柠檬酸产量达44 g·L⁻¹。菌株-模式匹配策略的价值由此凸显。
研究背景
微生物油脂因在化妆品、食品、制药、生物燃料及油化学品等领域的广泛应用而备受关注。解脂耶氏酵母作为产油酵母的模式菌株，凭借高油脂积累能力和成熟的遗传工具脱颖而出。其积累的油脂以三酰甘油为主，脂肪酸组成以C16–C18为主，与植物油相似，适用于生物柴油和生物航空燃料生产。柠檬酸作为该酵母共产的重要有机酸，在食品饮料、制药、化妆品等行业需求持续增长，2024–2032年预测期增长率达4.1%。油脂合成与柠檬酸产生均发生在营养限制条件下，碳源过量而氮源耗尽时，碳流转向脂质积累或柠檬酸分泌——具体走向取决于菌株特性和培养条件。木质纤维素水解液中的糖类与抑制物（乙酸、甲酸、5-羟甲基糠醛）浓度波动大，如何在模拟真实水解液组成的培养基中筛选最优菌株-工艺组合，是生物炼制设计的关键问题。
研究方法
2.1 菌株、保藏与接种物制备
Yarrowia lipolytica W29（ATCC 20460）与 Yarrowia lipolytica NCYC 2904 的储备培养物在 YPD 培养基（葡萄糖 20 g·L⁻¹、蛋白胨 20 g·L⁻¹、酵母提取物 10 g·L⁻¹）中培养 2 天后，于 −80 °C 下以 20%（v/v）纯甘油保存。酵母细胞（一份冷冻储备）在 YPD 培养基中过夜培养（27 °C，200 rpm），离心后重悬于培养基中，初始生物量浓度为 0.5 g·L⁻¹。
【数据】培养基：YPD；温度：−80 °C（保藏）/27 °C（培养）；转速：200 rpm；初始生物量：0.5 g·L⁻¹；甘油浓度：20%（v/v）
2.2 富脂生物量与柠檬酸生产
生物反应器实验在 3.7-L 反应器（RALF PLUS SOLO，Bioengineering，瑞士）中进行，温度 27 °C，搅拌速率 400 rpm，比气流速率 1 vvm。培养基中溶解氧用极谱探针（InPro600，Mettler Toledo，美国）结合 BioScadaLab 软件测量。pH 值用探针（405-DPAS-SC-K8S，Mettler Toledo，美国）测量，通过添加 NaOH 4 M 或 HCl 4 M 自动维持在 5.5 ± 0.5。定期采集样品，定量生物量、油脂和柠檬酸产量，以及葡萄糖、木糖、乙酸、甲酸和 5-HMF 的消耗。
【数据】反应器体积：3.7 L；温度：27 °C；搅拌速率：400 rpm；气流速率：1 vvm；pH：5.5 ± 0.5；NaOH/HCl 浓度：4 M
#### 2.2.1 批次培养
为评价 LBH 中常见化合物浓度对批次培养中生物量和油脂生产的影响，研究了两种培养基：（1）模拟桉树皮水解液培养基，含葡萄糖 50 g·L⁻¹、木糖 7.6 g·L⁻¹、乙酸 5.6 g·L⁻¹、甲酸 0.56 g·L⁻¹、5-HMF 0.22 g·L⁻¹（EH-MM）；（2）EH-MM 浓度的两倍（EH-MM2）。两种培养基均添加玉米浆（CSL）0.5 g·L⁻¹ 和 (NH₄)₂SO₄ 以实现 C/N 比为 75。C/N 比基于葡萄糖、木糖、乙酸、甲酸、5-HMF 和 (NH₄)₂SO₄ 的浓度计算。为研究不同供氧条件，使用 EH-MM 评估了两个工作体积：反应器总体积的 57%（WV-57%）和 24%（WV-24%），两种条件下搅拌速率相同（400 rpm）。两种条件下体积气流速率通过根据工作体积调整气流保持恒定在 1 vvm（WV-57% 为 2.1 L·min⁻¹，WV-24% 为 0.9 L·min⁻¹）。
