构建解脂耶氏酵母细胞工厂

来源：Building a yeast cell factory for green biomanufacturing of (R)-(+)-γ-decalactone: A natural peach-like aroma compound（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

(R)-(+)-γ-癸内酯（GDL）是一种具有浓郁桃香特征的光学纯十碳内酯，在食品、化妆品和制药行业具有重要应用价值。植物提取效率低下，化学合成则产生缺乏天然香气特性的外消旋混合物。本研究以产油酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）为底盘，以蓖麻油为底物，通过系统代谢工程改造——包括β-氧化途径重构、前体工程、过氧化物酶体工程以及异源表达桃来源的醇酰基转移酶基因——在5-L生物反应器中实现了4538.5 mg/L的GDL产量，较原始菌株提高21.9倍。

研究背景

GDL是含五元内酯环的光学纯十碳化合物，具有强烈的桃香和椰香特征，天然存在于多种水果及乳制品中，被国际公认为安全的食品和医药添加剂。其感官特性和生物活性受立体化学强烈影响——(R)-对映体赋予桃香，而(S)-对映体与椰香相关。自然界中(R)-对映体占主导地位，感官品质优于(S)-对映体。食品工业中，GDL广泛用作天然食品香料，为冰淇淋、酸奶、烘焙食品、糖果和饮料赋予浓郁果香和奶油风味；在化妆品和香精领域，GDL凭借持久香气和良好挥发性成为香精配方的核心组分。香料市场预计从2020年的158.5亿美元增长至2027年的202.7亿美元，复合年增长率4.5%。传统植物提取效率低下，化学合成则产生外消旋混合物。本研究提出利用产油酵母解脂耶氏酵母以蓖麻油为底物生物合成天然GDL的 biotechnology 方法。

研究方法

2.1 培养条件

大肠杆菌菌株在添加100 mg/L氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）培养基中培养，培养温度维持在37°C，搅拌转速250 rpm。用于酵母尿嘧啶筛选的培养基为不含尿嘧啶的合成完全培养基（SC-Ura），含20 g/L葡萄糖、6.7 g/L无氨基酸YNB、0.77 g/L CSM-Ura和22 g/L琼脂。GDL发酵培养基为YPC50，含50 g/L蓖麻油、20 g/L葡萄糖、5 g/L蛋白胨、2.5 g/L酵母提取物、2.4 g/L MgSO₄·7H₂O、1.2 g/L Na₂HPO₄、0.25 g/L KH₂PO₄和4 g/L Tween 80。不进行GDL发酵时，酵母在YPD培养基中培养，含20 g/L葡萄糖、20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物。固体培养基额外添加22 g/L琼脂。URA3筛选标记通过在YPD + FOA固体平板上培养去除，该培养基含0.8 g/L 5-氟乳清酸（5-FOA）和22 g/L琼脂。发酵在含50 mL YPC50的250 mL摇瓶中进行。挑取单菌落，在YPD中于28°C、220 rpm培养24 h。所得种子培养物以初始OD600为0.1接种至50 mL YPC50中，于28°C、220 rpm发酵168 h生产GDL。

补料分批发酵在5-L搅拌釜生物反应器（T&J-B型，上海杰灵生物工程有限公司）中进行，初始工作体积2.5 L。初始培养基含200 g葡萄糖、12.5 g蛋白胨、6.25 g酵母提取物、6 g MgSO₄·7H₂O、3 g Na₂HPO₄、0.625 g KH₂PO₄和10 g Tween 80。种子制备：将5 mL过夜YPD培养物（250 rpm，28°C）以初始OD600为0.05转移至含100 mL新鲜YPD培养基的500-mL摇瓶中，于250 rpm、28°C培养24 h。随后将对数生长期细胞无菌接种至生物反应器，初始OD600为0.2。前24 h以葡萄糖为主要碳源促进生物量积累，溶解氧（DO）水平维持在30%。葡萄糖耗尽后，以5 mL/L的速率流加蓖麻油，DO水平调整至10–20%。pH用10 M NaOH维持在6.0，通气量1 vvm，搅拌速度300至1000 rpm变化以确保充分氧传递。补料分批发酵持续约72 h，每6 h取样2 mL。各样品细胞用蒸馏水洗涤两次，冻干后用于测定干细胞重（DCW）、残余葡萄糖浓度和γ-癸内酯滴度。

