来源：β-Glucanase engineering oriented to industrial biorefinery: Database-based directed evolution for thermostability optimization（Biomass and Bioenergy）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质纤维素生物质转化是可持续能源的重要方向，但工业高温条件下多数β-葡聚糖酶催化性能不足，制约了其在生物炼制中的应用。本研究从蛋白质数据库筛选出高活性1,3-1,4-β-葡聚糖酶PcGlu16B，通过定向进化获得热稳定性显著提升的组合突变体N11Y/S209Q（M1），其50°C热半衰期延长157分钟，催化效率提高1.29倍，并与木聚糖酶协同实现玉米芯高效降解。该研究为数据库驱动的酶工程改造提供了可借鉴的策略框架。
研究背景
木质纤维素多糖被公认为成本低廉、可持续的可再生能源来源。β-葡聚糖是由β-1,3和/或β-1,4糖苷键连接的β-D-糖基单元组成的非结构性淀粉多糖，广泛存在于谷物细胞壁中，是半纤维素的关键组分。玉米芯中半纤维素含量达40%–55%，β-葡聚糖与木聚糖交叉连接形成刚性结构，构成生物质降解的主要障碍。
1,3-1,4-β-葡聚糖酶（EC 3.2.1.73）能特异性切割混合连接葡聚糖中的β-1,4糖苷键，是理想的生物催化剂。然而，工业生物质转化过程中的高温、极端pH和金属离子干扰等条件不可避免地抑制酶活性。当温度达到工业加工范围50–70°C时，多数商业β-葡聚糖酶在长时间反应中热稳定性不足，催化效率降至初始活性的20%以下，显著降低生产效率并增加运营成本。合理设计与定向进化是提升热稳定性的常用酶工程策略。
研究方法
2.1 菌株、质粒与化学试剂
大肠杆菌DMT和DH5α感受态细胞购自北京TransGen公司。表达宿主毕赤酵母GS115和质粒pPIC9购自Invitrogen公司（San Diego, CA）。DNA聚合酶（rTaq和FastPfu）、限制性内切酶（EcoRI、NotI和BglII）、T4 DNA连接酶及DNA marker购自北京Tiangen公司。DNA纯化试剂盒、dNTPs（含dTTP和dCTP）及BCA蛋白定量试剂盒购自MBI Fermentas公司（Ottawa, Canada）。玉米芯采集自中国镇江润州区当地农场。大麦β-葡聚糖、地衣多糖和海带多糖等底物购自上海Sangong Biotech公司。商业酶包括酸性蛋白酶（胃蛋白酶）、碱性蛋白酶（α-糜蛋白酶）、中性蛋白酶（Neutrase 0.8 L）、β-葡聚糖酶（CG, Ultraflo）和木聚糖酶（Xyn），均购自上海Yuanye Biotechnology公司。除非另有说明，所用化学试剂均为分析纯。
【数据】菌株：E. coli DMT/DH5α、P. pastoris GS115；质粒：pPIC9；玉米芯来源：镇江润州区；试剂级别：分析纯
2.2 突变文库构建与定点突变
优化后的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因PcGlu16b（登录号：KAF2719924.1）经合成后连接至pPIC9载体的EcoRI和NotI限制性位点，构建重组表达载体pPIC9-PcGlu16b。采用易错PCR构建随机突变文库，引物为PcGlu16b-F（5′- GAGAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTC-3′）和PcGlu16b-R（5′- AAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCTTA-3′）。50 μL反应体系包含：0.5 mM Mn²⁺、5 mM Mg²⁺、1 mM dTTP和dCTP、1 μL模板pPIC9-PcGlu16b、2 U Taq DNA聚合酶及5 μL 10× PCR缓冲液。易错PCR程序如下：95°C预变性5分钟；随后29个循环的95°C变性30秒、55°C退火30秒、72°C延伸1分钟；最后72°C终延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后，PCR产物用凝胶回收试剂盒纯化。纯化DNA经EcoRI/NotI双酶切后连接至pPIC9载体。连接产物转化至E. coli DH5α，在含50 μg/mL氨苄青霉素的5 mL LB培养基中37°C培养16小时。从培养的大肠杆菌细胞中直接提取突变质粒。随后所有质粒经BglII线性化，通过电转化（PIC模式，电压2000 V，脉冲时间5 ms）转入毕赤酵母细胞。其他相关操作细节参照Oriana等人此前的报道[14]。
