来源：High-titer de novo raspberry ketone production in Yarrowia lipolytica via precursor supply engineering and fed-batch fermentation optimization（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
覆盆子酮（RK）是高端香料市场的重要芳香化合物，但微生物从头合成长期受限于L-酪氨酸与丙二酰辅酶A的前体供给失衡。本研究以解脂耶氏酵母为底盘，通过26S rDNA多拷贝整合构建RK合成途径，系统强化莽草酸途径、磷酸戊糖途径（PPP）及丙二酰辅酶A供给，最终在5-L补料分批发酵中实现7.24 g/L RK产量——据已发表文献，这是目前微生物发酵从头合成RK的最高报道水平。
研究背景
覆盆子酮天然存在于覆盆子等浆果中，但植物组织中含量极低（通常仅每公斤鲜重几毫克），依赖植物提取的"天然"RK成本高昂且供应有限。化学合成虽可降低成本，但依赖石油化工原料和多步有机反应，难以满足监管与消费者对"天然""绿色"成分的需求。在植物中，RK由对香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A经苯丙烷-聚酮途径合成，该途径已在多种微生物中重构。然而，前体L-酪氨酸与丙二酰辅酶A供给失衡是限制RK微生物从头合成的主要瓶颈。本研究选择解脂耶氏酵母作为底盘，因其具备从葡萄糖合成酪氨酸的内源代谢能力，且脂肪酸代谢途径可为丙二酰辅酶A供给提供潜在支撑。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养基
大肠杆菌JM109用于质粒构建与扩增。细菌菌株在37°C、250 rpm振荡的Luria–Bertani（LB）液体培养基（10 g/L NaCl、10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物）中培养，或在37°C的LB琼脂平板上培养。需要时，氨苄青霉素以100 mg/L的终浓度加入培养基。野生型解脂耶氏酵母Po1f作为基础菌株。解脂耶氏酵母菌株在YPD液体培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）、合成缺陷型（SD）培养基（1.7 g/L酵母氮碱、5 g/L硫酸铵、20 g/L葡萄糖）中培养，或在30°C下于添加2 g/L琼脂的平板上培养。所有重组菌株与质粒的详细信息见补充材料。
【数据】培养基：LB/YPD/SD；温度：37°C（大肠杆菌）/30°C（解脂耶氏酵母）；转速：250 rpm；氨苄青霉素：100 mg/L；琼脂：2 g/L
2.2 质粒构建与菌株工程
质粒在大肠杆菌JM109中通过一步无缝克隆（AB克隆）组装，使用ClonExpress II One Step Cloning Kit（Vazyme Biotech，南京，中国）。PCR扩增使用2× Phanta Flash Master Mix（Dye Plus）（P520/P525）或2× Rapid Taq Master Mix（P222）（Vazyme Biotech，南京，中国）。途径构建所用基因与遗传元件通过基因合成或PCR扩增获得。de novo RK途径包含酪氨酸解氨酶（FjTAL，来源于黄杆菌Flavobacterium johnsoniae）、4-香豆酸辅酶A连接酶（Pc4CL，来源于欧芹Petroselinum crispum）、苯甲酰丙酮合酶（RpBAS，来源于大黄Rheum palmatum）和覆盆子酮合酶（RiRZS1，来源于覆盆子Rubus idaeus）。此外，编码BauA（来源于铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa）和MCR-C（来源于绿弯菌Chloroflexus aurantiacus）的基因经合成以增强胞内丙二酰辅酶A前体供给。上述所有异源基因均针对解脂耶氏酵母进行密码子优化，由GENEWIZ（苏州，中国）合成。用于表达与基因组工程的内源遗传元件从解脂耶氏酵母Po1f基因组DNA扩增获得，包括启动子（pTEF-in、php4d、pTDH1）、终止子（tCYC1、tXPR2、tLIP2）、26S rDNA靶向整合区域，以及用于基因删除的5'/3'侧翼同源臂（涉及TRP2、PHA2、DGA1、DGA2、ARE2）。