【数据】LB培养基氨苄青霉素：100 mg/L；SC-Ura：20 g/L葡萄糖、6.7 g/L YNB、0.77 g/L CSM-Ura、22 g/L琼脂；YPC50：50 g/L蓖麻油、20 g/L葡萄糖、5 g/L蛋白胨、2.5 g/L酵母提取物、2.4 g/L MgSO₄·7H₂O、1.2 g/L Na₂HPO₄、0.25 g/L KH₂PO₄、4 g/L Tween 80；大肠杆菌培养：37°C、250 rpm；酵母种子培养：28°C、220 rpm、24 h；摇瓶发酵：初始OD600=0.1、28°C、220 rpm、168 h；5-L反应器：初始工作体积2.5 L、初始OD600=0.2、DO 30%（前24 h）→10–20%（流加后）、pH 6.0（10 M NaOH）、通气1 vvm、搅拌300–1000 rpm、发酵约72 h、每6 h取样2 mL

2.2 质粒构建

来自桃（Prunus persica）的醇酰基转移酶PpAAT1（QEZ90731.1）氨基酸序列从NCBI数据库获取。异源基因经密码子优化、合成并插入pUC-57质粒（Genewiz，苏州）。本研究所用合成基因片段和基因序列列于表S3。内源基因POX2（YALI0F10857g）、POX3（YALI0D24750g）、POX4（YALI0E27654g）、POX5（YALI0C23859g）、FAA1（YALI0D17864g）、LIP2（YALI0D07986g）、MFE1（YALI0E15378g）、POT1（YALI0E18568g）、PXA1（YALI0A06655g）、PXA2（YALI0D04246g）、PEX10（YALI0C01023g）和PEX23（YALI1_D35945g），启动子序列PTEFin、PGPDin和PFBA1，以及终止子序列xpr2t、cyc1t、mig1t和lip2t均通过PCR从解脂耶氏酵母Po1f-Δku70基因组扩增获得。质粒pUC-LEU-A08、pUC-HUH-IntA、pUC-HUH-IntB、pUC-HUH-IntC、pUC-HUH-IntC3、pUC-HUH-IntE2、pUC-HUH-IntE5和pUC-HUH-IntF储存于实验室，用于将内源或外源基因表达盒整合至A08、IntF、IntA、IntB、IntC、IntC3、IntE2和IntE5位点。本研究所用质粒列于表S1，引物列于表S2。质粒构建方法与实验室前期工作相同。

【数据】PpAAT1来源：桃（Prunus persica），GenBank编号QEZ90731.1；基因合成：Genewiz（苏州）；内源基因：POX2、POX3、POX4、POX5、FAA1、LIP2、MFE1、POT1、PXA1、PXA2、PEX10、PEX23；启动子：PTEFin、PGPDin、PFBA1；终止子：xpr2t、cyc1t、mig1t、lip2t；整合位点：A08、IntF、IntA、IntB、IntC、IntC3、IntE2、IntE5

2.3 菌株构建

本研究所用菌株列于表1。用于代谢工程改造的初始菌株为解脂耶氏酵母Po1f——亮氨酸和尿嘧啶营养缺陷型菌株。Po1f-Δku70衍生物通过敲除负责非同源末端连接的KU70基因获得，具有增强的同源重组能力。大肠杆菌DH5α用于质粒构建和扩增，所有质粒均携带氨苄青霉素抗性 cassette。质粒pUC-HUH-POX3、pUC-HUH-POX4、pUC-HUH-POX5、pUC-HUH-PEX23、pUC-HUH-POX3-LIP2、pUC-HUH-IntA-PpAAT1、pUC-HUH-IntA3-PEX10、pUC-HUH-IntB-PXA1、pUC-HUH-IntB-PXA1-PXA2、pUC-HUH-IntC-FAA1、pUC-HUH-IntC3-POX2、pUC-HUH-IntE2-POT1、pUC-HUH-IntE5-MFE1和pUC-HUH-IntF-POX2分别用NotI、SspI、EcoRI、KpnI、PacI和HindIII限制酶线性化，并使用Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit（Zymo Research，美国）导入菌株。转化方法与实验室前期工作相同。

