来源：Continuous directed evolution of isoflavone synthase to mitigate feedback inhibition: combine use of a novel developed bacteria-based biosensor and high-throughput droplet sorting（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
异黄酮合酶（IFS）催化(2S)-柚皮素生成金雀异黄酮，但其活性受产物金雀异黄酮的反馈抑制，成为微生物合成的主要瓶颈。本研究基于大豆慢生根瘤菌转录因子FrrA构建了金雀异黄酮特异性生物传感器，将其与液滴微流控分选及脱氨酶-T7 RNA聚合酶融合介导的连续进化系统偶联，成功筛选出反馈抑制抗性突变体TpIFSM6。该突变体产物抑制常数提高6.6倍，金雀异黄酮产量达野生型的3.1倍。
研究背景
金雀异黄酮是豆科植物中主要的异黄酮成分，与其前体(2S)-柚皮素相比具有独特的雌激素活性，在缓解氧化应激、更年期综合征、心血管疾病、骨质疏松及某些癌症方面展现出治疗潜力。传统植物提取受限于漫长的种植周期、严格的农艺要求和低自然丰度；微生物生物合成则提供了一种产量更高、生产周期更短、环境限制更少的可持续替代方案。
金雀异黄酮的生物合成由细胞色素P450酶——异黄酮合酶（IFS）催化完成。然而，IFS活性受其产物金雀异黄酮的反馈抑制，这是防止代谢物过度积累的常见机制。在微生物宿主中，这种反馈回路构成主要的生产瓶颈——积累的金雀异黄酮抑制IFS活性，导致产量下降。此前研究已证实这种直接抑制效应，并将其确定为高效金雀异黄酮生物合成的关键障碍。
研究方法
2.1 化学试剂
大肠杆菌DH5α用于质粒克隆，大肠杆菌BL21(DE3)及其衍生菌株作为表达宿主。微生物培养使用Luria-Bertani（LB）培养基。培养基中的氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、壮观霉素、L-阿拉伯糖、异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和鼠李糖均购自生工生物（上海）。所有基因操作按T4 DNA连接酶、限制性内切酶、高保真DNA聚合酶、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒和一步克隆试剂盒（Yeasen，上海）的说明书进行。分析标准品和发酵底物(2S)-柚皮素均购自Tansoole（上海）。
【数据】菌株：E. coli DH5α、BL21(DE3)；培养基：LB；试剂来源：生工生物、Yeasen、Tansoole
2.2 质粒构建
本研究所用质粒和引物详细信息见补充材料，所有引物由生工（上海）合成。来自红车轴草的密码子优化基因TpIFS（登录号AY253284）和来自长春花的CrCPR（登录号X69791），分别编码异黄酮合酶和细胞色素P450还原酶（CPR），此前已合成并保存于实验室。含有frrA调控因子（登录号WP_038966858）、J23X启动子（PJ23111、PJ23104、PJ23100和PJ23119）、金雀异黄酮响应启动子PfreC以及egfp的基因簇由生工（上海）合成。细菌人工染色体载体pBeloBac11购自NEB（Ipswich, MA, USA）。
为避免与pTARA-MutaT7GDE1携带的氯霉素抗性基因相互干扰，使用引物对pf_BAC/pr_BAC线性化pBeloBac11，同时用引物pf_KanR/pr_KanR扩增KanR cassette，随后通过一步克隆试剂盒连接生成pBeloBAC11-KanR。从先前构建的质粒pACYC-t7_IFS-trc_CPR中扩增含启动子序列的片段（引物pf_IFS-CPR/pr_IFS-CPR），克隆至PCR线性化的pBeloBAC11-KanR中，获得最终构建体BAC-t7-TpIFS-trc_CrCPR。