用于途径优化与代谢流重布的内源基因同样从Po1f基因组DNA扩增，包括YlARO1、TAL1、TKL1、TKTA、ZWF1、GND1、POX1–POX6、FAA1、ACC1、POT1、MFE1。在解脂耶氏酵母中，非同源末端连接（NHEJ）占主导地位。为提高基因靶向效率，敲除了ku70以破坏NHEJ通路。基因组整合时，相应整合盒转化至指示宿主菌株。rDNA定向整合时，表达盒两侧翼为26S rDNA同源臂，以线性DNA片段形式导入以促进整合至26S rDNA重复序列。通过迭代转化实现多拷贝整合（菌株构建期间两轮，另加一轮增强L-酪氨酸向PCA转化）。正确整合通过基因组DNA提取与PCR验证。使用LoxP位点侧翼的URA3筛选标记时，通过pYLXP′-Cre瞬时表达Cre重组酶实现标记回收。引物序列见补充材料。
【数据】无缝克隆试剂盒：ClonExpress II；PCR酶：Phanta Flash Master Mix/Rapid Taq Master Mix；异源基因来源：FjTAL（F. johnsoniae）、Pc4CL（P. crispum）、RpBAS（R. palmatum）、RiRZS1（R. idaeus）、BauA（P. aeruginosa）、MCR-C（C. aurantiacus）；整合策略：26S rDNA多拷贝迭代整合；NHEJ抑制：ku70敲除
2.3 24孔板与摇瓶发酵
随机挑取单菌落接种至含4 mL YPD培养基的24深孔板（聚丙烯，每孔7 mL；顺丰医疗，中国），30°C、250 rpm振荡培养16 h制备种子液。种子液以5%（v/v）初始接种量转接至含4 mL YPD培养基的新鲜24孔板中进行发酵。72 h后，使用紫外-可见分光光度计（Shimadzu，京都，日本）测定OD600以评估细胞生长，并取样进行高效液相色谱（HPLC）分析。摇瓶发酵时，种子液转接至含50 mL YPD培养基的250 mL摇瓶中，初始OD600为0.3，30°C、250 rpm振荡培养5天。
【数据】24孔板装液量：4 mL；接种量：5%（v/v）；发酵时间：72 h；摇瓶装液量：50 mL/250 mL瓶；初始OD600：0.3；摇瓶发酵时间：5天；温度：30°C；转速：250 rpm
2.4 生物反应器发酵
补料分批发酵采用两级种子培养。从YPD平板挑取单菌落接种至50 mL锥形瓶中的10 mL YPD，30°C、250 rpm培养24 h。随后以5%（v/v）转接至100 mL YPD，30°C、250 rpm培养12–16 h，用于接种生物反应器。补料分批发酵在5 L生物反应器（Bioflo115, Eppendorf, Enfield, CT, USA）中进行。初始发酵以2 L培养基完成，含10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、50 g/L葡萄糖和3 mL/L维生素溶液。温度维持30°C，溶氧通过200–600 rpm级联搅拌控制为35%。空气以4 L/min通入发酵罐。pH通过流加8 M KOH维持为5，泡沫通过添加antifoam 204（Sigma-Aldrich）预防。每12 h取样测定OD600、葡萄糖浓度和RK滴度。共采用四种不同的流加策略。策略一：初始培养基以葡萄糖为碳源，葡萄糖完全耗尽后，将浓缩葡萄糖溶液（800 g/L）一次性脉冲补入反应器，使葡萄糖浓度恢复至50 g/L。策略二：初始培养基中葡萄糖耗尽后，以恒定流速补加800 g/L葡萄糖溶液，流速调节以维持发酵液中残余葡萄糖浓度在5–10 g/L。策略三：保留策略二的葡萄糖流加方式，同时每12 h以批次方式补加10× YP补料溶液（含100 g/L酵母提取物和50 g/L蛋白胨）。策略四：采用与策略三相同的葡萄糖和10× YP流加方式，但初始培养基改为无机盐培养基（IS培养基），含50 g/L葡萄糖、5.0 g/L (NH4)2SO4、3.5 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O和3 mL/L维生素溶液。
