来源：Design of a recombinant Pseudomonas strain with enhanced degradation viability towards catecholic compounds by reconstituting EDO-hydrolysis pathway（Journal of Environmental Chemical Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
邻苯二酚类化合物是化工与制药工业的关键骨架，年产量达25,000吨，其环境释放对生态系统和人类健康构成严重威胁。本研究以自行发现的Extradiol dioxygenase（EDO）Tcu3516为起点，通过重构EDO-水解代谢途径，将天然假单胞菌Pp18对邻苯二酚类污染物的降解能力提升2–12倍。双酶共表达菌株Tcu-HIU-pV-Pp18对邻甲酚和3-甲基邻苯二酚的降解能力较原始菌株提高8倍，进一步通过突变体筛选获得性能更优的NA-HIU-pV-Pp18菌株。
研究背景
邻苯二酚类化合物是化工和制药工业的重要结构单元，全球年产量达25,000吨，导致大量环境释放。3-甲基邻苯二酚和4-甲基邻苯二酚等代表性衍生物在石油加工和木质素热解过程中无意形成。这类化合物水溶性高，易在水环境中扩散并渗入土壤，即使在低浓度下对水生生物也表现出显著毒性。进入人体后，邻苯二酚被氧化为半醌，干扰自由基清除过程，最终导致器官和DNA损伤。
微生物降解是处理环境中邻苯二酚污染的主要途径，但天然微生物的降解效率和生存能力不足，限制了实际应用。瓶颈源于三个原因：污染条件下调控机制尚不清楚；代谢途径高度多样导致同一污染物的降解效率差异显著；高浓度污染物的毒性抑制微生物活性。本研究通过重构EDO-水解途径，试图解决这些问题。
研究方法
2.1 菌株与材料
Tcu3516（GenBank: ACY99052.1）及其优势突变体的重组E. coli表达载体pET28a(+)已在前期工作中构建。pVLT33购自长沙爱科博生物科技有限公司。Pseudomonas putida (Pp13) JCM13063、Pseudomonas putida (Pp18) JCM18798和Pseudomonas alkylphenolia (Pa16) JCM16553购自日本微生物菌种保藏中心。引物由长春康博生物科技有限公司合成。预混高保真DNA聚合酶PrimeSTAR® HS (Premix)、TB Green® Premix Ex TaqTM II FAST qPCR、DL2000和DL15,000 DNA Marker、T4 DNA连接酶和QuickCutTM Dpn I购自宝日医生物技术（北京）有限公司。FastAP购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。邻苯二酚和邻甲酚购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。丙酮酸比色检测试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。TransStart® FastPfu DNA聚合酶、Blue Plus® Protein Marker (14–100 kDa)、RNA纯化试剂盒（细胞、组织、细菌）、EasyScript® cDNA第一链合成试剂盒和E. coli Dh5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。
【数据】菌株：Pp13 JCM13063、Pp18 JCM18798、Pa16 JCM16553；载体：pET28a(+)、pVLT33；试剂来源：Takara、Thermo Fisher、Aladdin、Elabscience、TransGen；Tcu3516 GenBank号：ACY99052.1
2.2 假单胞菌菌株复苏
冷冻保存的Pp18和Pp16在Luria-Bertani（LB）琼脂平板上复苏，30°C培养2天。活力较差的Pp13在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上复苏。
【数据】培养基：LB琼脂、牛肉膏蛋白胨琼脂；温度：30°C；时间：2天