为构建金雀异黄酮生物传感器，用EcoNI和PacI双酶切pETDuet-1。获得的DNA片段与frrA（由J23111启动子驱动）和egfp（由FrrA调控的启动子PfreC、PlacUV5_Gen1、PlacUV5_Gen2、PlacUV5_Gen3和PlacUV5_Gen4驱动）组装，生成一系列报告质粒，命名为Reporter_freC、Reporter_lacUV5_Gen1、Reporter_lacUV5_Gen2、Reporter_lacUV5_Gen3和Reporter_lacUV5_Gen4。为优化frrA表达，将J23111启动子替换为PJ23104、PJ23100和PJ23119，分别生成质粒Reporter_104、Reporter_100和Reporter_119。
【数据】限制酶：EcoNI、PacI；启动子：PJ23111、PJ23104、PJ23100、PJ23119；载体：pBeloBac11、pETDuet-1
2.3 大肠杆菌菌株构建
本研究使用菌株的详细信息见补充材料。使用CHOPCHOP（https://chopchop.cbu.uib.no/）鉴定并优先选择靶向E. coli BL21(DE3)遗传背景中ung位点的特异性sgRNA。ung的上下游同源臂分别用ung_up和ung_down引物对从E. coli BL21(DE3)基因组DNA扩增，并通过重叠延伸PCR融合生成ung敲除的同源臂片段。随后按照参考文献所述方法，通过CRISPR/Cas9介导的基因 disruption 删除ung基因。
【数据】靶基因：ung；工具：CHOPCHOP、CRISPR/Cas9；方法：重叠延伸PCR
2.4 培养条件
用于蛋白纯化的菌株在LB培养基中培养。过夜预培养先在5 mL LB培养基中、37°C、200 rpm振荡条件下进行。主培养以初始OD600为0.1接种至25 mL新鲜LB培养基。当OD600达到0.5时，加入IPTG至终浓度0.5 mM诱导蛋白表达，温度降至30°C。
金雀异黄酮生产菌株的发酵使用MOPS极限培养基。过夜种子培养物以初始OD600为0.2接种至25 mL含25 g/L甘油的MOPS极限培养基。当培养物OD600达到1.2时，温度降至30°C。随后加入IPTG（终浓度0.5 mM）和TpIFS底物(2S)-柚皮素，诱导异源基因表达并启动反应。
【数据】预培养：5 mL LB、37°C、200 rpm；主培养：初始OD600 0.1、25 mL LB；诱导：OD600 0.5时加IPTG 0.5 mM、30°C；发酵：MOPS培养基、25 g/L甘油、初始OD600 0.2、OD600 1.2时降温至30°C、IPTG 0.5 mM
2.5 SDS-PAGE分析
表达TpIFS和CrCPR（含或不含N端8RP修饰）的菌株用0.5 mM IPTG在30°C诱导5小时。细菌培养物归一化至OD600为1，取2 mL样品等分至两个离心管中。12,000 rpm离心2分钟后弃上清，细胞沉淀重悬于500 μL Tris-HCl缓冲液（0.2 M，pH 6.8）。一份细胞悬液进行超声破碎15分钟（300 W，工作5秒停10秒），随后12,000 rpm、4°C离心5分钟。分别收集全细胞悬液和可溶性上清的样品（100 μL），与等体积上样缓冲液混合，100°C加热5分钟。蛋白样品在12%预制聚丙烯酰胺凝胶（Yeasen，上海）上分离。使用ImageJ（v1.6.0）对蛋白条带进行光密度分析。
【数据】诱导：0.5 mM IPTG、30°C、5 h；离心：12,000 rpm、2 min；超声：300 W、15 min、5 s开/10 s关；凝胶：12%预制胶
2.6 金雀异黄酮介导的IFS活性抑制评估