【数据】初始菌株：Y. lipolytica Po1f（亮氨酸和尿嘧啶营养缺陷型）；宿主：Po1f-Δku70；大肠杆菌：DH5α；限制酶：NotI、SspI、EcoRI、KpnI、PacI、HindIII；转化试剂盒：Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit（Zymo Research，美国）

2.4 GDL的提取与分析

培养七天后，收集1 mL发酵液并与50 μL内标γ-十一内酯混合。pH调至2.0。随后加入等体积正己烷（1:1，v/v），于30°C、1200 r/min振荡30 min。振荡后，混合物在8000 ×g离心10 min。上层有机相经0.22 μm孔径有机相滤膜（SUPIN，南通，中国）过滤后用于气相色谱（GC，Agilent GC8860）分析。样品1 μL以不分流模式进样，进样口温度300°C。使用HP-5色谱柱（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm，Agilent，美国），氮气为载气，流速1 mL/min。初始柱温50°C保持2 min。检测器为火焰离子化检测器（FID）。随后以15°C/min的速率升温至300°C，保持2 min。

【数据】样品量：1 mL发酵液；内标：50 μL γ-十一内酯；pH：2.0；萃取溶剂：正己烷（1:1，v/v）；振荡：30°C、1200 r/min、30 min；离心：8000 ×g、10 min；滤膜：0.22 μm有机相膜；进样：1 μL不分流模式；进样口温度：300°C；色谱柱：HP-5（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm）；载气：氮气，1 mL/min；柱温程序：50°C保持2 min→15°C/min升至300°C保持2 min；检测器：FID

2.5 图1：GDL生物合成途径示意图

图1展示了工程化解脂耶氏酵母中(R)-(+)-γ-癸内酯生物合成途径的示意。绿色和红色文字分别表示敲除和过表达策略。缩写：Lip2，胞外脂肪酶2；Faa1，长链脂肪酰辅酶A合成酶1；Pxa1，过氧化物酶体转运蛋白。

研究结果

3.1 β-氧化途径工程增强(R)-(+)-γ-癸内酯积累

本研究以敲除KU70基因的Po1f-Δku70菌株为起始菌株构建GDL生产菌株，因该菌株能有效提高同源重组效率。以蓖麻油为底物对亲本菌株进行摇瓶发酵，GDL滴度仅为207.3 mg/L，且产物持续降解。该现象可能源于酰基辅酶A氧化酶的酶学特异性——Pox3偏好短链底物，而Pox4和Pox5具有广泛的链长特异性，二者均能导致GDL分解代谢（图2b）。为克服此限制，我们通过依次敲除与GDL降解相关的POX3、POX4和POX5，构建了工程菌株YZ-1、YZ-2和YZ-3。如图2c所示，所得菌株GDL滴度分别为400.5 mg/L、445.7 mg/L和491.6 mg/L，表明每次敲除均有效抑制了产物降解。在YZ-3基础上，通过多拷贝过表达POX2构建菌株YZ-4和YZ-5，以增强C10水平的β-氧化通量，从而增加GDL生物合成的前体供应。该策略将GDL滴度提高至831.5 mg/L（图2c）。

