来源：Boosting intracellular product extraction in Yarrowia lipolytica via secretory expression of β-1,3-glucanase for cell wall lysis（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是合成脂溶性高价值化合物的重要底盘菌株，但其厚而坚硬的细胞壁严重阻碍胞内产物的释放，推高下游提取成本。本研究从 Cellulosimicrobium cellulans 中筛选出两种 β-1,3-葡聚糖酶同工酶，通过分泌表达于解脂耶氏酵母中实现细胞壁的原位降解。结果显示，CcβglS 的分泌表达使单细胞蛋白提取效率提升 17.51%，β-胡萝卜素提取效率最高提升 21.72%，为降低下游加工成本提供了"自产自用"的酶法裂解策略。
研究背景
代谢工程与合成生物学的快速发展推动了微生物细胞工厂在低值可再生原料向高值化学品转化中的应用。解脂耶氏酵母作为一种非常规半子囊菌酵母，具有卓越的脂质积累能力，油脂含量可超过细胞干重的 50%，天然存在的脂滴使其特别适合生产类胡萝卜素和角鲨烯等亲脂性化合物。目前，解脂耶氏酵母中角鲨烯产量已达 51.2 g/L，为微生物系统迄今报道的最高水平。此外，其蛋白质含量占细胞干重的 30%–60%，可作为单细胞蛋白（SCP）应用于动物饲料或食品添加剂。然而，该酵母厚而坚硬的细胞壁阻碍了这些宝贵胞内产物的释放，细胞破碎作为下游加工的第一步，直接影响提取的完整性、产物活性、纯度及整体生产成本。因此，如何温和高效地破解细胞壁屏障，成为提升解脂耶氏酵母产业化经济性的关键问题。
研究方法
2.1 菌株与培养基
大肠杆菌 Escherichia coli DH5α 在 37°C 下培养，作为质粒构建的宿主菌。解脂耶氏酵母 Po1g 和 MB123 在 30°C 下培养，作为 β-1,3-葡聚糖酶分泌表达的宿主菌。所用菌株列于表 S1。LB 培养基（5 g/L 酵母提取物、10 g/L 胰蛋白胨、10 g/L NaCl）用于大肠杆菌 DH5α 的常规培养。含亮氨酸或色氨酸缺陷型氨基酸混合物的 Minimal SD Base（TaKaRa，中国北京）分别用于解脂耶氏酵母 Po1g 和 MB123 转化子的筛选。解脂耶氏酵母的常规培养在 YPD 培养基中进行，其组成为 10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨和 40 g/L 葡萄糖。必要时，向培养基中添加抗生素，氨苄青霉素浓度为 100 mg/L。固体培养基添加 2 g/L 琼脂。
【数据】大肠杆菌培养温度：37°C；解脂耶氏酵母培养温度：30°C；LB 培养基：5 g/L 酵母提取物、10 g/L 胰蛋白胨、10 g/L NaCl；YPD 培养基：10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨、40 g/L 葡萄糖；氨苄青霉素：100 mg/L；琼脂：2 g/L
2.2 质粒构建与菌株工程
本工作所用 DNA 聚合酶和限制性内切酶分别购自 TaKaRa（中国北京）和 Thermo Fisher Scientific（中国上海）。质粒使用 MultiF Seamless Assembly Mix（ABclonal Biotechnologyco，中国武汉）按照制造商说明进行组装。经密码子优化的 β-1,3-葡聚糖酶基因（CcβglI 和 CcβglS）带有 LIP2 分泌信号肽，由 GeneralBio（中国安徽）合成。为研究不同 β-1,3-葡聚糖酶在解脂耶氏酵母中的作用，使用基因特异性引物从原始质粒中扩增 CcβglI 和 CcβglS 基因片段（含 LIP2 分泌信号肽）。随后将这些片段通过 Gibson 组装与 Bsp119I 消化的 YLEP-Leu 质粒进行组装。所得构建体采用醋酸锂法转化入解脂耶氏酵母 Po1g（Cui et al., 2019）。转化子在亮氨酸缺陷型平板上筛选。为评估启动子强度对 CcβglS 表达的影响，通过 PCR 扩增、Gibson 组装和转化构建了质粒骨架 pKi-Trp-LIP2-CcβglS，以 pKi-1 质粒为亲本载体。随后，四个启动子变体（PU12、PU13、PC48 和 PUT8）用特异性引物扩增并组装到 Bsp119I 消化的 pKi-Trp-LIP2-CcβglS 质粒中。构建的质粒用 NotⅠ（限制性内切酶）消化后，采用醋酸锂法转化入解脂耶氏酵母 MB123。本研究所用质粒列于表 S2，PCR 引物序列列于表 S3，CcβglI、CcβglS、LIP2、PUT8、PC48、PU12 和 PU13 的核苷酸或氨基酸序列列于表 S4。
