来源：Combining metabolic engineering and fermentation optimization to achieve cost-effective oil production by Cutaneotrichosporon oleaginosus（New Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
微生物油脂作为植物油脂的可持续替代品，正受到工业生物技术的广泛关注。本研究以产油酵母 Cutaneotrichosporon oleaginosus 为底盘细胞，通过组合代谢工程（过表达 ACL、ACC、TS 基因）与发酵工艺优化（双阶段补料策略），在 2 L 生物反应器中实现了 75.4%（w/w）的脂质含量和 0.40 g L⁻¹ h⁻¹ 的脂质生产率，几乎逼近理论最大产率。该研究为以甘油为碳源的微生物油脂工业化生产提供了可行的菌株与工艺组合方案。
研究背景
微生物油脂因生命周期短、劳动力需求低、受地域季节气候影响小且易于工艺放大，已成为植物油脂和生物柴油的可持续替代来源。产油酵母尤为突出——其脂质积累量可超过总生物量的 20%，且具备生长快速、脂质含量高、体积生产率高的商业化优势。这些微生物在碳源过剩而氮源等关键营养受限时，会停止生长并将过量碳以中性脂形式储存在胞内脂质体中。
Cutaneotrichosporon oleaginosus（曾用名包括 Apiotrichum curvatum、Cryptococcus curvatus、Trichosporon cutaneum 等）因脂质积累能力超过 40% 且能利用葡萄糖、木糖、纤维二糖、蔗糖、甘油、乳糖以及粗甘油、乳清浓缩物等多种碳源而脱颖而出。在氮限制条件下，其产生的脂肪酸组成含约 25% 的棕榈酸——这与棕榈油成分相近，使其成为棕榈油替代品开发的理想宿主。尽管 C. oleaginosus 的脂质含量已高于其他产油酵母，但要实现经济可行的工业化生产，仍需进一步提升生产率。
本研究采用菌株设计与生物工艺开发的组合策略，通过全因子实验设计考察遗传因素（ATP-柠檬酸裂解酶 ACL、乙酰-CoA 羧化酶 ACC、苏氨酸合酶 TS）与环境因素（碳氮比 C/N）对脂质积累的影响，并在 2 L 生物反应器中验证最优菌株的两阶段发酵性能。
研究方法
2.1 菌株、培养基及摇瓶培养条件
Cutaneotrichosporon oleaginosus ATCC 20509 及其转化子 ACL（过表达 ATP-柠檬酸裂解酶）和 TS（过表达苏氨酸合酶）用于遗传操作研究。ACL 和 TS 突变株由 Duman-Özdamar 等人（2025）构建并作为背景菌株。这些菌株的构建方式如下：将诺尔丝菌素乙酰转移酶基因（NAT）（GenBank: KY858965.1）与 GPD 启动子和终止子组合，作为选择标记共转化。
C. oleaginosus 野生型和突变株保存在含有 10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨、20 g/L 葡萄糖、20 g/L 琼脂的 YPD 琼脂平板上，保存培养物于 4°C 存放至多一周。本研究中所有克隆操作使用 Escherichia coli Zymo 10B（Zymo Research, Orange, CA），保存在含氨苄青霉素（100 μg/mL）或卡那霉素（50 μg/mL）的 LB 琼脂（10 g/L 胰蛋白胨、10 g/L NaCl、5 g/L 酵母提取物、15 g/L 琼脂）上，培养温度为 37°C。
摇瓶实验的接种物制备：将单菌落转移至 50 mL 管中的 10 mL YPD 肉汤（10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨、20 g/L 葡萄糖），在振荡培养箱中 30°C、250 rpm 培养 18 h。野生型和构建的 C. oleaginosus 转化子在 300 mL 摇瓶中培养，每瓶含 60 mL 以甘油为碳源、尿素为氮源、C/N 比分别为 30（g/g）和 175（g/g）的限定培养基。C/N 比通过改变甘油浓度来调节。培养物在振荡培养箱中 30°C、250 rpm 培养 96 h。培养结束后收集细胞，在 1780 g、4°C 条件下离心 15 min。所有摇瓶实验设三次重复。