除酰基辅酶A氧化酶催化的限速反应外，β-氧化途径还受Mfe1和Pot1调控。Mfe1是具有烯酰辅酶A水合酶和3-羟酰辅酶A脱氢酶双重活性的双功能酶，催化β-氧化的第二和第三步。Pot1介导β-酮脂酰辅酶A的硫解裂解以释放乙酰辅酶A，控制β-氧化的终端步骤（图2a）。为提高途径效率，我们将编码Mfe1和Pot1的表达盒整合至菌株YZ-5的IntE2和IntE5位点，构建菌株YZ-6和YZ-7。所得菌株GDL滴度分别为947.9 mg/L和1153.6 mg/L（图2c），进一步验证了调控β-氧化途径对稳定GDL积累的关键作用。

图2：(a) β-氧化途径关键酶的代谢工程改造以提高(R)-(+)-γ-癸内酯产量。β-氧化途径示意。(b) 酰基辅酶A氧化酶活性示意，红色箭头表示对长链脂肪酸的特异性，绿色箭头表示对中短链脂肪酸的特异性。(c) 工程菌株摇瓶发酵的GDL产量。

【数据】亲本菌株GDL滴度：207.3 mg/L；YZ-1（ΔPOX3）：400.5 mg/L；YZ-2（ΔPOX4）：445.7 mg/L；YZ-3（ΔPOX5）：491.6 mg/L；YZ-4/YZ-5（过表达POX2）：831.5 mg/L；YZ-6（+MFE1）：947.9 mg/L；YZ-7（+POT1）：1153.6 mg/L

3.2 过表达胞外脂肪酶加速蓖麻油水解

在解脂耶氏酵母以蓖麻油生产GDL的过程中，蓖麻油首先必须水解以释放蓖麻油酸——后续酶促转化的前体。传统蓖麻油酸生产依赖皂化后酸化，该过程需要高温（70–100°C）并产生大量副产物，不适用于微生物生物转化。为克服这些限制，我们采用脂肪酶催化的酶促水解。脂肪酶的主要生物学角色是将不溶性甘油三酯水解为游离脂肪酸、单酰甘油、二酰甘油和甘油。此外，脂肪酶在非水介质中介导酯化、转酯化和酯交换反应。多种微生物——包括细菌、真菌和酵母——产生具有不同酶学特性和底物特异性的脂肪酶。已知解脂耶氏酵母天然分泌胞外脂肪酶Lip2，能有效将蓖麻油水解为蓖麻油酸，从而增强底物生物可利用性（图3a）。过表达LIP2基因的工程菌株YZ-8表现出增强的蓖麻油水解能力，显著缩短了达到GDL最高产量所需时间，将生产率从6.9 mg/L/h提高至8.2 mg/L/h，最终滴度达1180.7 mg/L（图3c）。

图3：(a, b) 过表达胞外脂肪酶促进蓖麻油水解的简化途径示意。(c) 工程菌株摇瓶发酵的GDL产量，“+”表示过表达，“-”表示未修饰。缩写：Lip2，胞外脂肪酶2。

【数据】YZ-8（过表达LIP2）：GDL滴度1180.7 mg/L；生产率：6.9 mg/L/h→8.2 mg/L/h；传统蓖麻油酸生产温度：70–100°C

3.3 脂肪酸活化途径优化增强(R)-(+)-γ-癸内酯积累

在解脂耶氏酵母中，游离脂肪酸不能直接利用，必须首先通过脂肪酰辅酶A合成酶活化为其酰基辅酶A形式才能参与下游代谢反应（图4a）。这一要求同样适用于游离蓖麻油酸——通过脂肪酰辅酶A活化转化为蓖麻油酰辅酶A。活化的蓖麻油酰辅酶A随后被转运至过氧化物酶体进行β-氧化，启动GDL生物合成途径（图4b）。在以油酸为底物合成γ-十二内酯的研究中，Marella等人假设敲除FAA1基因会减少脂肪酸活化，从而增加底物对羟化反应的可及性并增强产物合成。值得注意的是，Marella等人使用非羟基化脂肪酸进行内酯合成，因为羟化反应可能对未活化的脂肪酸而非其相应的酰基辅酶A衍生物具有特异性。同时，该遗传修饰防止脂肪酸被分流至同样以酰基辅酶A为底物的储存脂质合成中。通过构建FAA1敲除菌株，他们实现了19.3 ± 8.9 mg/L的γ-十二内酯滴度。此外，Zhang等人通过过表达FAA1基因使工程菌株合成GDL的能力翻倍。基于以上发现，我们将编码Faa1的表达盒整合至菌株YZ-8的IntC位点，构建菌株YZ-9。所得菌株GDL滴度达1294.3 mg/L，较YZ-8提高10%。同时生物量也有一定程度增加，可能归因于蓖麻油酸代谢加速释放的乙酰辅酶A改善了细胞生长（图4c）。