【数据】EH-MM 组成：葡萄糖 50 g·L⁻¹、木糖 7.6 g·L⁻¹、乙酸 5.6 g·L⁻¹、甲酸 0.56 g·L⁻¹、5-HMF 0.22 g·L⁻¹；CSL：0.5 g·L⁻¹；C/N 比：75；工作体积：57% 和 24%；气流：2.1 L·min⁻¹（WV-57%）/0.9 L·min⁻¹（WV-24%）
#### 2.2.2 补料分批培养
补料分批实验以批次培养（WV-24%）开始，使用 1:2.5（v/v）稀释的 EH-MM 版本，添加 CSL 0.5 g·L⁻¹ 和 (NH₄)₂SO₄ 0.64 g·L⁻¹，C/N 比为 75。当葡萄糖浓度降至约 5 g·L⁻¹ 后，向反应器补加培养基，组成为葡萄糖 72.5 g·L⁻¹、木糖 11 g·L⁻¹、乙酸 8.1 g·L⁻¹、甲酸 0.8 g·L⁻¹、5-HMF 0.32 g·L⁻¹（浓度计算为等于批次实验中各化合物的总质量）、(NH₄)₂SO₄ 2.33 g·L⁻¹ 和 CSL 0.5 g·L⁻¹。补料培养基以 0.08 mL·min⁻¹ 的恒定流速（初始稀释率 0.005 h⁻¹）供给，直到工作体积达到反应器总体积的 57%。
【数据】初始培养基：1:2.5 稀释 EH-MM；CSL：0.5 g·L⁻¹；(NH₄)₂SO₄：0.64 g·L⁻¹；C/N 比：75；补料培养基：葡萄糖 72.5 g·L⁻¹、木糖 11 g·L⁻¹、乙酸 8.1 g·L⁻¹、甲酸 0.8 g·L⁻¹、5-HMF 0.32 g·L⁻¹、(NH₄)₂SO₄ 2.33 g·L⁻¹、CSL 0.5 g·L⁻¹；流速：0.08 mL·min⁻¹；初始稀释率：0.005 h⁻¹；终体积：57%
#### 2.2.3 重复批次培养
重复批次培养使用 EH-MM（WV-24%）进行。当葡萄糖浓度降至约 15 g·L⁻¹（RB-A）或降至 2 g·L⁻¹ 以下（RB-B）时，收获细胞，离心（8000 rpm，10 min），重悬于新鲜 EH-MM 中进行第 2 批。此外，为提高生物量产量，进行了增加糖和 CSL 浓度的两级重复批次培养（TSRB）。第 1 批中，细胞在 C/N 比为 10（(NH₄)₂SO₄ 24.4 g·L⁻¹）的 EH-MM2 中培养以促进生物量生产，CSL 5 g·L⁻¹。当葡萄糖浓度降至 2 g·L⁻¹ 以下时收获细胞，离心（8000 rpm，10 min），重悬于通过将 (NH₄)₂SO₄ 降至 3.2 g·L⁻¹ 实现 C/N 比为 75 的新鲜培养基中，进行第 2 批以促进油脂合成。
【数据】RB-A 收获阈值：葡萄糖约 15 g·L⁻¹；RB-B 收获阈值：葡萄糖 < 2 g·L⁻¹；离心：8000 rpm，10 min；TSRB 第 1 批：EH-MM2，C/N 比 10，(NH₄)₂SO₄ 24.4 g·L⁻¹，CSL 5 g·L⁻¹；TSRB 第 2 批：C/N 比 75，(NH₄)₂SO₄ 3.2 g·L⁻¹
2.3 体积氧传质系数测定
体积氧传质系数（k L a）采用静态排气法计算，针对反应器总体积的 24% 和 57% 两个工作体积，方法详见 Wise [27]。简言之，在初始氮气排气阶段后，监测无细胞培养基中溶解氧浓度。k L a 值由 ln(1 − C L /C) 对时间（t）作图所得斜率获得，根据方程 1，其中 C 为饱和溶解氧浓度，C L 为培养基中溶解氧浓度。
【数据】k L a 测定方法：静态排气法；工作体积：24% 和 57%
2.4 分析方法