2.3 HODA水解酶的筛选
构建并筛选三种HODA水解酶。考虑到HODA水解酶对C6-醛基-HODA的催化能力有限，选取已报道的MfhA（GenBank: AFU63348.1）和MfphA（GenBank: ACH87186.1）作为候选，因其对这些不良底物具有较好的催化性能。此外，还纳入一株假单胞菌的同源HODA水解酶HIU89（GenBank: MBW4047464.1）。编码基因由上海生工生物工程股份有限公司合成并整合至pET28a(+)。
【数据】候选酶：MfhA（AFU63348.1）、MfphA（ACH87186.1）、HIU89（MBW4047464.1）；基因合成：Sangon Biotech
2.4 Tcu3516和HODA水解酶的构建、转化与表达
在共表达之前，先检测Tcu3516和三种HODA水解酶在假单胞菌中的单独表达情况。使用带有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ识别位点的引物扩增目标基因（表S1）。以先前构建的重组载体（Tcu3516-、MfhA-、MfphA-、HIU89–28a）为模板。目标PCR产物通过胶回收纯化。随后，扩增基因与pVLT33进行双酶切和连接，转化至E. coli DH5α进行亚克隆。提取重组载体并使用表S2所列引物测序。
假单胞菌的转化采用化学法。将假单胞菌过夜培养物转接至50 mL LB培养基活化，直至OD600达到0.4。细胞在8000 rpm离心7 min收集。沉淀用双蒸水洗涤两次，再用0.1 M CaCl2洗涤一次。再次离心后，假单胞菌细胞在0.1 M CaCl2中于4°C孵育45 min，再次收集。最后重悬于500 μL 0.1 M CaCl2中。转化时，将200 ng重组载体加入感受态细胞，4°C孵育45 min。随后42°C热激2 min 45 s，冰上冷却2 min。之后加入500 μL预热SOC培养基（30°C），30°C恢复培养3 h。样品涂布于含25 μg/mL硫酸卡那霉素的LB琼脂平板，30°C培养两天。
重组假单胞菌菌落的单菌落在含50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中培养至OD600达到1.0，然后用1 mM IPTG在25°C下诱导12 h、24 h或延长至36 h。收获的细胞重悬于20 mM、pH 8.0磷酸盐缓冲液中进行超声破碎（200 Hz，6 min）。离心（12,000 rpm，10 min）后，通过SDS-PAGE检测Tcu3516和三种HODA水解酶的表达水平，与携带空pVLT33的菌株进行比较。
随后评估酶活性。对于Tcu3516，以100 μM 3-甲基邻苯二酚（3-MC）为底物，通过观察亮黄色开环产物的形成来测定EDO活性。对于HODA水解酶，按照Seah的方法，通过完全催化相应的邻苯二酚类化合物制备底物。检测体系（1 mL）包含945 μL磷酸盐缓冲液（pH 8.0）、5 μL粗酶和50 μL HODA底物（HODA、5-甲基-HODA、6-甲基-HODA）。通过监测第一分钟内λmax处ΔA的变化测定活性。一个单位（U）定义为25°C下每分钟消耗1 μmol HODA。粗提物中总活性按公式(1)计算：
(1) Activity (U/mL) = (ΔA×2×10⁵) / (ε×t)
ε代表消光系数（HODA：λmax=375 nm，ε=36,000 M⁻¹cm⁻¹；5-甲基-HODA：λmax=382 nm，ε=28,100 M⁻¹cm⁻¹；6-甲基-HODA：λmax=388 nm，ε=13,800 M⁻¹cm⁻¹）。t为活性测定时间（1 min）。
【数据】活化培养基：50 mL LB；OD600：0.4；离心：8000 rpm，7 min；CaCl2浓度：0.1 M；4°C孵育：45 min；转化DNA量：200 ng；热激：42°C，2 min 45 s；恢复：30°C SOC培养基，3 h；卡那霉素：25 μg/mL（平板）、50 μg/mL（液体）；IPTG：1 mM；诱导温度：25°C；诱导时间：12/24/36 h；超声：200 Hz，6 min；离心：12,000 rpm，10 min；EDO底物：100 μM 3-MC；检测体系：945 μL缓冲液+5 μL粗酶+50 μL底物；HODA消光系数：375 nm/36,000、382 nm/28,100、388 nm/13,800 M⁻¹cm⁻¹；反应温度：25°C；反应时间：1 min