【数据】反应器规模：5 L；初始装液量：2 L；温度：30°C；溶氧：35%；通气量：4 L/min；pH：5（8 M KOH维持）；取样间隔：12 h；葡萄糖补料浓度：800 g/L；策略一补料：脉冲至50 g/L；策略二残余葡萄糖：5–10 g/L；10× YP补料：100 g/L酵母提取物+50 g/L蛋白胨，每12 h；IS培养基：50 g/L葡萄糖、5.0 g/L (NH4)2SO4、3.5 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O、3 mL/L维生素溶液
2.5 HPLC与GC–MS分析方法
发酵液与甲醇按1:1（v/v）混合，室温振荡30 min。离心（12,000 rpm，10 min）后，上清经0.22 μm滤膜过滤进行分析。RK、PCA、L-酪氨酸和4-羟基苯甲酰丙酮通过HPLC-UV（Agilent 1260，Agilent Technologies）定量，使用外标法校准，标准品来源：RK（Aladdin，CAS 5471–51-2）、PCA（Aladdin，C108514）、L-酪氨酸（Macklin，T6229）、4-羟基苯甲酰丙酮（Yuanye，S84889）。RK、PCA和4-羟基苯甲酰丙酮在Platisil ODS C18色谱柱（5 μm，4.6 × 250 mm）上于45°C分离（1.0 mL/min），检测波长290 nm，等度流动相为70%水（含0.3%磷酸）和30%甲醇（v/v）。L-酪氨酸在相同色谱柱上于30°C（0.8 mL/min）分析，检测波长280 nm，流动相为90% 0.1 mol/L乙酸钠缓冲液（pH 4.0）和10%甲醇（v/v）。RK身份进一步通过GC–MS确认。
【数据】萃取：甲醇1:1（v/v），室温30 min；离心：12,000 rpm，10 min；滤膜：0.22 μm；HPLC柱：Platisil ODS C18（5 μm，4.6 × 250 mm）；RK/PCA/HBA检测：45°C，290 nm，1.0 mL/min；L-酪氨酸检测：30°C，280 nm，0.8 mL/min
研究结果
3.1 解脂耶氏酵母中de novo RK生物合成途径的构建
前期研究已确定PCA是RK生物合成途径的关键前体，持续升高PCA水平可增强RK生成。考虑到解脂耶氏酵母能从葡萄糖合成酪氨酸，通过将酪氨酸转化为PCA即可实现PCA的从头合成。为此，将来源于F. johnsoniae的FjTAL基因多拷贝整合至解脂耶氏酵母26S rDNA位点，并在强组成型启动子pTEF-in下表达，以同时提高基因拷贝数和转录水平（图1a、b）。为筛选具有高PCA滴度的最优整合菌株，选取96个转化子进行培养，并通过HPLC测定PCA滴度。其中，96个转化子中有77个（80.2%）积累可检测的PCA，17株产生超过150 mg/L PCA。随机选取一株转化子在摇瓶中培养120 h，表征其生长曲线与PCA积累情况。时间进程发酵显示，OD600和PCA滴度在前72 h内持续上升，之后下降（图1c）。据此，72 h被确定为摇瓶发酵中PCA定量的标准取样时间点。在此基础上，对17株高PCA转化子进行摇瓶复筛，测定PCA滴度与OD600。各转化子间OD600差异很小，表明PCA滴度差异基本与生物量积累无关。PCA16菌株获得最高PCA滴度，达524.1 mg/L（图1d）。
以PCA16为底盘菌株，随后引入从PCA到RK的三步途径。根据Xu等人报道的26S rDNA-Cre/loxP多拷贝迭代整合框架，该策略在不干扰已有插入片段的前提下可实现80%以上的整合效率。因此，将三个异源基因——Pc4CL、RpBAS和RiRZS1——整合至26S rDNA位点（图1a）。96个转化子在24深孔板中进行初筛，检测RK积累，其中12个转化子产量超过50 mg/L，所有样品中均未检测到HBA。基于摇瓶培养72 h时OD600和RK滴度均出现峰值（图1e），该时间点被确定为RK产量比较的标准时间点。在此基础上，选取12株高RK转化子，摇瓶发酵72 h后定量OD600和RK产量。各菌株生物量水平相当，表明RK途径过表达和RK积累未显著抑制细胞生长。最终，T6菌株获得最高RK滴度，达170.2 mg/L（图1f）。RK身份通过GC–MS（EI）分析确认，发酵提取物与标准品均在m/z 164.08318（M+）和107.04915处显示匹配的分子离子峰。总体而言，通过在26S rDNA位点的迭代整合，RK生物合成途径在解脂耶氏酵母中成功构建，有效增强了PCA供应并实现了de novo RK生产。