【数据】菌株：C. oleaginosus ATCC 20509 及 ACL、TS 转化子；培养基：YPD 琼脂/肉汤、限定培养基（甘油+尿素）；温度：30°C（摇瓶）/37°C（大肠杆菌）；转速：250 rpm；时间：18 h（接种培养）/96 h（摇瓶实验）；离心：1780 g、4°C、15 min；C/N 比：30 和 175（g/g）；抗生素：氨苄青霉素 100 μg/mL、卡那霉素 50 μg/mL
2.2 质粒组装与转化准备
潮霉素 B 磷酸转移酶基因（HPT）与 GPD 启动子和 GPD 终止子组合，由 GenScript Biotech（美国新泽西州）克隆到 pUC57-Mini 克隆载体中作为骨架质粒。pUC57-HPT 用作转化研究的选择标记。内源 ATP-柠檬酸裂解酶（ACL1）、乙酰-CoA 羧化酶（ACC）和苏氨酸合酶（TS）基因基于注释（PRJEB73837）选择，并与内源启动子（pTEF1、pTPI1、pYAT）和终止子（tTEF1、tTPI1、tYAT）组合。
Duman-Özdamar 等人（2025）构建的 ACL 和 TS 突变株用作背景菌株。作者构建菌株的方式如下：野生型与 pUC57-ACL 和 pCG6-NAT 质粒共转化，产生基因型为 TEF1p-ACL-TEF1t、GPDp-NAT-GPDt 的 ACL 突变株；野生型与 pUC57-TS 和 pCG6-NAT 质粒转化，产生基因型为 YATp-TS-YATt、GPDp-NAT-GPDt 的 TS 突变株。所有构建体由 GenScript Biotech 使用 pUC57-Mini 克隆载体为骨架质粒合成。
质粒 pUC57-TS 和 pUC57-ACC 用于构建双转化子 ACL_ACC、ACL_TS、TS_ACC。为构建 ACL_ACC_TS，以 ACL 为背景菌株，组装 pUC57-TS-ACC 质粒。使用 YATp_BsaI_Fw 和 YATt_BsaI_Rv 引物将 BsaI 限制性酶切位点引入 YATp-TS-YATt 片段，并使用 NEBridge Golden Gate Assembly Kit（BsaI-HF v2）（New England Biolabs, Ipswich, MA）进行 pUC57-TS-ACC 的组装。组装后的质粒通过全质粒测序验证（Eurofins, Germany）。
质粒按照供应商说明转化至 E. coli Zymo 10B 细胞（Cat #T3020; Zymo Research, Irvine, CA, The US），转化菌株以甘油储备液形式保存在 −80°C。E. coli 细胞在含 100 µg/mL 氨苄青霉素或 50 µg/mL 卡那霉素的 10 mL LB 肉汤中、50 mL 离心管中 250 rpm、37°C 振荡过夜培养。使用 GeneJET Plasmid Miniprep Kit（Cat #K0503; Thermo Fisher Scientific, MA, The US）分离质粒 DNA。分离的质粒通过 HindIII 线性化 pUC57-TS-ACC、以 EcoRI 限制性内切酶线性化其他质粒，按照供应商说明（NEB, Ipswich, MA, The US）准备转化。
【数据】质粒骨架：pUC57-Mini；选择标记：HPT（潮霉素 B 磷酸转移酶）；启动子：pTEF1、pTPI1、pYAT、GPD；终止子：tTEF1、tTPI1、tYAT、GPDt；组装方法：Golden Gate Assembly（BsaI-HF v2）；线性化酶：HindIII（pUC57-TS-ACC）、EcoRI（其他质粒）；大肠杆菌培养：37°C、250 rpm、过夜；质粒提取：GeneJET Plasmid Miniprep Kit
2.3 共转化与转化子筛选
电转感受态细胞按照先前描述的方法制备。将含有目的基因的线性化载体和含有 HPT 基因的质粒共转化，每种载体 DNA 约 1 µg 加入 50 µl 电转感受态细胞中，冰上孵育 5 min。电穿孔使用 0.8 kVolt、1000 Ohm、25 µFarad 的脉冲（Bio-Rad, CA, The US），在 2 mm 电转比色皿中进行。脉冲后立即加入 1 mL YPD 肉汤。细胞转移至 2 mL Eppendorf 管中，30°C 孵育 2.5 h，每 30 min 通过倒置轻轻混匀细胞。电穿孔介导的转化方法允许线性化的目的基因载体和选择标记载体随机整合。