【数据】组装方法：Gibson 组装；限制性内切酶：Bsp119I、NotⅠ；转化方法：醋酸锂法；筛选标记：亮氨酸缺陷型
2.3 生长曲线测定
细胞在 2 mL SD 培养基中预培养 24 小时。随后将种子培养物以 2%（v/v）的接种比例接种到新鲜 SD 培养基中（12 孔板中每孔 2 mL）。培养在 Synergy HT 酶标仪（BioTek，美国）中于 30°C 连续振荡下进行，每 20 分钟监测 600 nm 处的光密度（OD600）。
【数据】预培养时间：24h；接种比例：2%（v/v）；培养体积：2 mL/孔；温度：30°C；检测波长：OD600；监测间隔：20 min
2.4 生物量测定
生物量通过测量 600 nm 处的光密度（OD600）来确定。简要地说，用新鲜培养基将培养样品适当稀释，确保吸光度读数落在分光光度计的线性范围内（0.1–0.8）。OD600 测量使用分光光度计（Shimadzu UV-1800，日本）进行。所有测量均进行三次重复。
【数据】检测波长：OD600；线性范围：0.1–0.8；重复次数：3
2.5 Western blot
Western blot 分析用于进一步确认 β-1,3-葡聚糖酶是否已成功表达并分泌到解脂耶氏酵母的培养基中。为评估 β-1,3-葡聚糖酶的分泌情况，在第 5 天收集培养上清液，并通过 10 kDa 超滤管（Merck，中国上海）浓缩 5 倍。蛋白质通过 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后转移至硝酸纤维素膜上。封闭和洗涤后，膜与小鼠抗 His-Tag 单克隆抗体（一抗）孵育，随后与 HRP 偶联的山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗孵育。蛋白质信号使用化学发光成像系统（Clinx ChemiScope 6000 Pro，Clinx，中国上海）检测，并用 Clinx ChemiCapture 成像系统成像。
【数据】上清液收集时间：第 5 天；浓缩倍数：5 倍；超滤膜截留分子量：10 kDa；SDS-PAGE 浓度：12%
2.6 逆转录定量实时 PCR（RT-qPCR）
以 YALI0D08272g（肌动蛋白编码基因，ACT1）（Borkowska et al., 2020）为内参基因，通过 RT-qPCR 分析工程菌株中 β-1,3-葡聚糖酶基因的相对表达水平。使用 TriZol 试剂（TaKaRa，中国北京）提取总 RNA，使用 SynScript®ⅢRT SuperMix（Tsingke Biotechnologyco，中国北京）合成 cDNA。逆转录获得的 cDNA 产物作为 qPCR 模板，使用 ArtiCanCEO SYBR qPCR Mix（Tsingke Biotechnologyco，中国北京）进行扩增。RT-qPCR 使用 SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa，中国北京）和 CFX96 Real-time 系统（Thermo Fisher Scientific，中国上海）进行。PCR 所用引物序列列于表 S3。
【数据】内参基因：ACT1（YALI0D08272g）；RNA 提取试剂：TriZol；qPCR 系统：CFX96 Real-time
2.7 场发射扫描电子显微镜分析
样品用 PBS 缓冲液洗涤后，加入 2.5% 戊二醛，在 4°C 冰箱中固定 3 小时。随后，用梯度浓度乙醇溶液对样品进行脱水，并用临界点干燥仪干燥。样品充分干燥并经喷金处理后，即可进行电子显微镜观察。不同样品的细胞形态通过场发射扫描电子显微镜（Quanta 250 FEG，FEI，美国）直接成像，放大倍数为 5000× 至 20000×。
【数据】固定液：2.5% 戊二醛；固定温度：4°C；固定时间：3h；放大倍数：5000×–20000×
2.8 单细胞蛋白的提取与检测
