来源：Biotransformation of toxic lignin and aromatic compounds of lignocellulosic feedstock into eco-friendly biopolymers by Pseudomonas putida KT2440（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质素及其衍生物因毒性和难降解性长期被生物加工产业视为废料。本研究利用恶臭假单胞菌KT2440，通过驯化适应策略，在不进行任何基因改造的前提下，实现了高浓度木质素和多种芳烃化合物的降解，并同步合成聚羟基脂肪酸酯（PHA）生物聚合物。该菌株可降解30%木质素、45 mM苯甲酸盐及多种芳烃混合物，合成的PHA经GC-MS、FT-IR和¹H NMR证实为含多种单体的杂聚物。这一"以毒解毒"的策略为木质纤维素废弃物的高值化利用开辟了新路径。
研究背景
石油基化学品的大规模生产造成了严重的环境污染，塑料作为其中典型代表，不可降解特性导致其在海洋和填埋场中大量累积。预计到2050年，全球将新增约12,000公吨不可降解塑料垃圾。合成塑料的生产依赖化石燃料，不可持续；而利用微生物将可再生资源转化为聚合物则具有明显优势。
木质素是自然界中仅次于纤维素的第二大酚类聚合物，具有无定形、难降解和异生物质特性，对酶解和微生物作用均表现出抗性。据估计，自然界中木质素总量约0.5–36亿吨，每年新增10万–20万吨。其低反应活性和难降解特性使其成为生物炼制工业中大量残留的副产物。
研究方法
2.1 菌株、培养基与培养条件
恶臭假单胞菌KT2440购自美国典型培养物保藏中心（ATCC 47054，美国弗吉尼亚州马纳萨斯），按照说明书在Luria-Bertani（LB）肉汤（Miller配方）中复苏。菌种以25%甘油保存于−80°C备用。实验前，将菌种从甘油管中取出，用无菌单倍浓度磷酸盐缓冲液洗涤细胞，划线接种至LB琼脂培养基活化。挑取单菌落接种至LB肉汤中，37°C、150 rpm过夜培养。
耐受性和生长研究在改良M9基本培养基中进行，组成如下（g·L⁻¹）：Na₂HPO₄·12H₂O 13.56；KH₂PO₄ 6.0；NaCl 1.0；NH₄Cl 2.0；MgSO₄ 2 mM；CaCl₂ 100 mM；FeSO₄ 18 mM。0.5%葡萄糖作为唯一碳源或与木质素和芳烃化合物共同作为共底物添加。所有实验均在M9培养基中进行，pH 7.0，温度30°C。
PHA生产实验中，种子培养基和发酵培养基的氮源（NH₄Cl）含量不同：M9种子培养基含2.0 g·L⁻¹ NH₄Cl，发酵培养基含0.2 g·L⁻¹ NH₄Cl，以营造氮源充足（feast）和氮源匮乏（famine）条件。所有化学品、试剂及芳烃模式化合物（苯甲酸、对香豆酸、阿魏酸、苯酚、邻苯二酚等）均购自Sigma公司。
【数据】菌株：Pseudomonas putida KT2440（ATCC 47054）；培养基：LB肉汤、改良M9基本培养基；保存：25%甘油，−80°C；活化：37°C，150 rpm过夜；M9组成：Na₂HPO₄·12H₂O 13.56 g·L⁻¹，KH₂PO₄ 6.0 g·L⁻¹，NaCl 1.0 g·L⁻¹，NH₄Cl 2.0 g·L⁻¹，MgSO₄ 2 mM，CaCl₂ 100 mM，FeSO₄ 18 mM；葡萄糖：0.5%；pH 7.0；温度：30°C；种子培养基NH₄Cl：2.0 g·L⁻¹；发酵培养基NH₄Cl：0.2 g·L⁻¹
2.2 稻草木质素的碱预处理提取