图4：(a) 过表达脂肪酰辅酶A合成酶促进游离脂肪酸活化为酰基辅酶A的简化途径示意，(b) 包括蓖麻油酸活化为蓖麻油酰辅酶A。(c) 工程菌株摇瓶发酵的GDL产量，“+”表示过表达，“-”表示未修饰。

【数据】YZ-9（+FAA1）：GDL滴度1294.3 mg/L，较YZ-8提高10%；Marella等ΔFAA1菌株γ-十二内酯：19.3 ± 8.9 mg/L

3.4 过氧化物酶体工程增强(R)-(+)-γ-癸内酯积累

解脂耶氏酵母具有天然的甘油三酯（TAGs）水解能力，可将其转化为可利用的游离脂肪酸（FFAs）。释放的FFAs可能被脂肪酰辅酶A合成酶Faa1活化为酰基辅酶A衍生物，随后通过特异性转运蛋白Pxa1和Pxa2转运至过氧化物酶体。或者，FFAs可先被转运至过氧化物酶体，再由酰基/芳基辅酶A连接酶（Aals）活化为酰基辅酶A。所得酰基辅酶A分子随后通过过氧化物酶体β-氧化途径降解，产生乙酰辅酶A。因此，我们假设游离蓖麻油酸首先被Faa1活化为蓖麻油酰辅酶A，随后由特异性过氧化物酶体转运蛋白Pxa1和Pxa2转运至过氧化物酶体进行下游降解（图5a）。我们假设Pxa1和Pxa2促进蓖麻油酰辅酶A转运至过氧化物酶体，从而增加GDL生物合成的前体供应。为验证该猜想，我们将编码Pxa1和Pxa2的表达盒分别整合至菌株YZ-9的IntB位点，构建菌株YZ-10和YZ-11。如假设所料，菌株YZ-11的GDL滴度增加至1670.1 mg/L，证明了过氧化物酶体底物转运对内酯生产的关键作用（图5c）。

在GDL生物合成中，β-氧化途径是核心模块，过氧化物酶体是这些反应的关键亚细胞区室。过氧化物酶体是真核生物中维持细胞脂质稳态和氧化还原平衡所必需的动态多功能细胞器。在解脂耶氏酵母中，过氧化物酶体是疏水性底物（如脂肪酸和烷烃）β-氧化的中枢，通过连续氧化循环产生乙酰辅酶A和NADH。同时，过氧化氢酶对脂肪酸氧化过程中形成的H₂O₂进行解毒，防止氧化应激并维持细胞内氧化还原平衡。近年研究进展已将过氧化物酶体定位为合成生物学中的关键工程靶点。破坏过氧化物酶体生物发生（如PEX3、PEX10、PEX11缺失）可重新引导代谢通量以增强产物积累。

图5：(a) 过表达转运蛋白促进蓖麻油酰辅酶A进入过氧化物酶体的简化途径示意。(b) 过表达过氧化物酶体生物发生因子及删除过氧化物酶体整合膜蛋白导致过氧化物酶体增大的简化示意。(c) 工程菌株摇瓶发酵的GDL产量。