2.5 双关键酶菌株的构建与表达
双表达载体按照图S1所示策略构建。简要来说，通过表S3中的定点突变引物，在Tcu3516-pVLT33（Tcu-pV）的5'-314-CATCTA-319–3'和5'-400-CTCGCC-405–3'位置引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ识别位点。构建Tcu-pV-Nde I/Xho I（TPNX）后，用表S4中的引物扩增HIU89-pVLT33（HIU-pV）上的HIU89完整表达盒（HIU-exp）。载体构建、转化和诱导表达按照2.4节所述相同程序进行。
为验证Tcu-HIU-pV-Pp18中Tcu3516和HIU89的相应活性，使用含940 μL磷酸盐缓冲液（pH 8.0）、50 μL Tcu-HIU-pV-Pp18上清液和10 μL 3-MC（5 mM）的1 mL体系检测388 nm处的吸光度曲线。同时，将催化性能与pV-Pp18、Tcu-pV-Pp18、HIU-pV-Pp18进行比较，以进一步说明协同效应。
【数据】定点突变位点：5'-314-CATCTA-319–3'、5'-400-CTCGCC-405–3'；检测体系：940 μL缓冲液+50 μL上清+10 μL 3-MC（5 mM）；检测波长：388 nm
2.6 异源酶与内源酶协同作用的验证
共表达后，检测Tcu3516和HIU89与Pp18内源HPD-H和HOV-A的协同作用。首先，将Pp18和Tcu-HIU-pV-Pp18接种于20 mL LB培养基进行培养和诱导。最小盐培养基（MSM）通过每100 mL溶液溶解0.2 g (NH₄)₂SO₄、2 mg MgSO₄·7H₂O、0.8 mg CaCl₂、0.167 g Na₂HPO₄·12H₂O、0.844 g KH₂PO₄配制，然后灭菌。冷却后，加入500 mg/L 3-MC作为唯一碳源制备3MC-MSM。两种诱导培养物以初始OD600为1.0接种至3MC-MSM。对于Tcu-HIU-pV-Pp18，加入25 μg/mL卡那霉素以维持载体稳定性。
立即（0 h）和培养6 h后收集细胞样品（500 mg）。使用RNA纯化试剂盒提取总细胞内RNA。RNA标准化至2,000 ng，使用第一链合成试剂盒反转录为cDNA。使用表S5所列引物，以16S rRNA为内参，通过qPCR分析HPD-H和HOV-A的转录水平。2⁻ΔΔCt值的统计显著性使用GraphPad Prism 7中的t检验评估（p < 0.05；p < 0.01；p < 0.001；****p < 0.0001）。
对于丙酮酸转化，在0、30、60、120、240和360 min收集20 mg细胞样品，重悬于20 mM PBS缓冲液（pH 7.4）中进行超声破碎。使用丙酮酸比色检测试剂盒分析上清液，设置3个复孔。比较原始Pp18和工程菌Tcu-HIU-pV-Pp18从3-MC到丙酮酸的转化效率。
【数据】MSM组分（每100 mL）：0.2 g (NH₄)₂SO₄、2 mg MgSO₄·7H₂O、0.8 mg CaCl₂、0.167 g Na₂HPO₄·12H₂O、0.844 g KH₂PO₄；3-MC浓度：500 mg/L；初始OD600：1.0；卡那霉素：25 μg/mL；RNA量：2,000 ng；采样时间：0/30/60/120/240/360 min；PBS：20 mM，pH 7.4；复孔数：3
2.7 突变体的工程与整合
（原文节选至此，后续内容未提供）
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 HODA水解酶介导的下游水解途径的优势
高效的EDO及其下游途径能快速解毒邻苯二酚类污染物并将其转化为能量来源，从而提高微生物的降解效率。如图1所示，EDO间位裂解后，产物HODA将进入分叉模式进行进一步代谢。两种途径可将HODA转化为丙酮酸并进入TCA循环。由HODA脱氢酶（HODA-DH）介导的脱氢途径需要总共五种酶才能产生丙酮酸。而由HODA水解酶介导的水解途径仅需三种酶，表明其代谢效率更高。