取 100 µL 细胞涂布在含有 100 µg/mL 诺尔丝菌素和 100 µg/mL 潮霉素 B 的 YPD 琼脂平板上进行初次筛选。阴性对照涂布在 YPD 琼脂上。平板在 30°C 孵育 48 h。随机挑取生长出的菌落，划线至含有 100 µg/mL 诺尔丝菌素和 200 µg/mL 潮霉素的 YPD 琼脂平板上进行二次筛选。转化子通过菌落 PCR 确认。使用表 S1 中的引物和 DreamTaq Green PCR Master Mix（2X），按照供应商说明操作（Thermo Fisher Scientific, MA, The US, #K1081）。
【数据】电转化参数：0.8 kVolt、1000 Ohm、25 µFarad；电转杯：2 mm；DNA 量：约 1 µg/载体；感受态体积：50 µl；冰上孵育：5 min；恢复培养：30°C、2.5 h、每 30 min 混匀；初筛：100 µg/mL 诺尔丝菌素 + 100 µg/mL 潮霉素 B、30°C、48 h；二筛：100 µg/mL 诺尔丝菌素 + 200 µg/mL 潮霉素；PCR 确认：菌落 PCR、DreamTaq Green PCR Master Mix（2X）
2.4 摇瓶实验设计与模拟
采用全因子设计，将 ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）、乙酰-CoA 羧化酶（ACC）、苏氨酸合酶（TS）和 C/N 比作为因子。该设计产生 16 组实验（2⁴），在摇瓶中开展。遗传因素视为分类因素：低水平为“未修饰”，高水平为“过表达”。C/N 比方面，C/N 30 为低水平，C/N 175 为高水平。
所有计算分析使用 R 版本 4.0.2 进行。响应（Y）与因子（x）之间的关系使用 R 的 lm 函数通过拟合线性模型表示：Y = β₀ + Σβᵢxᵢ + Σβᵢⱼxᵢxⱼ，其中 β₀ 代表截距系数，βᵢ 是线性系数（主效应），βᵢⱼ 是因子 i 和 j 之间的交互系数。回归方程的质量根据决定系数（R²）评估。模型的统计分析使用方差分析（ANOVA），p < 0.05 视为显著。实验设计方法、全因子设计、拟合线性模型的 R 脚本、ANOVA 分析和数据的详细信息见 ZENODO https://doi.org/10.5281/zenodo.16734003。
【数据】实验设计：全因子设计（2⁴ = 16 组实验）；因子：ACL、ACC、TS（分类：未修饰/过表达）、C/N 比（低：30，高：175）；统计软件：R 4.0.2；显著性阈值：p < 0.05；模型评估：R²、ANOVA
2.5 生物反应器实验
使用配备 Rushton 涡轮、一个船用搅拌桨和控制单元（Labfors 5, Infors HT, Switzerland）的 2 L 圆底生物反应器。接种物制备：将单菌落转移至含 50 mL YPG 培养基（10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨、16 g/L 甘油）的 250 mL 摇瓶中，在振荡培养箱中 30°C、250 rpm 培养 18 h。
取 18 mL 过夜培养的野生型和 ACL_ACC_TS 培养物作为 2 L 生物反应器中 900 mL 限定培养基的接种物。培养基含 2 g/L 尿素、40 g/L 甘油、1 g/L 酵母提取物、2.7 g/L KH₂PO₄、1.79 g/L NaH₂PO₄·7H₂O、0.2 g/L MgSO₄·7H₂O、0.2 g/L MgSO₄·7H₂O、0.1 g/L EDTA，pH 5.5，以及 9 mL 100X 微量元素溶液（4 g/L CaCl₂·2H₂O、0.55 g/L FeSO₄·7H₂O、0.48 g/L 柠檬酸·H₂O、0.1 g/L ZnSO₄·7H₂O、76 mg/L MnSO₄·H₂O、100 μL/L H₂SO₄（36 N））。