菌株在 50 mL YPD 培养基中培养 30 小时后，将培养物在 50 mL 离心管中离心收集细胞。细胞沉淀用无菌超纯水洗涤两次，然后转移至 50 mL 锥形瓶中。将细胞重悬于自溶促进剂溶液（pH = 6.0，含 2% NaCl）中，制备总体积为 20 mL 的自溶体系。锥形瓶在摇床中于 55°C、150 rpm 孵育 60 小时。自溶结束后，将混合物转移至 50 mL 离心管中离心收集上清液。总蛋白含量基于 17 种水解氨基酸的定量，使用高效液相色谱（HPLC）测定。
【数据】培养时间：30h；培养体积：50 mL YPD；自溶体系：20 mL，pH=6.0，含 2% NaCl；自溶温度：55°C；转速：150 rpm；自溶时间：60h；蛋白定量方法：HPLC 测定 17 种水解氨基酸
2.9 β-胡萝卜素的提取与检测
（1）取 500 μL 培养液离心（12,000×g，2 min），去除上清液。（2）加入两颗研磨珠（直径 2.5 mm）和 750 μL 含 0.01% BHT 的 DMSO。（3）使用高速研磨机（JXFSTPRP-24L，上海净信实业发展有限公司）研磨混合物 2 min，随后在金属浴中于 55°C 孵育 10 min。（4）孵育后加入 750 μL 丙酮，再次研磨 2 min，然后在金属浴中于 50°C 孵育 10 min。（5）将样品在 12,000×g 下离心 10 min，转移上清液至 10 mL 离心管中。重复步骤（2）–（5），直至菌体变为灰白色，以确保 β-胡萝卜素完全提取。β-胡萝卜素含量使用高效液相色谱（HPLC）（Shimadzu，日本）配 C18 色谱柱测定。
【数据】培养液体积：500 μL；离心：12,000×g，2 min；研磨珠直径：2.5 mm；DMSO 体积：750 μL（含 0.01% BHT）；研磨时间：2 min；金属浴：55°C，10 min；丙酮体积：750 μL；二次研磨：2 min；二次孵育：50°C，10 min；离心：12,000×g，10 min；检测方法：HPLC-C18 柱
2.10 β-1,3-葡聚糖酶活性测定
β-1,3-葡聚糖酶活性使用 β-1,3-葡聚糖酶检测试剂盒按照制造商说明进行测定（北京索莱宝科技有限公司，中国北京）。具体操作：取 1000 μL 培养液转移至 1.5 mL EP 管中，12,000 rpm 离心 5 min 收集细胞沉淀。随后加入 500 μL 提取缓冲液，用高速匀浆机研磨 2 min，离心收集上清液。
【数据】培养液体积：1000 μL；离心：12,000 rpm，5 min；提取缓冲液：500 μL；研磨时间：2 min
研究结果
3.1 解脂耶氏酵母中异源细胞壁裂解酶的筛选与分泌
尽管所有分离的 β-葡聚糖酶对 β-葡聚糖均具有水解活性，但只有少数酶具备诱导酵母细胞裂解的能力（Ferrer, 2006）。通过全面的文献调研，从 C. cellulans 中鉴定出两种 β-1,3-葡聚糖酶同工酶：来自 ATCC 21606 菌株的 CcβglI（GenBank：AAA25520）和来自 E4-6 菌株的 CcβglS（GenBank：AEK80404）（Ferrer, 2006; Palumbo et al., 2003）。为使这些 β-1,3-葡聚糖酶能够与酵母细胞壁直接相互作用并促进 β-1,3-葡聚糖结构的水解，将来自解脂耶氏酵母内源酯酶 LIP2（Pignède et al., 2000）的分泌信号肽融合至 CcβglI 和 CcβglS 基因的 N 端，同时在其 C 端添加 His6 标签。经密码子优化后，这些基因使用游离质粒 YLEP-Leu（Cui et al., 2019）在解脂耶氏酵母野生型 Po1g 菌株中表达，构建了在强启动子 PUT8（人工启动子 UAS1B8-TEF）控制下的 β-1,3-葡聚糖酶表达盒 YLEP-CcβglI 和 YLEP-CcβglS（图 2A）（Blazeck et al., 2011）。
为确认 β-1,3-葡聚糖酶基因盒成功整合到 Po1g 菌株中，首先对携带 YLEP-CcβglI 和 YLEP-CcβglS 的转化子使用特异性引物进行菌落 PCR。随后，每个 β-1,3-葡聚糖酶各选两个转化子（Po1g-CcβglI-1、Po1g-CcβglI-2、Po1g-CcβglS-1 和 Po1g-CcβglS-2），并验证其携带报告基因表达盒。为评估 CcβglI 和 CcβglS 的表达与分泌情况，对培养上清液进行 Western Blot 分析。如图 2B 所示，仅在 Po1g-CcβglS-1 样品中检测到约 49.4 kDa 的蛋白条带，与预期酶大小相符，表明 β-1,3-葡聚糖酶成功分泌。相比之下，Po1g-CcβglI 样品和对照中均未观察到相应条带。这一现象的原因可能是基因序列差异导致基因转录和翻译水平不同，甚至在异源宿主中无法折叠产生功能性蛋白（Jiang et al., 2024; Schmidt et al., 2023）。此外，由于游离质粒的不稳定性，同一组内不同转化子之间的基因表达可能存在高度变异。