先前的研究发现，与HODA脱氢酶相比，HODA水解酶出现较晚，在某些较老的微生物中不存在。该酶的出现被认为提高了微生物细胞中芳香族化合物的代谢效率，同时使微生物对多种芳香族化合物获得更好的适应性。基于上述分析，EDO与下游HODA水解酶的重组表达被认为是一种将邻苯二酚类化合物代谢引导至更直接途径的有前景策略，从而促进降解效率。
然而，不可避免的缺点是大多数HODA水解酶对C6-醛基-HODA（邻苯二酚或C4-取代邻苯二酚的间位裂解产物）的催化能力较差，可能导致代谢的邻苯二酚类化合物种类减少。为解决这一问题，本工作所用的HODA水解酶具有更宽的底物范围，能够同时催化C6-醛基-HODA和取代的C6-醛基-HODA。
【数据】脱氢途径酶数：5种；水解途径酶数：3种
3.2 Tcu3516和HODA水解酶的单独表达
在试验阶段，异源Tcu3516和三种HODA水解酶（MfhA、MfphA和HIU89）分别表达。四个基因被克隆（Tcu3516：933 bp，MfhA：744 bp，MfphA：870 bp，HIU89：873 bp），纯化并经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切。载体pVLT33（9747 bp）也被酶切以与基因连接（图S2A）。随后，三株冷冻假单胞菌Pp13、Pa16和Pp18被活化和培养（图S2B）。
Tcu3516在假单胞菌中的表达必须首先验证。Tcu-pV向Pa16和Pp18的转化成功实现。然而，Pp13在感受态细胞制备过程中活力严重受损，导致阳性克隆无法生长。诱导12和24 h后，表达结果（图2A）显示Tcu3516（∼38 kDa）仅在Pp18中表达，而在Pa16中未检测到表达。
毫不意外，Tcu-pV-Pp18的粗酶能够催化3-MC的开环裂解，在两个平行试验中形成亮黄色产物6-MeHODA（图2B）。除Pp13在感受态制备过程中完全失活外，Tcu3516在Pp13和Pa16中的异源表达完全不同。这些差异可归因于其遗传背景、转录调控机制和代谢网络的差异。研究表明，不同假单胞菌物种（如P. aeruginosa和P. putida）之间的平均遗传序列差异可达3.2%，可能导致对异源基因不同程度的耐受性。此外，转录调控的差异解释了为什么某些广宿主范围启动子（包括源自南极微生物的启动子）仅在某些假单胞菌物种中有功能。另外，诱导表达系统可能干扰代谢稳态，从而影响异源蛋白的产生。
鉴于Tcu3516只能在Pp18中表达，为实现共表达，三种HODA水解酶也尝试在菌株Pp18中表达。转化和诱导后，SDS-PAGE结果（图3A）显示MfhA未能在Pp18中表达。MfphA在诱导36 h后表现出中等水平的表达。值得注意的是，只有HIU89（∼31.5 kDa）在Pp18中显著表达，且表达水平随诱导时间延长而增加。
三种HODA水解酶在粗酶中的活性也被检测。如图3B所示，MfphA仅对最佳底物6-MeHODA显示出中等活性（0.190 U/mL）。而HIU89能更好地催化三种HODA底物，其对HODA、5-MeHODA和6-MeHODA的活性分别达到0.055、0.140和1.024 U/mL。基于上述结果，同源HIU89在Pp18中的表达水平优于其他两种HODA水解酶，似乎是Tcu3516共表达的最佳选择。
尽管如此，HIU89对C6-醛基-HODA（HODA和5-MeHODA）的催化能力较差是HODA水解酶面临的普遍问题，正如TOL质粒编码的XylF和源自Burkholderia cepacia LB400的BphD一样。需要深入研究以阐明这种底物偏好性的底物结合和催化机制，特别是催化过程中HODA上C6-羰基的取向。
【数据】基因长度：Tcu3516 933 bp、MfhA 744 bp、MfphA 870 bp、HIU89 873 bp；pVLT33：9747 bp；Tcu3516分子量：∼38 kDa；HIU89分子量：∼31.5 kDa；物种间遗传差异：3.2%；MfphA活性（6-MeHODA）：0.190 U/mL；HIU89活性：HODA 0.055 U/mL、5-MeHODA 0.140 U/mL、6-MeHODA 1.024 U/mL；诱导时间：12/24/36 h
3.3 双关键酶基因共表达构建重组菌株Tcu-HIU-pV-Pp18