【数据】YZ-11（+PXA1+PXA2）：GDL滴度1670.1 mg/L；YZ-10（单过表达PXA1）：原文未详述具体滴度

3.5 异源表达桃醇酰基转移酶增强内酯化途径

在解脂耶氏酵母中，GDL生物合成的最后一步涉及4-羟基癸酸的 lactonization。传统上，该步骤通过酸加热方法完成。为加速GDL生产并替代传统酸加热方法，我们引入来源于桃的醇酰基转移酶PpAat1，通过异源表达增强内酯化途径（图6a）。将编码PpAat1的表达盒整合至菌株YZ-11的IntA位点，构建菌株YZ-12。摇瓶发酵结果显示，YZ-12的GDL滴度进一步提高。

图6：(a) 异源表达桃醇酰基转移酶1（PpAat1）增强内酯化途径并替代传统酸加热方法的简化途径示意。(b) 工程菌株摇瓶发酵的GDL产量，“+”表示过表达，“-”表示未修饰。

【数据】YZ-12（+PpAAT1）：GDL滴度原文未详述

3.6 5-L生物反应器放大发酵

将最终工程菌株YZ-14在5-L搅拌釜生物反应器中进行补料分批发酵。发酵过程中监测GDL滴度、DCW、葡萄糖浓度和蓖麻油浓度。如图7a所示，在5-L生物反应器中，菌株YZ-14以蓖麻油为底物进行(R)-(+)-γ-癸内酯发酵。最终GDL滴度达到4538.5 mg/L。图7b展示了工程菌株在摇瓶发酵和5-L生物反应器中的GDL产量和生物量比较。

图7：(a) 菌株YZ-14在5-L生物反应器中以蓖麻油为底物进行(R)-(+)-γ-癸内酯发酵。发酵过程中GDL滴度、DCW、葡萄糖浓度和蓖麻油浓度。(b) 工程菌株在摇瓶发酵和5-L生物反应器中的GDL产量和生物量。

【数据】5-L生物反应器GDL滴度：4538.5 mg/L；发酵时长：约72 h；取样间隔：6 h；流加速度：5 mL/L蓖麻油

讨论与解读

本研究展示了解脂耶氏酵母中系统代谢工程高效生物合成(R)-(+)-γ-癸内酯的方法。通过合理的途径重构和亚细胞区室优化，实现了4538.5 mg/L的最终滴度，较亲本菌株提高21.9倍。此前有研究报道酵母系统中GDL滴度超过4 g/L，但这些研究通常依赖静息细胞生物转化和纯化的蓖麻油酸衍生物（如蓖麻油酸或蓖麻油酸甲酯）。部分高滴度通过过程工程策略获得，包括固定化细胞系统或专用底物递送载体以提高底物可利用性并减少产物抑制。相比之下，本系统基于以蓖麻油为底物的生长偶联生物合成，在单一工程代谢网络中整合了底物水解、脂肪酸活化、β-氧化和内酯化。与纯化蓖麻油酸衍生物相比，蓖麻油是更复杂的原料，需要有效的胞外水解和胞内代谢加工才能进入β-氧化。尽管存在这些额外的代谢限制，工程菌株仍实现了相当的滴度和有竞争力的底物转化率。

编译者解读： 本研究最值得关注之处在于将完整的多步转化路径——从复杂天然底物蓖麻油到高价值手性内酯——整合于单一菌株的代谢网络中，避免了传统生物转化中需要纯化中间底物的繁琐步骤。逐步叠加的代谢工程策略（β-氧化重构→脂肪酶→脂肪酸活化→过氧化物酶体工程→内酯化）清晰展示了"模块化叠加"的菌株开发逻辑，为其他内酯类香料或脂肪酸衍生化学品的生物合成提供了可借鉴的范式。异源表达桃来源的PpAat1以替代酸加热内酯化步骤，体现了合成生物学中跨物种酶资源利用的思路。不足之处在于5-L反应器规模的验证与工业级生产仍有距离，且以蓖麻油为底物的成本经济性需进一步评估。

参考来源

Yu Y. Building a yeast cell factory for green biomanufacturing of (R)-(+)-γ-decalactone: A natural peach-like aroma compound. Chemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.cej.2026.175287

DOI: 10.1016/j.cej.2026.175287