TpIFS和CrCPR无细胞裂解液按先前描述的方法制备。裂解液在含100 mg/L (2S)-柚皮素、0.5 mM EDTA和不同浓度金雀异黄酮（0、0.005、0.05或0.5 mM）的缓冲液（25 mM Tris-HCl，pH 7.4）中孵育；对照孵育不含金雀异黄酮。通过每反应加入0.25 U葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Sigma-Aldrich）和1 mM葡萄糖-6-磷酸维持NADPH再生。加入0.2 mM NADPH启动反应。反应组分和产物随后通过高效液相色谱（HPLC）定量。
【数据】底物：100 mg/L (2S)-柚皮素；EDTA：0.5 mM；金雀异黄酮：0、0.005、0.05、0.5 mM；缓冲液：25 mM Tris-HCl pH 7.4；G6PDH：0.25 U/反应；G6P：1 mM；NADPH：0.2 mM
2.7 蛋白纯化
为便于亲和纯化，在TpIFSWT和TpIFSM6的C端融合6×His标签。细胞裂解液在12,000 × g、4°C离心20分钟。随后使用HisSep Ni-NTA色谱柱（Yeasen，上海）按制造商说明书纯化多酶组装体的组成酶。蛋白浓度通过测定280 nm吸光度确定。最后，纯化蛋白分装并在含40%甘油的缓冲液中于−80°C保存。
【数据】离心：12,000 × g、4°C、20 min；纯化：HisSep Ni-NTA柱；保存：−80°C、40%甘油
2.8 酶动力学参数
TpIFS活性测定在25 mM PBS（pH = 7.2）中进行，反应体系含200 μM (2S)-柚皮素、0.1%（v/v）Triton X-100、2 mM NADPH、0.5 mM还原型谷胱甘肽、10 μM血红素、2 μM TpIFS和4 μM CrCPR。30°C孵育10分钟后，反应产物用乙酸乙酯萃取，HPLC分析定量金雀异黄酮含量。比活性根据HPLC峰面积使用金雀异黄酮已知浓度标准曲线计算。反馈抑制通过在反应体系中加入5至500 μM浓度范围的金雀异黄酮进行评估。金雀异黄酮对TpIFS的产物抑制常数（Ki）通过将数据拟合至方程(1)确定：
V₀ = Vmax × [S] / (KM(1 + [P]/Ki) + [S]) (1)
其中V₀为初始反应速率，Vmax为最大反应速率，KM为米氏常数，[S]为底物浓度，[P]为产物（抑制剂）浓度，Ki为产物抑制常数。
【数据】缓冲液：25 mM PBS pH 7.2；底物：200 μM (2S)-柚皮素；Triton X-100：0.1% (v/v)；NADPH：2 mM；GSH：0.5 mM；血红素：10 μM；TpIFS：2 μM；CrCPR：4 μM；孵育：30°C、10 min；抑制浓度范围：5–500 μM
研究结果
3.1 金雀异黄酮介导的TpIFS非竞争性抑制
为构建从前体(2S)-柚皮素到金雀异黄酮的生物合成途径，选择了来自红车轴草的TpIFS和来自长春花的细胞色素P450还原酶（CrCPR），这两者此前已被证明在大肠杆菌中具有高活性。(2S)-柚皮素经IFS催化的2-羟基化和芳基迁移，生成不稳定的中间体2,4′,5,7-四羟基黄烷酮，随后在大肠杆菌中自发脱水产生金雀异黄酮（图2A）。在催化循环中，IFS需要CPR提供NADPH来源的电子。
为实现TpIFS和CrCPR在大肠杆菌中的功能性表达，将疏水性N端残基替换为牛源八肽（8RP，MALLLAVF）以增强溶解度。对可溶性TpIFS和CrCPR比例的SDS-PAGE分析证实，8RP N端修饰提高了目标蛋白的溶解度（见补充材料）。将编码优化N端结构域的TpIFS和CrCPR的质粒转化至E. coli BL21(DE3)制备无细胞裂解液，消除底物和金雀异黄酮跨膜转运的干扰。无细胞裂解液催化系统的HPLC分析确认了金雀异黄酮的产生（见补充材料）。
为评估金雀异黄酮对IFS活性的影响，将含TpIFS和CrCPR的无细胞裂解液与100 mg/L (2S)-柚皮素及递增浓度的金雀异黄酮共孵育（图2B）。在0.005 mM金雀异黄酮存在下，底物消耗降低19.7%，表明即使在低浓度下IFS的转化效率也受到显著损害。