为进一步探究，采用 RT-qPCR 分析四个选定转化子中 β-1,3-葡聚糖酶基因的表达水平。结果显示，各转化子中 CcβglI 和 CcβglS 的相对表达水平存在显著差异。具体而言，Po1g-CcβglI-1 和 Po1g-CcβglI-2 中 CcβglI 的表达水平分别比对照高 498.76 倍和 358.13 倍。同样，Po1g-CcβglS-2 中 CcβglS 的表达比对照高 264.14 倍，而 Po1g-CcβglS-1 则表现出异常高的 1696.12 倍增加（图 2C）。这些发现与 Western Blot 结果一致，表明 Po1g-CcβglS-1 更高的表达水平与更大的分泌量相关。随后，在两个工程菌株 Po1g-CcβglI-1 和 Po1g-CcβglS-1 中测定了 β-1,3-葡聚糖酶活性。Po1g-CcβglI-1 中几乎检测不到酶活性，而 Po1g-CcβglS-1 中观察到高达 1332.77 U/L 的酶活性水平（图 2D）。这些结果证实了 CcβglS 在 Po1g-CcβglS-1 菌株中的高表达和功能活性。
【数据】CcβglI 表达倍数：Po1g-CcβglI-1 为对照的 498.76 倍，Po1g-CcβglI-2 为 358.13 倍；CcβglS 表达倍数：Po1g-CcβglS-2 为 264.14 倍，Po1g-CcβglS-1 为 1696.12 倍；蛋白条带大小：约 49.4 kDa；酶活性：Po1g-CcβglS-1 为 1332.77 U/L，Po1g-CcβglI-1 几乎无活性
3.2 β-1,3-葡聚糖酶过表达对细胞生长和形态的影响
β-1,3-葡聚糖酶在解脂耶氏酵母中的表达可能促进细胞壁裂解，但也可能对细胞生长和产物合成产生潜在影响。为评估 β-1,3-葡聚糖酶分泌表达对细胞生长的影响，使用酶标仪监测了四个转化子——Po1g-CcβglI-1、Po1g-CcβglI-2、Po1g-CcβglS-1 和 Po1g-CcβglS-2——的生长曲线。结果显示，除 Po1g-CcβglS-2 外，其他转化子的迟滞期略有延长，最终生物量较对照略有降低（图 3A）。这一观察可能归因于 Po1g-CcβglS-2 中 CcβglS 的表达水平相对较低，表明 β-1,3-葡聚糖酶的高水平表达会对细胞生长产生不利影响。
本研究的主要目标是增强细胞壁通透性以促进胞内产物的提取。为评估 β-1,3-葡聚糖酶对细胞壁完整性的影响，将 Po1g-CcβglI-1 和 Po1g-CcβglS-1 在培养基中培养，并使用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）检查细胞结构。结果表明，Po1g-CcβglS-1 表现出明显的细胞表面折叠和多个裂解细胞簇，类似于自溶现象。相比之下，其他样品仅表现出部分细胞皱缩，无明显裂解（图 3B）。这些发现表明 Po1g-CcβglS-1 的细胞壁完整性受到显著损害，证实 CcβglS 的高表达增强了细胞壁的可溶性并促进细胞裂解。通过与细胞壁裂解相关的工程研究，在解脂耶氏酵母中表达与细胞壁结构相关的水解酶，可以通过促进细胞裂解来提高胞内产物的提取效率。
【数据】生长表型：Po1g-CcβglS-1 细胞表面明显折叠、多个裂解细胞簇；对照仅部分皱缩、无明显裂解
3.3 CcβglS 的分泌表达促进单细胞蛋白提取
为评估 β-1,3-葡聚糖酶表达对解脂耶氏酵母胞内产物提取效率的影响，将工程菌株 Po1g-CcβglS-1 在培养后 subjected 至自溶处理，以胞内蛋白的提取效率作为主要衡量指标。自溶是酵母细胞内源酶——如蛋白酶、核酸酶和碳水化合物水解酶——将高分子量细胞组分消化为低分子量物质，导致细胞结构溶解和胞内物质释放的过程。由于细胞形态随培养时间而变化，因此需要确定自溶处理的最佳时间点。观察发现，培养 36 小时后，Po1g-CcβglS-1 菌株的部分细胞表现出明显的表面凹陷和皱缩。到 60 和 84 小时时，大部分细胞表现出明显的皱缩，部分细胞完全裂解。相比之下，对照菌株在 36 小时时无明显表面变化，在 60 和 84 小时时仅有中等数量的细胞出现皱缩（图 4A）。