【数据】反应器：2 L 圆底生物反应器（Labfors 5, Infors HT）；搅拌：Rushton 涡轮 + 船用搅拌桨；接种培养：YPG 培养基、30°C、250 rpm、18 h；接种量：18 mL/900 mL 培养基；培养基成分：尿素 2 g/L、甘油 40 g/L、酵母提取物 1 g/L、KH₂PO₄ 2.7 g/L、NaH₂PO₄·7H₂O 1.79 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L、EDTA 0.1 g/L；pH 5.5；微量元素溶液：100X、9 mL
研究结果
3.1 遗传与环境因素的选择
在先前的工作中，研究者观察到过表达 C. oleaginosus 的 ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）、乙酰-CoA 羧化酶（ACC）和苏氨酸合酶（TS）基因对脂质含量有积极影响。此外，多项研究报道了 C/N 比对获得改善脂质积累的重要性。本研究进行了全因子设计，以考察这些遗传因素（ACL、ACC、TS）与培养基组成（C/N 30：轻度氮限制环境；C/N 175：被确定为野生型最适条件）对总脂质的组合效应，共产生 16 组实验，包括 8 株菌在选定 C/N 比下于摇瓶中测试。
【数据】全因子设计实验：16 组；菌株数：8 株；C/N 条件：30（轻度氮限制）和 175（野生型最适）
3.2 遗传与环境因素对脂质生产的影响
通过共转化构建了双转化子（ACL_TS、ACL_ACC、TS_ACC）和三转化子（ACL_ACC_TS），并通过菌落 PCR 确认了成功转化子。菌株构建完成后，WT、单转化子、双转化子和三转化子在 C/N 30 和 C/N 175 培养基中进行了测试。
在 C/N 30 条件下，ACL_TS 产生 2.53 g 脂质/L，脂质含量为 45.4%（w/w），YP/S 为 0.25 g 脂质/g 甘油；而 WT 仅产生 1.34 g 脂质/L，脂质含量 31.8%（w/w），脂质产率 0.18 g/g。此外，ACL_ACC_TS 在 C/N 30 条件下优于所有其他菌株，总脂质增加 2 倍（2.9 g/L），脂质含量和脂质产率增加 1.6 倍（51.8%（w/w），0.29 g/g）。这一差异在显微镜下同样可见——ACL_ACC_TS 的脂质体更饱满，而 WT 则不然。
在高 C/N 比条件下，ACL_TS 和 ACL_ACC 积累了最高脂质含量约 60%（w/w），而 ACL_ACC_TS 积累 55%（w/w）脂质。ACL_ACC_TS 菌株在两种培养基中均表现出最高脂质产率约 0.29 g 脂质/g 甘油，与 WT 相比脂质产率提高 1.6 倍。此外，当 TS 在单转化子、双转化子或三转化子中过表达时，获得的生物量浓度在 C/N 30 条件下增加高达 34%，在 C/N 175 条件下增加高达 22%。在高 C/N 比条件下，ACL_TS 和 ACL_ACC_TS 在培养结束时达到最高生物量浓度，分别为 6.9 g 干生物量/L 和 6.7 g 干生物量/L，而 WT 为 5.7 g 干生物量/L。由于这些增加，通过 ACL_ACC_TS 转化子获得的总脂质（g/L）与 WT 相比提升了 115%。
尽管 ACL_TS 在 C/N 175 条件下表现出最高脂质含量，ACL_ACC_TS 在低 C/N 比条件下表现出相当的脂质产率并优于 ACL_TS。此外，通过在两种 C/N 比条件下均表现出最高且一致的 YP/S，ACL_ACC_TS 被确定为更稳健的菌株，因此选择其进行生物反应器中的进一步表征。
为进一步研究遗传因素与培养基条件之间的交互作用及其主效应，研究者以总脂质（g/L）为响应拟合了线性回归。进行 ANOVA 以评估模型的统计显著性和适用性，模型拟合质量通过决定系数（R² = 99.34%）评估，显著性通过 p 值 < 2.2e-16 确认。所得方程突出表明，培养基的 C/N 比影响最大，其次是 ACL、TS 和 ACC 基因的过表达。除主效应外，观察到 ACL:ACC 和 ACL:TS 对总脂质有显著的正交互作用。另一方面，ACL:C/N、ACC:C/N 和 TS:C/N 之间无显著交互作用。