碱预处理木质素（APL）的提取参照Kaur & Kuhad（2019）方法并稍作修改。简要流程如下：将稻草切成3.5 cm小段并粉碎。碱预处理采用6% NaOH与粉碎稻草按1:10（w/v）比例混合。处理后的稻草在121°C、15磅压力下高压灭菌30 min，所得木质素提取液为黑色液体，即碱预处理木质素（APL）。APL通过筛网与剩余生物质分离，10,000 rpm离心10 min沉淀碎屑和悬浮颗粒。
本研究仅测定APL的总酚含量，因研究目标聚焦于木质素中芳烃化合物的利用。总酚采用Folin-Ciocalteau法测定（Singleton et al., 1999）。实验前，APL用10 M NaOH调节pH至12溶解，再用10 M HCl中和至pH 7.0，以避免木质素组分沉淀（Rouches et al., 2021）。
【数据】稻草长度：3.5 cm；NaOH浓度：6%；固液比：1:10（w/v）；灭菌条件：121°C，30 min，15磅；离心：10,000 rpm，10 min；APL溶解：10 M NaOH调pH至12后10 M HCl中和至pH 7.0；总酚测定：Folin-Ciocalteau法
2.3 木质素和芳烃化合物的耐受性及生长研究
#### 2.3.1 对木质素和芳烃化合物的耐受性
通过在有/无葡萄糖作为共底物的条件下逐步提高底物浓度，评估菌株对木质素及其模式化合物的耐受性。测定以下组合：
i. 木质素（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50%，v/v），含或不含0.5%葡萄糖。
ii. 芳烃化合物（0、2、4、6、8、10…0.50 mM），含或不含0.5%葡萄糖。
iii. 芳烃混合物（0、1、2、3、4、5、6…10 mM，苯甲酸盐+对香豆酸盐+阿魏酸盐+苯酚+邻苯二酚各等量），含或不含0.5%葡萄糖。
耐受性评估在试管中进行，每管含5 mL M9基本培养基，按上述组合分别添加木质素或芳烃底物，含或不含葡萄糖。接种量为2%，接种后试管于30°C、150 rpm摇床培养。观察生长情况，连续三天无生长则终止实验。记录获得的最高耐受浓度，随后进行菌株适应化培养。以含2%葡萄糖作为唯一碳源的培养基作为对照。所有实验设三次重复。
【数据】木质素浓度梯度：0–50%（v/v）；芳烃浓度梯度：0–0.50 mM；芳烃混合物浓度梯度：0–10 mM（各组分等量）；培养基体积：5 mL；接种量：2%；培养条件：30°C，150 rpm；终止标准：连续3天无生长；对照：2%葡萄糖
#### 2.3.2 适应化、生长与降解研究
适应化处理是将菌株预先培养在最高耐受浓度的底物中，直至达到理想OD值，然后持续提高浓度直至出现完全生长抑制。具体操作：250 mL锥形瓶中加入50 mL M9培养基并灭菌。分别向各瓶中加入木质素和芳烃化合物，含或不含0.5%葡萄糖。微量元素和芳烃化合物在高压灭菌后通过滤器过滤灭菌加入，以避免沉淀。培养基pH调至7.0，于30°C、150 rpm摇床培养。
生长情况每隔2 h通过Varioskan LUX多功能读板仪（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州）测定OD₆₀₀。葡萄糖利用情况采用Miller（1959）描述的DNS法测定还原糖来评估。降解研究中，每12 h间隔采集样品，木质素和芳烃的降解通过GC-MS分析评估（Raj et al., 2007）。当观察到底物完全利用（以相应底物峰消失为确认标准）时终止实验。生物量测定：细胞在60°C热风干燥箱中干燥过夜，用分析天平称重。所有实验设三次重复。