第二轮定点突变使用Fast Mutagenesis System Kit引入。模板为携带PcGlu16B序列或其随机突变体的全长质粒。PCR扩增后，用DMT酶消化产物，转化至E. coli DH5α。表达质粒的准确性由南京Qingke Biotec公司进行DNA测序确认。
【数据】Mn²⁺浓度：0.5 mM；Mg²⁺浓度：5 mM；dTTP/dCTP：1 mM；Taq酶：2 U；PCR条件：95°C 5min→29×(95°C 30s/55°C 30s/72°C 1min)→72°C 10min；氨苄青霉素：50 μg/mL；电转化：2000 V，5 ms
2.3 β-葡聚糖酶的表达与纯化
序列验证后，BglII线性化的重组质粒通过电穿孔导入毕赤酵母GS115进行β-葡聚糖酶表达。用摇管筛选性能最佳的转化子，随后进行放大发酵。选定的转化子依次培养：首先在20 mL YPD培养基（含1%酵母提取物、2%胰蛋白胨和2%葡萄糖）中于30°C、220 rpm预培养48小时。随后在300 mL BMGY培养基（含1.34% YNB、2%胰蛋白胨、1%甘油和4 mg/mL生物素）中在相同条件下扩大培养。最后在200 mL BMMY培养基（以1%甲醇替代甘油）中进行诱导，48小时表达期内每12小时补加1%甲醇。处理后的培养上清通过离心（12,000×g，4°C，10分钟）收集，然后用VivaFlow 200膜（截留分子量10 kDa）浓缩。随后在4°C下对10 mM Na₂HPO₄-柠檬酸（McIlvaine）缓冲液（pH 6.5）透析12小时。粗提物通过快速蛋白液相色谱（FPLC）在预先用缓冲液A（10 mM Na₂HPO₄-柠檬酸，pH 6.5）平衡的HiTrap Q Sepharose XL柱上纯化。结合蛋白用缓冲液A中0–1.0 M的线性NaCl梯度洗脱。活性β-葡聚糖酶组分合并后经Amicon PL-10离心超滤（4000×g，40分钟，4°C）进行缓冲液置换和浓缩。最终结构确认由中国农业科学院蜜蜂研究所的LC/ESI-TOF-MS完成。蛋白质纯度通过SDS-PAGE分析验证，使用5%浓缩胶和12%分离胶。蛋白质浓度按照Bradford法测定，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准蛋白[15]。
【数据】YPD培养基：1%酵母提取物/2%胰蛋白胨/2%葡萄糖；BMGY：1.34% YNB/2%胰蛋白胨/1%甘油/4 mg/mL生物素；BMMY：1%甲醇替代甘油；离心：12,000×g，4°C，10min；透析：pH 6.5，4°C，12h；NaCl梯度：0–1.0 M；超滤：4000×g，40min，4°C
2.4 酶活性测定
以D-葡萄糖为标准，β-葡聚糖酶活性通过3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定[16]。一个β-葡聚糖酶活性单位（U）定义为在标准条件（pH 4.0，50°C）下10分钟内产生1 μmol还原糖所需的酶量。标准反应体系含900 μL底物溶液（5 mg/mL大麦β-葡聚糖、地衣多糖或海带多糖溶于McIlvaine缓冲液）和100 μL酶溶液（0.05 mg/mL）。在标准条件下孵育10分钟后，加入1.5 mL DNS试剂并煮沸5分钟终止反应。动力学参数（K_m、V_max和k_cat）测定在相同标准条件（pH 4.0，50°C）下进行5分钟反应，使用100 μL酶液（0.05 mg/mL）和900 μL不同浓度（0.25–5.0 mg/mL）的底物。米氏方程通过GraphPad Prism 5.01（San Diego, CA）中的Lineweaver-Burk方法拟合数据，计算K_m、V_max和k_cat。所有测定均设三次重复及适当对照。