生物量浓度通过测量培养物在 600 nm 处的光密度（OD₆₀₀）估算，并使用每种 Y. lipolytica 菌株的特异性校准曲线转换为干细胞重量（g·L⁻¹）。校准曲线基于每种菌株在 YPD 培养基中培养 19 h 的培养物建立。收集等分试样，在不同稀释度下测量 OD₆₀₀。为测定干细胞重量（DCW），细胞通过 0.22 μm 膜过滤器过滤，并在 60 °C 下干燥至恒重。建立了每种菌株 OD₆₀₀ 与 DCW 之间的相关系数：OD₆₀₀ = (0.56 ± 0.04) × DCW（W29）；OD₆₀₀ = (0.39 ± 0.02) × DCW（NCYC 2904）。葡萄糖、木糖、乙酸、甲酸、5-HMF 和柠檬酸采用高效液相色谱（LC 2060 C，Shimadzu，日本）定量，使用 Aminex HPX-87H 色谱柱（300 mm × 7.8 mm，8 µm 粒径），配备 RI 和 UV（λ = 210 nm）检测器。柱温维持在 60 °C，硫酸 5 mM 作为流动相，流速 0.7 mL·min⁻¹。微生物油脂用氯仿和甲醇（总体积 2 mL，1:1 v/v）从冻干细胞（10 mg）中提取，并使用磷钒醛比色法 [28] 定量。结果表示为微生物油脂含量（油脂浓度与冻干生物量浓度之比）和微生物油脂浓度（油脂含量乘以培养培养基中生物量浓度计算）。微生物油脂的脂肪酸组成通过脂肪酸甲酯（FAMEs）分析测定 [29]。简言之，脂肪酸用氯仿从冻干细胞（10 mg）中提取，并通过用硫酸酸化的甲醇混合物（85:15，v/v）甲基化转化为 FAMEs。FAMEs 使用配备火焰离子化检测器和 TRACSIL TR-WAX 毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 mm，Teknokroma，西班牙）的 CP-3800 气相色谱仪（Varian Inc.，美国）分析。氦气作为载气，流速 1 mL·min⁻¹。初始柱温 50 °C，维持 2 min，然后以 10 °C·min⁻¹ 升温至 225 °C，最终等温条件维持 10 min。进样器和检测器温度分别为 220 °C 和 250 °C。FAMEs 通过将保留时间与 FAMEs 标准品混合物比较进行鉴定。每种脂肪酸的相对含量（%）定义为其浓度（g·L⁻¹）与样品中分析的所有脂肪酸浓度总和之比。
【数据】OD₆₀₀ 校准：W29 为 0.56 ± 0.04 × DCW，NCYC 2904 为 0.39 ± 0.02 × DCW；HPLC 条件：柱温 60 °C，硫酸 5 mM，流速 0.7 mL·min⁻¹；油脂提取：氯仿/甲醇 1:1，总体积 2 mL，冻干细胞 10 mg；GC 条件：载气氦气 1 mL·min⁻¹，升温程序 50 °C（2 min）→ 225 °C（10 °C·min⁻¹），进样器 220 °C，检测器 250 °C
2.5 产量与摄取速率
生物量产量（YX/S，%）定义为生物量浓度增加与底物浓度减少之比。类似地，油脂产量（YL/S，%）和柠檬酸产量（YCIT/S，%）分别计算为油脂或柠檬酸浓度增加相对于底物消耗的比率。计算生物量、油脂和柠檬酸产量时，葡萄糖、木糖和乙酸为考虑的底物。葡萄糖和木糖摄取速率（g·L⁻¹·h⁻¹）计算为葡萄糖浓度-时间曲线线性区域的斜率。
【数据】产量定义：YX/S = Δ生物量/Δ底物；YL/S = Δ油脂/Δ底物；YCIT/S = Δ柠檬酸/Δ底物；底物：葡萄糖、木糖、乙酸
2.6 统计分析
使用 GraphPad Prism 7 软件（Dotmatics，美国加利福尼亚）进行单因素方差分析（ANOVA）和 Tukey 检验，以确定均值间的显著差异（p < 0.05）。