【数据】培养体积：50 mL/250 mL锥形瓶；生长测定间隔：2 h；OD₆₀₀测定：Varioskan LUX多功能读板仪；葡萄糖测定：DNS法；降解采样间隔：12 h；降解分析：GC-MS；生物量干燥：60°C过夜；pH 7.0；培养条件：30°C，150 rpm；重复次数：3次
2.4 生物聚合物的筛选、发酵与提取
菌株利用木质素和芳烃底物合成生物聚合物的能力通过Sudan Black B（SBB）和Nile Blue A（NBA）染色法确认。简要操作：将0.5% Sudan Black B染液浸没琼脂平板表面，静置20–30 min。染色后的平板用蒸馏水冲洗，随后用80%乙醇反复脱色以利于观察。显微镜观察时，细胞用5% SBB染色10 min，用二甲苯脱色。涂片用0.5%番红复染30 s。最后，载玻片在流水下冲洗、干燥，在100×油镜下观察。
Nile Blue A平板检测中，将0.5 μg·mL⁻¹ NBA水溶液直接加入M9琼脂培养基平板中，划线接种培养后观察。积累生物聚合物的细菌细胞经SBB染色后呈蓝黑色，经NBA染色后在紫外光下显示荧光（见补充材料）。
摇瓶发酵中，种子培养在250 mL锥形瓶中进行，含100 mL M9培养基和过量氮源（2.0 g·L⁻¹ NH₄Cl）。碳源为木质素和芳烃化合物，添加0.5%葡萄糖作为共底物以增强生物量积累。以含2%葡萄糖作为唯一碳源的培养基作为对照。培养物在30°C、225 rpm摇床中培养24 h至中稳定期。
PHA积累阶段，摇瓶发酵在500 mL锥形瓶中进行，含200 mL M9培养基和限制氮源（0.2 g·L⁻¹ NH₄Cl）。木质素和芳烃碳源浓度保持不变。锥形瓶置于30°C、225 rpm摇床培养箱中。定期用5% SBB染色后显微镜观察检查各瓶PHA积累情况。
细胞干重测定：培养物10,000 rpm离心10 min，沉淀用无菌去离子水洗涤两次。洗涤后的细胞用iShinbiobase冷冻干燥机冻干并称重。生物聚合物从细菌细胞中提取参照Xu et al.（2021）方法稍作修改。所得生物聚合物为沉淀固体，在室温下干燥，含量根据细胞干重计算，并进一步进行表征（见补充材料）。
【数据】SBB染色：0.5%染液，20–30 min；脱色：80%乙醇；显微镜染色：5% SBB 10 min，二甲苯脱色，0.5%番红30 s；NBA浓度：0.5 μg·mL⁻¹；种子培养：100 mL M9，NH₄Cl 2.0 g·L⁻¹，30°C，225 rpm，24 h；发酵培养：200 mL M9，NH₄Cl 0.2 g·L⁻¹，30°C，225 rpm；离心：10,000 rpm，10 min；干燥：iShinbiobase冷冻干燥机；对照：2%葡萄糖
2.5 提取生物聚合物的表征
#### 2.5.1 GC-MS分析单体组成
PHA的单体组成通过分析提取生物聚合物的甲酯衍生物来确定。
【数据】分析方法：GC-MS（甲酯衍生物）
研究结果
3.1 恶臭假单胞菌KT2440利用木质素和芳烃化合物的生长与降解特征
#### 3.1.1 耐受性与菌株适应化
为评估恶臭假单胞菌KT2440对逐步升高浓度木质素和芳烃化合物的降解潜力，首先测定了其耐受性。从1 L碱预处理木质素中获得了5.3 g总酚。为模拟木质素的化学组成，比较研究了木质素、模式芳烃化合物和芳烃混合物对耐受性、生长和降解时间的影响。
通过驯化进行菌株适应化是用高浓度抑制性化合物研究中的关键步骤。适应过程中，菌体通过合成代谢酶类、切换代谢途径和积累生物量来做好应对准备（Kumar et al., 2005）。此外，葡萄糖等简单碳源作为共底物时，已知可增强木质素及相关化合物的降解（Rouches et al., 2021; Liu et al., 2019）。为避免菌体对简单碳源的完全依赖并防止碳分解代谢物阻遏（CCR），添加了较低浓度（0.5%）的葡萄糖作为共底物。这既有助于菌体在高抑制物环境中存活，也能在迟滞期帮助菌株做好代谢准备（Chu & Barnes, 2016）。