【数据】底物浓度：5 mg/mL；酶浓度：0.05 mg/mL；反应条件：pH 4.0，50°C，10min；动力学底物浓度范围：0.25–5.0 mg/mL；DNS法；三次重复
2.5 酶的pH-活性和热学特性
β-葡聚糖酶的pH谱使用甘氨酸-HCl缓冲液（pH 1.0–2.5，0.1 M）、McIlvaine缓冲液（pH 2.5–8.0，0.2 M）和甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 8.0–11.0，0.1 M）评估。最适pH范围（1.0–7.0）通过在50°C下10分钟测定确定。pH稳定性（1.0–12.0范围）通过将酶在37°C预孵育1小时，然后在标准条件下测定残余活性来评估。
热学特性用四个关键指标表征。最适温度（T_max）通过在pH 4.0、30–80°C温度范围内测定酶活性确定，每5°C为一个梯度，每个温度点测定10分钟。50°C热稳定性通过将酶在无底物条件下孵育，每10分钟取样一次，持续300分钟。每个等分样品立即在冰上冷却30分钟后再测定残余活性。半衰期（t_1/2）定量时，初始活性设为100%，残余活性随时间变化拟合一级衰变模型y = A·e⁻ᵏᵗ，其中A为初始活性，k为失活速率常数，t为时间。t_1/2按ln2/k计算[17]。此外，T_50值（定义为孵育30分钟后引起50%活性丧失的温度）在45–75°C范围内测定。热变性中点（T_m）也进行了测定。为评估T_50，酶在逐渐升高的温度下预热30分钟，然后在标准条件下评估其反应活性。T_m值通过差示扫描量热法（DSC）获得。酶溶液（250 μg/mL溶于0.01 M McIlvaine缓冲液，pH 4.0）以1°C/min的速率从20°C加热至60°C。
【数据】pH范围：1.0–12.0；pH稳定性孵育：37°C，1h；T_max测定：pH 4.0，30–80°C，5°C梯度，10min/点；热失活取样：50°C，10min间隔，300min；T_50范围：45–75°C，30min；DSC：250 μg/mL，1°C/min，20→60°C
研究结果
3.1 基于数据库的PcGlu16B筛选表达及其突变体筛选
为从蛋白质数据库中挖掘潜在的β-葡聚糖酶作为研究材料，我们以目前报道的比活性最高（以大麦葡聚糖为底物超过50,000 U/mg）的β-葡聚糖酶BisGlu16B_ΔC[26]的基因参考序列为模板。该优化β-葡聚糖酶是本团队此前通过去除Bispora sp. MEY-1 BisGlu16B（登录号：KXL51537）冗余C端区域（127个氨基酸）获得的。具体而言，以BisGlu16B_ΔC的氨基酸序列为模板进行BLASTp比对，根据相似度选择未报道表达的潜在β-葡聚糖酶基因（见表S2）。在2 mL体系体积的甲醇诱导下，所有选出的β-葡聚糖酶中，来自P. citri的PcGlu16B表现出令人瞩目的活性（35.3 ± 2.7 U/mL），仅次于BisGlu16B_ΔC。因此，新表达的PcGlu16B被选作进一步研究材料。
随机突变后，共4800个可行酵母单克隆突变体通过96孔板培养检测法筛选。突变体N11Y、S209Q和G228P在热稳定性和酶活性方面均较野生型PcGlu16B（WT）显著提升。如图1所示，在96孔板培养基中经60°C处理30分钟后，这些突变体的残余活性分别为3,300、4,900和4,100 U/mg，较WT基线活性1,200 U/mg分别提高了175%、310%和242%。
在测序鉴定的单点突变模式基础上，进一步构建了四个组合突变体：N11Y/S209Q（M1）、N11Y/G228P（M2）、S209Q/G228P（M3）和N11Y/S209Q/G228P（M4）。热挑战测试显示，在相同条件下，各突变体处理后的活性分别为11,700、4,400、6,100和3,600 U/mg，其中突变体M1表现最优。基于这些发现，选择三个主要单点突变体（N11Y、S209Q和G228P）及最优组合突变体M1进行进一步的实验表征，因为它们共同展现了在热耐受性和催化效率方面最显著的提升。