【数据】统计方法：单因素 ANOVA + Tukey 检验；显著性水平：p < 0.05
研究结果
3.1 批次实验
菌株 W29 的葡萄糖摄取速率不受培养基中糖浓度增加的影响，约为 0.28 g·L⁻¹·h⁻¹（图1a、1c），分别是 NCYC 2904 菌株在 EH-MM（0.18 g·L⁻¹·h⁻¹）和 EH-MM2（0.09 g·L⁻¹·h⁻¹）中值的 1.6 倍和 3.1 倍（图1b、1d）。W29 菌株的木糖同化仅在葡萄糖降至 10 g·L⁻¹ 以下后开始，这与糖转运蛋白的别构竞争和葡萄糖对木糖代谢的抑制一致 [26,30]，而 NCYC 2904 菌株不消耗木糖（图1b、1d），可能是由于培养基中持续较高的葡萄糖水平。W29 菌株在 EH-MM2 中达到的最终生物量高于 EH-MM，尽管生物量/底物产量较低（0.11 g·g⁻¹ 对 0.17 g·g⁻¹）。相反，NCYC 2904 菌株在 EH-MM 中达到更高的最终生物量浓度，这与较高的葡萄糖摄取速率一致。过高的碳源浓度会降低酵母的摄取效率并限制生长 [3]。两种菌株均消耗乙酸（EH-MM 中 32 h，EH-MM2 中 72 h）和 5-HMF（两种培养基中均为 24 h）。甲酸被 W29 更快速同化（两种培养基中均为 48 h），而 NCYC 2904 则需要 96 h（EH-MM）或 120 h（EH-MM2）。油脂积累受培养基浓度强烈影响，W29 菌株尤其明显。糖浓度增加时油脂积累的下降伴随着柠檬酸浓度 2 倍的增加（图1a 和 1c）。在氮限制条件下，Y. lipolytica 可将碳导向油脂和柠檬酸两种产物的生产 [11]，这在葡萄糖 [13]、木质纤维素水解液 [26,31,32]、猪油 [33] 以及甘油和挥发性脂肪酸 [7] 中均有报道。本研究中，NCYC 2904 不产生柠檬酸但达到更高的油脂浓度（表1），证实其更强的内在产油能力 [25,34]。这一结果并不反映该菌株的固有能力缺失，因为 NCYC 2904 已有从甘油 [7] 或橄榄树修剪物水解液 [31] 生产柠檬酸的报道。然而，这些研究在更高的氧传质速率（k L a = 66 h⁻¹）和更高浓度的 CSL（2–2.5 g·L⁻¹）条件下进行，支持了更高的葡萄糖摄取速率（高达 1 g·L⁻¹·h⁻¹）。高底物摄取驱动碳流通过 TCA 循环，导致乙酰-CoA 失衡并产生柠檬酸积累和输出的溢流压力，而 CSL 可通过提供必需微量营养素和生长因子增强柠檬酸生产 [35,36]。本研究中，NCYC 2904 较低的葡萄糖摄取速率阻止了溢流代谢和柠檬酸分泌，将碳重新导向油脂生物合成，与其较高的油脂积累一致。
通过使用 EH-MM 培养基的两种工作体积研究了传质效应，特别是供氧效应。如预期所料，减小工作体积使 k L a 值从 12 h⁻¹ 增加到 24 h⁻¹，这是由于比搅拌功率增加，直接影响 k L a [37]。工作体积的减小导致 Y. lipolytica W29 和 NCYC 2904 生物量浓度（图1e、1f）和生物量/底物产量的提高。在 WV-24% 条件下，糖、乙酸和甲酸的消耗也更快 [34,38]。W29 菌株的柠檬酸产量不受供氧条件影响（图1a、1e），但微生物油脂产量随氧传质增强而提高。W29 实验中获得的最高油脂浓度、生产率和产量在 WV-24% 条件下均高于 WV-57% 条件下的相应值（表1）。对于 NCYC 2904 菌株，油脂含量达到最高值 53%（图1f），导致浓度、产量和生产率提高 2.5 倍。在高供氧条件下 Y. lipolytica 生物量、底物消耗和油脂积累的增加也在葡萄糖 [39]、葡萄糖和挥发性脂肪酸混合物 [34] 以及粗甘油 [40] 中观察到。高浓度溶解氧上调参与油脂合成的酶（即 ATP-柠檬酸裂解酶和苹果酸酶）的活性 [41]。