菌株在含和不含葡萄糖条件下的适应化结果如图1所示。结果表明，驯化使菌株对升高抑制物浓度的适应性增强，而葡萄糖的添加确实提高了菌株的耐受能力。采用的驯化策略是将培养物预先在最佳抑制物浓度中培养，待充分生长后再逐步提高抑制物水平（Mohamed et al., 2020）。该适应化策略效果显著——直接将培养物接种至高抑制物浓度会导致生长下降或完全抑制，而预先在抑制物中培养的菌株则表现良好（Kumar et al., 2005）。
耐受性评估和驯化完成后，以各底物的最高适应浓度进行生长和降解研究，重点关注迟滞期、生物量和降解周期。
【数据】总酚含量：5.3 g·L⁻¹ APL；共底物葡萄糖浓度：0.5%；适应化策略：逐步提高抑制物浓度
#### 3.1.2 生长与降解
适应化后菌株在含/不含葡萄糖条件下的生长曲线如图2所示。
以木质素为底物时，葡萄糖的添加显著提高了适应菌株的耐受性，最高可达培养基中30%（1.60 g·L⁻¹）的木质素。适应化后且在0.5%葡萄糖存在下，迟滞期缩短至几乎一半。葡萄糖消耗始于约8 h，而对数期在第4小时即已开始，葡萄糖完全利用在约24 h时观察到（Johnson et al., 2016）。对数期提前启动而葡萄糖消耗滞后，可能是由于木质素中其他可优先利用的低分子量组分的存在（Xu et al., 2021; Chen et al., 2012）。虽然木质素中许多组分在生长初期即被降解，但降解评估持续至5天，以观察代谢产物的变化（Rouches et al., 2021; Chen et al., 2012）。
以苯甲酸盐为底物时，葡萄糖存在下观察到迟滞期显著缩短，耐受性合理提高。两种情况下的降解时间均为48 h。葡萄糖消耗较为缓慢，完全消耗耗时36 h，但对数期仍在持续——这表明即便没有葡萄糖这一简单碳源，菌体也能利用苯甲酸盐作为唯一碳源。葡萄糖的渐进消耗可能与二峰生长现象有关，即葡萄糖和苯甲酸盐被同时利用（Karishma et al., 2015）。此外，葡萄糖完全消耗后生长出现短暂迟滞期，表明菌株正在适应碳源环境的变化并进行代谢途径切换（Chu & Barnes, 2016）。苯甲酸盐降解时间为48 h，葡萄糖缺失对耐受性和降解时间影响不大（Basu et al., 2006）。
阿魏酸盐和对香豆酸盐为底物时，观察到一个有趣现象：两种底物的耐受能力和降解时间相同。适应化和葡萄糖添加均提高了耐受性并缩短了降解时间。但两种底物的迟滞期存在差异——葡萄糖添加使对香豆酸盐和阿魏酸盐的迟滞期均显著缩短。对香豆酸盐的葡萄糖消耗与对数期启动同步开始，28 h内完成；阿魏酸盐的葡萄糖利用在36 h结束，表明阿魏酸盐与葡萄糖被同时利用（Renukaprasad et al., 2017）。
菌株对苯酚和邻苯二酚的耐受性最低，但葡萄糖的添加使耐受性和迟滞期均有显著改善。邻苯二酚在适应化前后均不超过36 h即可完全降解，但适应化后浓度水平更高，葡萄糖的添加支持了生长和降解。这体现了共底物添加改善菌株性能的效果（Kohlstedt et al., 2022）。苯酚的情况类似，迟滞期和耐受水平均有大幅提升。一个值得注意的观察是，葡萄糖消耗非常缓慢——邻苯二酚组中葡萄糖存在直至40 h，苯酚组中直至48 h，尽管消耗始于约12 h（此时菌株进入对数期）。这种对简单碳源的缓慢利用可能源于菌株优先利用芳烃而非葡萄糖，或对两种底物存在二峰生长现象（Ravi et al., 2017; Basu et al., 2006）。