为研究金雀异黄酮对TpIFS的抑制动力学，在0–100 μM金雀异黄酮存在下进行酶动力学测定。KM值恒定而Vmax值逐渐降低，表明金雀异黄酮是TpIFS的非竞争性抑制剂（图2C）。曲线拟合分析确定金雀异黄酮对TpIFS的抑制常数（Ki）为54.6 μM。
【数据】底物消耗降低：0.005 mM金雀异黄酮时19.7%；抑制类型：非竞争性；Ki：54.6 μM；金雀异黄酮浓度范围：0–100 μM
3.2 建立途径适配的生物传感系统
具有宽动态范围的高灵敏度生物传感器对于高通量酶筛选至关重要。为实现TpIFS反馈抗性突变体的高通量筛选，基于FrrA设计了一种金雀异黄酮检测生物传感器。FrrA是大豆慢生根瘤菌中响应异黄酮的调控因子。FrrA是TetR型调控因子，结合freC启动子的operator A和operator B，抑制下游基因转录。金雀异黄酮作为FrrA的特异性配体，诱导freC启动子驱动的下游基因表达。
在该生物传感器系统的构建中，frrA置于组成型启动子PJ23111控制下，freC启动子控制增强型绿色荧光蛋白基因egfp的表达，生成金雀异黄酮检测质粒Reporter_freC（图3A）。为评估初始传感器构建体，将携带Reporter_freC的E. coli BL21(DE3)在含50 mg/L金雀异黄酮的培养基中培养。然而，无论是否存在金雀异黄酮，均未检测到GFP荧光（图3C）。
序列分析显示，freC启动子的−10元件与大肠杆菌共有序列存在显著偏差（图3B）。此外，operator A与−10元件的重叠可能阻碍启动子活性。为解决这一问题，将freC操纵子与广泛使用的lacUV5启动子融合构建杂合启动子。鉴于FrrA对operator A的亲和力高于operator B，将lacUV5中的lac操纵子替换为operator A基序，生成lacUV5_Gen1（图3B）。该构建体在金雀异黄酮诱导后产生可检测的荧光（图3C）。
为进一步增强信号强度，将−35基序替换为高亲和力共有序列“TTGACA”，生成lacUV5_Gen2。该变体虽显著增加了诱导荧光，但也表现出高背景泄漏（图3B）。强启动子通常需要更严格的阻遏以防止泄漏。在lac操纵子模型中，阻遏通过LacI二聚体结合近端（+11）和远端（−44）操纵子形成的DNA环化而增强。模拟这一机制，在lacUV5_Gen2的−44位置引入额外的operator B或A，分别生成lacUV5_Gen3和lacUV5_Gen4（图3B）。两种变体均有效降低了背景泄漏；但Reporter_lacUV5_Gen4的诱导水平显著受损。因此，选择Reporter_lacUV5_Gen3用于后续研究（图3C）。
为验证生物传感器对产物与底物的特异性区分，评估了其对金雀异黄酮和(2S)-柚皮素的响应。携带Reporter_lacUV5_Gen3的菌株仅在金雀异黄酮存在时表现出显著荧光，而(2S)-柚皮素引发的信号可忽略不计（图3D）。与FrrA已知的特异性一致，这些发现表明该传感器有效减少了底物来源的假阳性，是筛选TpIFS活性的理想工具。
对大多数应用而言，生物传感器不仅要检测目标分子的存在，还要定量其浓度。在高通量筛选中，浓度之间的明确信号分离对高效下游分选至关重要。为评估优化后传感器的分辨率，表征了其对递增金雀异黄酮水平的响应。使用GraphPad Prism 8对荧光数据进行曲线拟合，结果显示Reporter_lacUV5_Gen3的半最大效应浓度（EC50）仅为20.75 mg/L（图3E）。
关键问题在于，筛选反馈抗性TpIFS突变体需要在培养基中补充低浓度金雀异黄酮以施加反馈压力。Reporter_lacUV5_Gen3在基线（如20 mg/L）和升高水平（如50 mg/L）之间的信号分辨率不足，可能影响突变体筛选效率。为减轻筛选所需低浓度金雀异黄酮引起的背景干扰，通过改变FrrA表达水平调节传感器的响应阈值。基于Reporter_111骨架构建了四种传感器变体，使用强度递增的组成型启动子（PJ23104 < PJ23100 < PJ23119）驱动frrA转录（图3F）。这些启动子的相对强度已使用GFP报告基因验证（见补充材料）。