SDS-PAGE分析表明，WT及其四个突变体（N11Y、S209Q、G228P和M1）的表观分子量均约为40 kDa，超过其理论分子量（36.1 kDa）（图S1）。这种一致的电泳迁移率偏移提示可能存在N-或O-糖基化等翻译后修饰，这是1,3-1,4-β-葡聚糖酶中已有充分文献记载的现象[27,28]。随后的LC/ESI-MS/MS分析显示，WT和所有突变体样品的每个样品均匹配到两个肽段，与β-葡聚糖酶经Endoproteinase Glu-C（Promega, USA）消化产生的理论切割产物精确对应。值得注意的是，所有样品中均未检测到不匹配肽段（图S2），证实不存在非特异性蛋白水解降解或污染蛋白。实验数据与理论预测在所有测试变体中的一致性验证了野生型和突变酶的结构完整性，同时强化了保守翻译后修饰的假说。
【数据】PcGlu16B活性：35.3 ± 2.7 U/mL；筛选突变体数：4800；60°C/30min残余活性：N11Y 3,300 U/mg（+175%）、S209Q 4,900 U/mg（+310%）、G228P 4,100 U/mg（+242%）、WT 1,200 U/mg；组合突变体活性：M1 11,700、M2 4,400、M3 6,100、M4 3,600 U/mg；分子量：~40 kDa（理论36.1 kDa）
3.2 WT及其突变体的pH依赖性活性谱
图2A显示，所有测试酶具有相似的pH-活性谱，以酸性条件下的催化效率为主，这与来自Penicillium occitanis[29]、Aspergillus japonicus[30]和Talaromyces emersonii[31]的典型真菌β-葡聚糖酶特征一致。WT、N11Y、G228P和M1突变体的最适pH为4.0，而突变体S209Q的最适pH略微偏移至4.5。值得注意的是，在pH 5.5时，N11Y（71%）、S209Q（73%）和M1（72%）的相对活性超过WT基线（40%）1.8倍以上，G228P（69%）达到1.7倍提升。组合突变体M1展现出最宽的操作范围，在pH 2.5–6.0范围内保持>40%的相对活性，优于WT和所有单点突变体。
在37°C、pH 1.0–12.0范围孵育1小时后的稳定性评估显示，M1具有优越的pH耐受性，尤其在碱性条件下，其保留了83%（pH 9.0）和32%（pH 10.0）的残余活性，较WT的32%和9%分别提高了159%和256%（图2B）。这种增强的pH适应性使突变体M1成为在pH波动条件下需要稳定性的多种工业过程中的稳健生物催化剂。
【数据】最适pH：WT/N11Y/G228P/M1为4.0，S209Q为4.5；pH 5.5相对活性：N11Y 71%、S209Q 73%、M1 72%、G228P 69%、WT 40%；pH 9.0残余活性：M1 83% vs WT 32%；pH 10.0残余活性：M1 32% vs WT 9%
3.3 WT及其突变体的温度最适与热稳定性研究
WT及其突变体的热活性谱通过pH 4.0、30–80°C梯度下的T_max测定表征。如图2C所示，S209Q、G228P和M1突变体表现出相同的T_max值（55°C），较WT和突变体N11Y（50°C）提高了5°C。四个突变体表现出渐进式的耐热性提升，其中组合突变体M1展现出优越的热适应性。在70°C和75°C时，突变体M1达到51%和45%的相对活性，较WT（3%和2%）分别提高了16倍和21.5倍，同时在这些温度下优于单点突变体0.6–4.7倍和1.4–10.3倍。值得注意的是，突变体M1在80°C时仍保留15%的残余活性，而该温度导致其他变体完全失活，证实了其由协同突变效应产生的独特热稳定化机制。
β-葡聚糖酶的热稳定性通过在50°C无底物条件下测定不同时长的半衰期（t_1/2）来评估。基于一级热失活模型，半衰期按公式t_1/2 = ln2/k计算。如图2D所示，WT及其四个突变体（N11Y、S209Q、G228P和M1）的t_1/2值分别为75、158、204、183和232分钟。与WT相比，突变体N11Y、S209Q和G228P的热稳定性增强，t_1/2分别增加约1.1倍、1.7倍和1.4倍。M1变体表现出最大的提升，其t_1/2在50°C下增加了2.1倍。