随后，选择细胞形态差异显著的时间点，即培养 36 小时的细胞，进行胞内蛋白提取研究。培养 36 小时后，使用 pH 为 6.0、含 2% NaCl 的溶液作为自溶促进剂进行自溶处理（该条件常用于酵母自溶）。自溶过程如图 4B 所示。如图 4C 所示，Po1g-CcβglS-1 的蛋白提取效率达到 53.45%，比对照提高了 17.51%（p < 0.0001）。自溶过程中的形态观察进一步证实 CcβglS 表达促进细胞裂解。Po1g-CcβglS-1 在自溶 12 小时后观察到显著的细胞碎裂，而对照仅显示极少的碎裂（图 S1）。这些结果表明，解脂耶氏酵母中 CcβglS 的高表达增强了酵母细胞壁裂解，从而提高了单细胞蛋白的提取效率。值得注意的是，CcβglS 表达同时影响生物量和总蛋白含量。Po1g-CcβglS-1 的生物量（OD600 = 12.59）略低于对照（OD600 = 14.25）（图 S2）。同样，对照的总蛋白含量（35
【数据】蛋白提取效率：Po1g-CcβglS-1 为 53.45%，对照提高 17.51%，p < 0.0001；生物量：Po1g-CcβglS-1 的 OD600 = 12.59，对照 OD600 = 14.25；自溶条件：pH 6.0、2% NaCl；自溶前培养时间：36h
3.4 CcβglS 的分泌表达促进 β-胡萝卜素提取
（本节原文节选未完整提供，以下基于摘要及结论中的相关信息进行编译）
在产 β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母工程菌株 MB123 中，研究人员将 CcβglS 基因置于不同强度的启动子（PC48 和 PUT8）控制下进行分泌表达。Western Blot 分析确认了不同启动子驱动下 CcβglS 的分泌表达情况（图 5）。结果显示，当 CcβglS 在强启动子 PC48 和 PUT8 控制下表达时，β-胡萝卜素的提取效率分别提高了 11.63% 和 21.72%，表明启动子强度对细胞壁裂解效率和产物提取具有显著影响。
【数据】β-胡萝卜素提取效率提升：PC48 启动子下 11.63%，PUT8 启动子下 21.72%
讨论与解读
本研究提出了一种通过异源表达 C. cellulans 来源的 β-1,3-葡聚糖酶基因 CcβglS 来增强解脂耶氏酵母胞内产物提取的酶学策略。研究证明，CcβglS 的表达促进了细胞裂解并提高了细胞壁可溶性，从而显著改善了胞内产物的提取效率。具体而言，单细胞蛋白和 β-胡萝卜素的提取效率分别提高了 17.51% 和 21.72%。通过实现细胞壁组分的靶向降解，该系统在温和条件下驱动细胞自发裂解。这种"自产自用"的策略降低了能源消耗和设备成本，同时消除了购买、储存和补充外源酶的相关费用。该方法符合绿色生物制造原则，支持更可持续、低碳的生物加工过程。该策略不仅适用于 β-胡萝卜素和单细胞蛋白，还可推广至虾青素、角鲨烯和多不饱和脂肪酸等多种高价值胞内化合物，并可适配于其他与解脂耶氏酵母结构相似的厚壁微生物。值得注意的是，CcβglS 表达水平越高，产物提取效率越高，但也对细胞生长产生明显的抑制效应，最终损害产物的总体积累。这一观察提示，高强度动态调控可能是平衡细胞生长与产物提取的关键方向。
编译者解读
从合成生物学应用角度看，这项工作的核心价值在于将"细胞壁裂解"这一下游单元操作内化为菌株自身的遗传性状——以分泌型 β-1,3-葡聚糖酶实现"自产自用"的温和自溶，避免机械破碎的高能耗和外源酶添加的额外成本。CcβglS 与 CcβglI 的对比筛选也提示，同源酶的异源表达效果差异巨大，酶筛选与密码子优化仍是此类策略的关键前置环节。局限在于高表达带来的生长抑制与产物提取效率之间存在 trade-off，未来若能引入诱导型或自调控启动子，在发酵后期再启动细胞壁弱化，将更有利于兼顾生物量与提取效率。该策略向虾青素、角鲨烯等其他胞内产物的推广值得期待。
参考来源
Yan J. Boosting intracellular product extraction in Yarrowia lipolytica via secretory expression of β-1,3-glucanase for cell wall lysis. Food Bioscience, 2025. DOI: 10.1016/j.fbio.2025.107693
DOI: 10.1016/j.fbio.2025.107693