【数据】W29 葡萄糖摄取速率：0.28 g·L⁻¹·h⁻¹；NCYC 2904 摄取速率：0.18 g·L⁻¹·h⁻¹（EH-MM）/0.09 g·L⁻¹·h⁻¹（EH-MM2）；W29 生物量/底物产量：0.11 g·g⁻¹（EH-MM2）/0.17 g·g⁻¹（EH-MM）；乙酸消耗时间：32 h（EH-MM）/72 h（EH-MM2）；5-HMF 消耗时间：24 h；甲酸消耗时间：W29 48 h，NCYC 2904 96 h（EH-MM）/120 h（EH-MM2）；柠檬酸增加倍数：2 倍；k L a：12 h⁻¹（WV-57%）→24 h⁻¹（WV-24%）；NCYC 2904 最高油脂含量：53%；油脂浓度/产量/生产率提高：2.5 倍
3.2 补料分批实验
解脂耶氏酵母在木质纤维素水解液中以补料分批模式生长和油脂积累的研究少于批次模式。Y. lipolytica W29 以与其添加速率相似的速率消耗糖，导致培养基中残留浓度低（< 3 g·L⁻¹）。然而，补料开始后生物量浓度保持恒定（图2a），表明稀释效应掩盖了较低的生物量生产速率。Poontawee 和 Limtong [24] 发现，在糖浓度低于 5 g·L⁻¹ 时启动补料分批阶段会因营养饥饿导致低细胞质量浓度。NCYC 2904 菌株的生物量产量在补料阶段开始后增加（图2b），这可归因于：（1）NCYC 2904 细胞在补料阶段开始时处于指数生长期，（2）它们未经历营养饥饿。与批次实验一样，由于该菌株固有的低糖摄取速率，观察到葡萄糖和木糖的积累。W29 的油脂生产率和最终油脂质量与 EH-MM 在 WV-24% 下批次培养相当，其中各底物添加的质量相同。NCYC 2904 细胞的油脂含量在整个培养期间保持恒定（图2b），油脂产量与批次培养（EH-MM，WV-24%）相比未增强。这些结果可能归因于补料中的氮补充，将代谢通量导向第 2 阶段的无脂生物量 [42] 并限制油脂积累。向产油酵母供应氮的补料策略对油脂合成有负面影响 [43,44]。W29 补料分批中获得的柠檬酸与批次培养（EH-MM，WV-24%）中达到的水平相当。与批次实验观察一致，NCYC 2904 菌株不产生柠檬酸。本研究中应用的稀释率范围为 0.005 h⁻¹ 至 0.002 h⁻¹，基于 Pereira 等人 [7] 的发现，他们证明了 NCYC 2904 菌株在粗甘油中生长时油脂产量增加。低于 0.06 h⁻¹ 的稀释率通常用于最大化油脂产量，而约 0.01 h⁻¹ 的稀释率被研究用于优化柠檬酸生产 [45]。应用比本研究更高的稀释率可能改善 W29 菌株的柠檬酸产量，而更低的稀释率可能有助于最小化 NCYC 2904 中的糖积累，尽管可能导致油脂生产率下降。
【数据】W29 残留糖浓度：< 3 g·L⁻¹；稀释率范围：0.005–0.002 h⁻¹；NCYC 2904 油脂含量：培养期间恒定；柠檬酸产量：与批次相当
3.3 重复批次实验