除这些因素对脂质生产的积极影响外，研究者观察到在两种测试的 C/N 比条件下，TS、双转化子和三转化子菌株表现出更高的饱和脂肪酸含量，C18:0 和 C20:0 水平增加，以及极长链脂肪酸（VLC-FAs）C22:0 和 C24:0 水平增加。在 C/N 30 条件下，饱和脂肪酸在 38.2% 至 44% 之间变化，而单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）的含量分别在 47.5% 至 52.6% 和 8.5% 至 10.7% 之间。当 C/N 增加到 175 时，所有菌株的 PUFA 含量向 MUFA 转移。此外，在 C/N 175 条件下，ACL_TS、ACL_ACC、TS_ACC 和 ACL_ACC_TS 积累的不饱和脂肪酸含量更高，MUFA（C18:1）多于 C/N 30 条件。
总体而言，三转化子在高低 C/N 比条件下均优于 WT 和其他转化子，具有最高脂质产率，因此选择 ACL_ACC_TS 进行放大实验。
【数据】C/N 30 下 ACL_TS：2.53 g 脂质/L、45.4%（w/w）脂质含量、0.25 g/g YP/S；C/N 30 下 WT：1.34 g 脂质/L、31.8%（w/w）脂质含量、0.18 g/g 产率；C/N 30 下 ACL_ACC_TS：2.9 g 脂质/L（2 倍增加）、51.8%（w/w）脂质含量（1.6 倍增加）、0.29 g/g 产率；高 C/N 下 ACL_TS 和 ACL_ACC：约 60%（w/w）脂质含量；高 C/N 下 ACL_ACC_TS：55%（w/w）脂质含量；生物量增加：TS 过表达菌株在 C/N 30 下最高 34%、C/N 175 下最高 22%；最高生物量：ACL_TS 6.9 g/L、ACL_ACC_TS 6.7 g/L、WT 5.7 g/L；总脂质提升：ACL_ACC_TS 比 WT 高 115%；R² = 99.34%；p < 2.2e-16；C/N 30 下脂肪酸组成：SFA 38.2%-44%、MUFA 47.5%-52.6%、PUFA 8.5%-10.7%
3.3 生物反应器受控条件实现更高脂质生产
对表现优于其他菌株的 ACL_ACC_TS 和 WT 在 2 L 生物反应器中采用两阶段发酵策略。阶段 I 以批式模式运行，初始 C/N 约为 15。当培养基中甘油耗尽时，通过脉冲补料 70%（v/v）甘油启动阶段 II。WT 的补料批式阶段在 64 h 开始，ACL_ACC_TS 在 48 h 开始。
在批式阶段，WT 的细胞浓度增加至 19.5 g/L（64 h），ACL_ACC_TS 达到 21 g/L（48 h），甘油生物量产率相似，均为 0.53 g/g。尽管生物量浓度相当，ACL_ACC_TS 的比生长速率（µ，0.111 h⁻¹）比 WT（0.08 h⁻¹）高 1.35 倍。批式阶段结束时，两种菌株的 C/N 比均增加至约 9 g/g。WT 达到 5.3 g/L 脂质、脂质含量 27%（w/w），而三转化子在批式阶段结束时获得 7.4 g/L 脂质和 36.3%（w/w）脂质含量。
在补料批式阶段，WT 的生物量浓度缓慢增加至 35 g/L，而三转化子达到 2.2 倍更高的生物量密度（77.5 g/L）。此外，发酵结束时三转化子的甘油消耗量比 WT 高 2.3 倍。ACL_ACC_TS 的脂质含量达到 75.4%（w/w），产率为 0.30 g 脂质/g 甘油；WT 的脂质含量为 61%（w/w），产率为 0.25 g 脂质/g 甘油。
本工作中的脂质产率计算基于消耗的甘油。除甘油外，生物反应器实验中使用的培养基还含有酵母提取物和维生素溶液，其中包含微量碳。但由于与甘油相比其量可忽略不计，计算中将其排除。ACL_ACC_TS 产生的总脂质比 WT 高 2.8 倍（61 g/L vs 22 g/L）。此外，三转化子在补料批式阶段的平均脂质生产率计算为 0.40 g L⁻¹ h⁻¹，WT 为 0.18 g L⁻¹ h⁻¹。
总体而言，通过使用两阶段发酵方法，ACL_TS_ACC 的脂质含量与摇瓶实验相比增加了 38%，WT 提高了 25%。这表明，除 C/N 比和遗传改变外，开发合适的工艺（如补料批式方法）可以提高生产过程的总体产率。