为确定T_50值，WT及其突变体在45–75°C的特定温度范围内孵育30分钟（图2E）。WT的T_50仅为55°C，而突变体M1显著提高了9°C，达到64°C。三个单点突变体（N11Y、S209Q和G228P）分别增加了2、5和3°C。在70°C孵育30分钟后，野生型（WT）酶活性急剧丧失，仅保留初始活性的2%（340 ± 19 U/mg）。相比之下，M1突变体保留了初始活性的43%以上（6020 ± 311 U/mg），表现出显著改善的耐热性，更适合生物质降解应用。
组合突变体M1的最适活性温度为55°C，超过多种Bacillus属的β-1,3-1,4-葡聚糖酶，包括B. subtilis MA139（40°C）[32]、B. tequilensis CGX5-1（45°C）[33]、B. sp. SJ-10（50°C）[34]和B. amyloliquefaciens ATCC 23350（50°C）[35]，但略低于来自B. altitudinis YC-9（65°C）[36]和B. licheniformis UEB CF（70°C）[37]的嗜热变体。值得注意的是，M1展现出无与伦比的热稳定性——50°C下2小时后残余活性>90%，60°C下30分钟保留83%，70°C下30分钟保留43%活性，显著超过已报道的基准值。相比之下，B. licheniformis UEB CF在50°C（55分钟）和60°C（10分钟）时仅保留约50%的活性。
【数据】T_max：S209Q/G228P/M1为55°C，WT/N11Y为50°C；70°C相对活性：M1 51% vs WT 3%（16倍）；75°C：M1 45% vs WT 2%（21.5倍）；80°C：M1 15%；t_1/2（50°C）：WT 75、N11Y 158、S209Q 204、G228P 183、M1 232 min；T_50：WT 55°C、M1 64°C（+9°C）；70°C/30min残余活性：WT 340±19 U/mg（2%）、M1 6020±311 U/mg（43%）
3.4 分子动力学模拟分析
3.5 圆二色光谱分析
3.6 催化效率提升机制分析
3.7 蛋白酶、金属离子及化学试剂抗性
3.8 玉米芯酶解糖化应用
讨论与解读
本研究成功从NCBI蛋白质数据库的基因信息中表达了来自Polychaeton citri CBS 116435的高活性多功能GH16家族1,3-1,4-β-葡聚糖酶PcGlu16B。在缺乏解析晶体结构的情况下，通过定向进化显著提升了该葡聚糖酶的催化性能。优势突变体N11Y/S209Q的50°C半衰期延长了2小时以上，催化效率提高1.29倍（4000 vs. 3100 mL s⁻¹ mg⁻¹）。同时，其对蛋白酶和化学试剂的抗性也得到不同程度的提升。
分子动力学模拟揭示，热稳定性突变N11Y和S209Q增加了氢键和盐桥数量，这解释了RMSD和ΔΔG值所显示的局部刚性增强。与此同时，远离催化活性中心的突变位点避免了催化效率的损失——相反，结果表明底物结合通道附近的环区微小变化可能增强了底物亲和力。在实际应用中，N11Y/S209Q突变体与木聚糖酶及碱性预处理联用时，对玉米芯表现出有效的协同降解作用，为生物质转化提供了更高效的策略。
编译者解读：该研究的核心亮点在于"数据库挖掘+定向进化"的联合策略——以已知高活性酶为模板进行BLASTp同源搜索，直接锁定未经表达验证的新酶基因，显著缩短了从序列到功能验证的周期。M1突变体在50°C下半衰期达232分钟且催化效率同步提升，打破了热稳定性改造常伴随活性下降的常规权衡。值得注意的是，突变位点远离催化中心却通过远程调控改善底物通道的亲和力，这为"非活性中心突变"的理性设计提供了实证支撑。从工业应用看，M1与木聚糖酶在碱性预处理条件下的协同因子达2.1，意味着多酶复配策略在真实生物质底物上的潜力值得进一步挖掘。局限在于，该研究尚未涉及连续流反应器或高固含率等更贴近工业实际场景的验证。
参考来源
Zhu X-L. β-Glucanase engineering oriented to industrial biorefinery: Database-based directed evolution for thermostability optimization. Biomass and Bioenergy, 2026. DOI: 10.1016/j.biombioe.2025.108788
DOI: 10.1016/j.biombioe.2025.108788