菌株对等比例芳烃混合物（苯甲酸盐+对香豆酸盐+阿魏酸盐+苯酚+邻苯二酚）的耐受性同样因适应化和葡萄糖添加而增强。迟滞期从6 h缩短至4 h，与木质素+葡萄糖培养基中的迟滞期相似。尽管含/不含葡萄糖条件下浓度存在差异，所有芳烃在24 h内均完全降解，唯苯酚例外——其完全降解耗时96 h。葡萄糖完全消耗发生在约36 h。
本研究结果与Ravi et al.（2017）的报道相似，该研究使用了5 mM浓度的芳烃混合物，报道了苯甲酸盐、对香豆酸盐和阿魏酸盐在12 h内的顺序消耗。本研究中未观察到层级消耗现象，这与Ramirez et al.（2021）的报道一致——他们描述了底物的顺序利用取决于氮源充足或匮乏。不过，邻苯二酚和对香豆酸盐是12 h内最先被利用的底物，随后是24 h内消耗的阿魏酸盐和苯甲酸盐。
生长周期结束时，测定了细胞干重以考察碳底物对生物量积累的影响——细胞浓度是生物聚合物产量的重要参数。尽管培养基中仅添加了少量葡萄糖，却极大影响了菌株的耐受性、降解潜力和生物量积累。添加葡萄糖培养的细胞生物量积累高于未添加组。
【数据】木质素最高耐受浓度：30%（1.60 g·L⁻¹）；葡萄糖消耗起始：约8 h；对数期起始：第4 h；葡萄糖完全消耗：约24 h；苯甲酸盐降解时间：48 h；葡萄糖完全消耗（苯甲酸盐组）：36 h；对香豆酸盐降解时间：与阿魏酸盐相同；对香豆酸盐组葡萄糖完全消耗：28 h；阿魏酸盐组葡萄糖完全消耗：36 h；邻苯二酚完全降解：≤36 h；邻苯二酚组葡萄糖存在至：40 h；苯酚组葡萄糖存在至：48 h；芳烃混合物迟滞期：6 h→4 h；混合物中芳烃完全降解：24 h（苯酚除外）；苯酚完全降解：96 h；混合物中葡萄糖完全消耗：约36 h
3.2 生物聚合物的筛选、发酵与表征
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究证实了恶臭假单胞菌KT2440在高浓度木质素和芳烃化合物降解方面的潜力。仅通过简单的驯化适应，无需任何基因操作，即可获得对这些抑制性化合物的更高耐受性和降解能力。在氮源充足/匮乏（feast and famine）条件下，菌株利用这些有毒化合物合成了生物聚合物，产物为含短链、中链和长链单体的杂聚物。通过GC-MS、FT-IR和¹H NMR确认了PHA的结构特征。该研究展示了将有毒化合物转化为工业价值生物产品的可能性，可作为合成产品的替代方案。
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于"零基因操作"的策略——仅靠驯化和共底物添加就实现了高浓度木质素降解与PHA合成耦合。从合成生物学应用角度看，这种策略成本低、周期短、无转基因监管障碍，适合工业化推广。但研究也存在明显局限：PHA产量未在摘要中给出具体数值，且菌株对苯酚等毒性最强底物的耐受浓度仍偏低。后续可考虑将驯化策略与代谢工程结合，例如在KT2440中引入木质素降解酶模块或优化PHA合成途径，以进一步提升转化效率。
参考来源
Mohammad, S. H. (2022). Biotransformation of toxic lignin and aromatic compounds of lignocellulosic feedstock into eco-friendly biopolymers by Pseudomonas putida KT2440. Bioresource Technology. DOI: 10.1016/j.biortech.2022.128001
DOI: 10.1016/j.biortech.2022.128001