此外，研究者还考察了 WT 和 ACL_ACC_TS 在整个发酵过程中的脂肪酸谱。在脂质积累阶段开始前（生物量中脂质低于 20%，至 24 h），主要成分是 PUFA（C18:2 和 C18:3）。WT 的 C18:2 含量在最初 24 h 内稳定在约 35%。另一方面，三转化子产生的 C18:2 含量在 17 h 至 24 h 之间从 38% 降至 30%，伴随脂质积累加速。从发酵 48 h 起，两种菌株的 PUFA 组成在发酵结束时均降至约 7%。MUFA（C16:1、C18:1、C20:1、C22:1）从约 32% 增加至 WT 的 53.8% 和 ACL_ACC_TS 的 50.3%。
【数据】批式阶段 WT：19.5 g/L 生物量（64 h）、5.3 g/L 脂质、27%（w/w）脂质含量；批式阶段 ACL_ACC_TS：21 g/L 生物量（48 h）、7.4 g/L 脂质、36.3%（w/w）脂质含量；生物量产率：0.53 g/g（两菌株）；比生长速率：ACL_ACC_TS 0.111 h⁻¹ vs WT 0.08 h⁻¹（1.35 倍）；补料批式阶段 WT：35 g/L 生物量；补料批式阶段 ACL_ACC_TS：77.5 g/L 生物量（2.2 倍）；甘油消耗：ACL_ACC_TS 为 WT 的 2.3 倍；最终脂质含量：ACL_ACC_TS 75.4%（w/w）、WT 61%（w/w）；脂质产率：ACL_ACC_TS 0.30 g/g、WT 0.25 g/g；总脂质：ACL_ACC_TS 61 g/L vs WT 22 g/L（2.8 倍）；平均脂质生产率：ACL_ACC_TS 0.40 g L⁻¹ h⁻¹、WT 0.18 g L⁻¹ h⁻¹；脂质含量提升（vs 摇瓶）：ACL_TS_ACC +38%、WT +25%；C18:2 变化：WT 约 35%（0-24 h 稳定）、ACL_ACC_TS 38%→30%（17-24 h）；PUFA 终值：约 7%（两菌株）；MUFA 终值：WT 53.8%、ACL_ACC_TS 50.3%
讨论与解读
本研究通过菌株工程与生物工艺开发的组合策略，系统考察了 C. oleaginosus 在含甘油培养基上生产微生物油脂的潜力。ACL 和 ACC 反应在脂肪酸形成前体分子供应中的关键作用以及 TS 过表达对脂肪酸合成的积极影响已在 C. oleaginosus 中报道。通过全因子设计，研究者证明 ACL、ACC、TS 的过表达和高 C/N 比在摇瓶水平显著提高了脂质含量。回归分析确认了 C/N 比对脂质生产的影响最大，其次是 ACL、TS 和 ACC 基因的过表达。尽管回归分析反映出 ACL:ACC:TS 交互作用有负面影响，但其系数远小于主效应。ACL_ACC_TS 在两种 C/N 比条件下均获得最高脂质产率，且 ACL:ACC 和 ACL:TS 之间存在显著正交互作用——这些遗传修饰的组合可能协同作用，最大化碳流向脂质生物合成的通量。
在确认 ACL_ACC_TS 在低和高 C/N 比培养基中的潜力后，研究者以两阶段发酵策略对 WT 和三转化子进行了生物反应器实验。ACL_ACC_TS 表现出优异的性能，脂质含量达 75.4%（w/w），平均脂质生产率为 0.40 g L⁻¹ h⁻¹，产率达 0.30 g 脂质/g 甘油——这几乎是理论最大产率，也是以甘油为碳源的培养基中报道的最高脂质含量。
编译者解读：该研究的亮点在于将统计实验设计（全因子设计）与代谢工程系统结合，用数据驱动的方式而非试错法确定了关键限速步骤——C/N 比的影响甚至超过单个基因过表达。两阶段补料策略有效解耦了生长与产油阶段，使三转化子的生物量密度达到 WT 的 2.2 倍，这一思路对其他产油微生物的工艺开发有直接借鉴意义。值得注意的是，ACL_ACC_TS 在两种 C/N 条件下均保持一致的 YP/S，说明多基因组合改造增强了菌株对环境波动的耐受性——这对工业放大中不可避免的批次间差异尤为重要。未来若能将甘油底物替换为粗甘油等真实工业副产物，该工艺的经济性评估将更具说服力。
参考来源
Duman-Özdamar ZE. Combining metabolic engineering and fermentation optimization to achieve cost-effective oil production by Cutaneotrichosporon oleaginosus. New Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.nbt.2026.01.017
DOI: 10.1016/j.nbt.2026.01.017