重复批次策略通过在含乙酸或挥发性脂肪酸的培养基中最小化迟滞期并去除上一循环的有毒代谢副产物，改善了产油酵母的生物量和油脂产量 [21]。Y. lipolytica W29 的葡萄糖摄取速率在 RB-A 实验的第 2 批中增强（0.61 g·L⁻¹·h⁻¹ 对 0.51 g·L⁻¹·h⁻¹），但在 RB-B 实验的两个批次中相似（0.48 g·L⁻¹·h⁻¹）。总生物量产量和生产率在 RB-A 中较高（分别为 0.23 g·g⁻¹、0.14 g·L⁻¹·h⁻¹），高于 RB-B（分别为 0.16 g·g⁻¹、0.09 g·L⁻¹·h⁻¹），这可能反映了 RB-A 中指数期换液与 RB-B 中稳定期换液的差异。对于 NCYC 2904 菌株，由于两种条件下均在指数期收获，获得了相似的产量（约 0.27 g·g⁻¹）和生产率（约 0.10 g·L⁻¹·h⁻¹）。W29 菌株的油脂积累不受葡萄糖浓度或生长阶段影响（图3a、3c；表1）。NCYC 2904 的油脂产量在细胞收获时的葡萄糖浓度…（原文截断）
【数据】W29 葡萄糖摄取速率（RB-A）：0.61 g·L⁻¹·h⁻¹（第2批）对 0.51 g·L⁻¹·h⁻¹（第1批）；W29 摄取速率（RB-B）：0.48 g·L⁻¹·h⁻¹；RB-A 总生物量产量/生产率：0.23 g·g⁻¹、0.14 g·L⁻¹·h⁻¹；RB-B：0.16 g·g⁻¹、0.09 g·L⁻¹·h⁻¹；NCYC 2904 产量：约 0.27 g·g⁻¹；生产率：约 0.10 g·L⁻¹·h⁻¹
3.4 两级重复批次培养（TSRB）
最高生物量（66 g·L⁻¹）和油脂浓度（25 g·L⁻¹）由 NCYC 2904 在两级重复批次培养中获得，第 1 批 C/N 比为 10，第 2 批 C/N 比为 75。积累的油脂主要由油酸、棕榈油酸和棕榈酸组成，表明其作为生物燃料原料的潜力。
【数据】最高生物量：66 g·L⁻¹；最高油脂浓度：25 g·L⁻¹；C/N 比：第 1 批 10，第 2 批 75；主要脂肪酸：油酸、棕榈油酸、棕榈酸
讨论与解读
本研究证明，解脂耶氏酵母从木质纤维素水解液中生产油脂和柠檬酸的能力受菌株选择和培养策略的强烈影响。NCYC 2904 是油脂生产的最佳候选菌株，W29 则是柠檬酸生产的最佳候选。补料分批和两级重复批次培养显著提高了 NCYC 2904 的油脂浓度，但该菌株最高的生物量和油脂综合产量在两级重复批次操作下获得。W29 菌株在碳源高可用性的批次模式下达到最大柠檬酸产量。油脂谱富含不饱和脂肪酸，与植物油相当，表明解脂耶氏酵母油脂作为可持续生物燃料原料的潜力。将菌株特异性特征与定制培养模式对齐，可显著提高木质纤维素来源培养基中的生物产品产量，支持高效集成生物炼制工艺的开发。
编译者解读：本研究的方法论亮点在于"菌株-模式"匹配思维——同一菌株在不同培养模式下表现迥异，同一模式下不同菌株产物谱截然不同。这种系统比较策略为生物炼制工艺设计提供了可操作的筛选框架。NCYC 2904 在两级重复批次中实现 25 g·L⁻¹ 油脂，提示通过阶段化调控 C/N 比可有效解耦"长菌"与"积油"两个目标。但值得留意的是，模拟培养基与真实水解液之间仍有差距，实际木质纤维素水解液中抑制物的协同效应可能改变菌株表现。未来若能将此筛选框架与动态补料控制策略结合，或可进一步释放解脂耶氏酵母在工业生物炼制中的潜力。
参考来源
Dias B. Exploring lipids and citric acid production by Yarrowia lipolytica in lignocellulosic biomass hydrolysate-mimicking media: Effect of cultivation operation modes. Process Biochemistry, 2025. DOI: 10.1016/j.procbio.2025.09.006
DOI: 10.1016/j.procbio.2025.09.006