动力学分析表明，0.05 mM（约13.5 mg/L）金雀异黄酮接近TpIFS反馈抑制的IC50（图2A）。据此，15 mg/L被确定为筛选反馈抗性突变体的基线浓度。如预期所料，增加FrrA表达提高了诱导阈值。弱启动子PJ23104导致信号调节不良，而较强启动子PJ23100和PJ23119有效抑制了15 mg/L时的“背景”荧光（图3F）。最终选择Reporter_100进行组装，因为其在基线严格阻遏和高浓度强诱导之间提供了最佳平衡。重要的是，荧光数据的曲线拟合分析显示，该变体的EC50升至49.31 mg/L（图3G），证明其阈值升高，适用于TpIFS突变体文库的精准筛选。
【数据】初始传感器：50 mg/L金雀异黄酮无荧光；EC50（Gen3）：20.75 mg/L；IC50参考：0.05 mM（约13.5 mg/L）；筛选基线：15 mg/L；EC50（Reporter_100）：49.31 mg/L
3.3 液滴中金雀异黄酮检测的表征
为验证生物传感器在液滴微流控体系中的适用性，对液滴内金雀异黄酮检测性能进行了表征。
【数据】原文未详述液滴表征的具体数值参数
3.4 体内连续定向进化与TpIFS变体筛选
将生物传感器与液滴微流控分选偶联，对脱氨酶-T7 RNA聚合酶融合介导的连续进化产生的高质量TpIFS突变体文库进行筛选。
【数据】原文未详述筛选的具体数值参数
3.5 TpIFSM6的结构与功能表征
通过筛选获得反馈抗性突变体TpIFSM6。抑制动力学分析显示其产物抑制常数显著提高。等温滴定量热法（ITC）测定了金雀异黄酮与TpIFSWT和TpIFSM6的解离常数（Kd）。分子对接分析揭示了金雀异黄酮的结合模式。分子动力学模拟证实，I187R和F303A突变阻止了抑制剂诱导的催化I-螺旋构象位移。
【数据】抑制常数提高倍数：6.6倍（摘要）；结合亲和力降低：3.8倍；金雀异黄酮产量：野生型的3.1倍
讨论与解读
本研究构建了生物传感器辅助的连续定向进化平台，成功克服了异黄酮生物合成中反馈抑制这一关键瓶颈。核心创新在于将体内诱变与金雀异黄酮响应生物传感器整合，将金雀异黄酮浓度转化为正相关的荧光信号，结合皮升级液滴微流控分选，实现了超高通量筛选。生物传感器在低金雀异黄酮浓度下最小化的荧光背景显著提高了筛选效率。获得的突变体TpIFSM6产物抑制常数提高7.6倍，抑制剂亲和力降低3.8倍。分子动力学模拟证实，I187R和F303A突变通过阻止抑制剂诱导的催化I-螺旋位移赋予抗性。
编译者解读
该研究展示了合成生物学中“传感器-进化-筛选”闭环策略的典型范例。将细菌转录因子FrrA改造为适配大肠杆菌表达系统的生物传感器，并巧妙利用启动子工程解决背景泄漏与响应阈值之间的矛盾，体现了精细的调控元件设计思维。液滴微流控与连续诱变系统的偶联使超高通量筛选成为可能，为其他植物天然产物生物合成途径中类似反馈抑制问题的解决提供了可推广的技术范式。值得注意的是，突变体TpIFSM6的反馈抗性机制通过分子动力学模拟得到了结构性解释，这种从表型筛选到机制验证的完整闭环值得借鉴。后续研究可进一步探索该策略在更大规模突变体文库及其他P450酶系中的应用潜力。
参考来源
Wang Z. Continuous directed evolution of isoflavone synthase to mitigate feedback inhibition: combine use of a novel developed bacteria-based biosensor and high-throughput droplet sorting. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134319
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134319