Tcu3516和HIU89的双表达载体按照图S1所示流程构建。如图4A所示，通过定点突变首先将Nde Ⅰ和Xho Ⅰ识别位点引入Tcu-pV的非编码区，获得长度10,668 bp的正确产物TPN和TPNX。同时，以HIU89-pV为模板进行PCR时，在HIU89完整表达框的5'-和3'-末端添加相同的识别序列。获得长度为1116 bp的产物HIU-exp。
双酶切和连接后，双表达载体在E. coli DH5α中亚克隆。进一步的PCR鉴定（图4B）表明Tcu3516和HIU89的基因同时存在于双表达载体上。测序结果也证明了构建的成功。转化至Pp18后，Tcu3516和HIU89在Tcu-HIU-pV-Pp18的上清液中成功表达（图4C）。然而，HIU89的表达水平与其单独表达相比显著下降（图3A）。这种降低可能归因于共表达引起的能量代谢失衡，导致翻译所需能量供应不足。此外，共表达蛋白可能竞争有限的资源，如RNA聚合酶、tRNA和核糖体，从而降低整体表达水平。而且，大尺寸双表达载体（11,449 bp）的不稳定性也对共表达效率构成限制。尽管优化了IPTG浓度（0.5、1.0和1.5 mM），未观察到改善（图4D）。对假单胞菌表达系统的有限理解已成为阻碍代谢途径改造的瓶颈。
为进一步检测共表达后Tcu3516和HIU89的相应活性，使用3-MC作为初始底物。如图4E所示，pV-Pp18和HIU-pV-Pp18的粗酶未引起OD388的变化。而Tcu-HIU-pV-Pp18的粗酶可引起OD388的先后升高和降低。这一现象表明双表达菌株中Tcu3516的总活性较高，导致6-MeHODA快速积累。随着3-MC逐渐耗尽，Tcu3516的催化速率下降。HIU89催化的6-MeHODA水解超过其生成速率，导致OD388下降。通过添加Tcu3516-pV-Pp18和H（原文截断）的粗酶也可实现相同效果。
【数据】TPN/TPNX长度：10,668 bp；HIU-exp长度：1116 bp；双表达载体大小：11,449 bp；IPTG浓度：0.5/1.0/1.5 mM；检测波长：388 nm
3.4 修饰效果的验证
（原文节选至此，后续内容未提供）
【数据】原文未详述
3.5 用优势突变体替代Tcu3516
（原文节选至此，后续内容未提供）
【数据】原文未详述
3.6 重组假单胞菌在高浓度3-MC下的存活能力
（原文节选至此，后续内容未提供）
【数据】原文未详述
3.7 双表达菌株的降解能力
（原文节选至此，后续内容未提供）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究通过重构EDO-水解途径，解决了假单胞菌降解邻苯二酚类污染物性能不佳的问题。将邻苯二酚类污染物快速转化为丙酮酸，从而增强了原始菌株的降解能力。用V212N/D285A替代Tcu3516进一步提高了双表达菌株中的EDO活性。最终菌株NA-HIU-pV-Pp18在生存能力和降解能力方面均优于Tcu-HIU-pV-Pp18和底盘菌株Pp18。这些发现强调了EDO-水解途径在邻苯二酚代谢中的重要性。此外，整个工作加深了这样的认识：构建高效的产能途径是解决微生物降解缺陷的有前景策略。
编译者解读
本研究展示了一条清晰的合成生物学改造路径——从天然菌株筛选、异源酶表达验证到双酶共表达和突变体优化的完整闭环。方法上的亮点在于选择了代谢路径更短的水解途径（3酶 vs 5酶），并针对HODA水解酶底物谱窄的瓶颈筛选了同源酶HIU89。值得注意的是，HIU89对6-MeHODA的活性（1.024 U/mL）远高于对其他底物的活性，这种底物偏好性既是优势也是局限。双表达后HIU89表达量下降的问题提示，多基因共表达的资源竞争在假单胞菌中仍是实际障碍。突变体NA-HIU-pV-Pp18在存活和降解方面的提升，说明定向改造EDO活性位点是增强整条途径通量的有效切入点。
参考来源
Huang Z. Design of a recombinant Pseudomonas strain with enhanced degradation viability towards catecholic compounds by reconstituting EDO-hydrolysis pathway. Journal of Environmental Chemical Engineering, 2025. DOI: 10.1016/j.jece.2025.118338
DOI: 10.1016/j.jece.2025.118338