【数据】PCA阳性转化子比例：77/96（80.2%）；>150 mg/L PCA菌株数：17株；PCA16最高PCA滴度：524.1 mg/L；标准取样时间：72 h；>50 mg/L RK转化子数：12株；T6最高RK滴度：170.2 mg/L；GC–MS特征离子：m/z 164.08318（M+）、107.04915
3.2 莽草酸途径工程增强L-酪氨酸供给
已有报道指出，补充前体L-酪氨酸可促进类黄酮生物合成。为评估L-酪氨酸供应是否限制RK生产，在T6菌株发酵过程中添加200 mg/L L-酪氨酸。结果表明，L-酪氨酸缺乏是de novo RK生物合成的关键限制因素。添加L-酪氨酸后，各测试菌株的RK产量均有所提升，相对增幅为17.4%至69.0%（图1f和图2a）。其中T6菌株的RK滴度提升最大，达285.9 mg/L（图2a）。因此，该菌株被选为进一步改造的底盘，命名为RK-1。
色氨酸和苯丙氨酸的生物合成与L-酪氨酸形成竞争代谢流（图2b）。为将更多代谢流导向L-酪氨酸，在RK-1中分别敲除邻氨基苯甲酸合酶（ylTRP2）和预苯酸脱水酶（ylPHA2）以阻断色氨酸和苯丙氨酸的生成，获得菌株RK-2和RK-3。摇瓶发酵72 h后，RK-2中L-酪氨酸滴度达880.2 mg/L，RK-3中达930.8 mg/L，分别较亲本菌株RK-1（720.1 mg/L L-酪氨酸）提高1.22倍和1.29倍（图2c）。RK-2（OD600 20.99）和RK-3（OD600 21.02）的OD600较RK-1（22.05）分别下降4.8%和4.7%，表明ylTRP2或ylPHA2敲除带来的生长代价极小。相同条件下，RK-2的RK滴度增至216.7 mg/L，RK-3增至230.8 mg/L，较未补充酪氨酸的RK-1显著提升，证实两种敲除均通过增加L-酪氨酸供应有效增强RK生物合成。为实现分步比较，后续工程沿基于RK-2和RK-3的两条预设菌株谱系进行。
过量L-酪氨酸抑制DAHP合酶活性，从而限制酪氨酸供应（图2b）。因此，解除莽草酸途径入口步骤的反馈抑制被认为是改善L-酪氨酸供应的有前景策略。为此，将来源于酿酒酵母的反馈抗性DAHP合酶ScARO4K229L和ScARO3K222L分别引入RK-2，获得菌株RK-4和RK-5。RK-4和RK-5分别积累1,100.2和1,090.6 mg/L L-酪氨酸，较RK-2分别提高1.25倍和1.24倍（图2c）。然而，仅RK-4显著提升RK产量，达277.6 mg/L——较RK-2提高1.28倍——而RK-5仅显示微弱提升（219.9 mg/L）。同时，两株菌均表现出生长减缓，OD600较RK-2（20.99）分别下降10.5%（RK-4）和13.1%（RK-5），提示表达反馈抗性DAHP合酶伴随轻微生长代价。
此外，为增强从DAHP到L-酪氨酸的代谢流（图2b），在RK-3中分别过表达来自酿酒酵母的反馈不敏感分支酸变位酶ScARO7G141S和内源AROM五功能酶YlARO1，获得菌株RK-6和RK-7。RK-6和RK-7的L-酪氨酸滴度分别降低11.8%和2.2%（图2c），表明仅加强下游步骤不足以提升L-酪氨酸产量，上游途径调控可能仍是限制因素。相比之下，引入反馈抗性DAHP合酶显著改善了L-酪氨酸积累，支持通过入口点去抑制增加前体供给的可行性。然而，加强下游莽草酸途径对RK合成仍然有利。具体而言，RK-6的RK滴度达338.1 mg/L，较RK-3提高1.47倍，而RK-7仅产生225.8 mg/L RK——较RK-3下降2.2%（图2c）。
为进一步增强向L-酪氨酸合成的代谢流，在RK-4基础上共表达ScARO3K222L、ScARO7G141S和YlARO1，并敲除PHA2，获得菌株RK-8、RK-9和RK-10。RK-8产生344.7 mg/L RK——较RK-4提高24.2%——而L-酪氨酸降至880.2 mg/L（图2c）。这一模式表明，提高途径通量可促进前体更快转化为RK，而非积累游离L-酪氨酸。
【数据】L-酪氨酸添加量：200 mg/L；RK提升幅度：17.4%–69.0%；T6+L-酪氨酸RK：285.9 mg/L；RK-2 L-酪氨酸：880.2 mg/L（1.22倍）；RK-3 L-酪氨酸：930.8 mg/L（1.29倍）；RK-1 L-酪氨酸：720.1 mg/L；RK-2 OD600：20.99（-4.8%）；RK-3 OD600：21.02（-4.7%）；RK-1 OD600：22.05；RK-2 RK：216.7 mg/L；RK-3 RK：230.8 mg/L；RK-4 L-酪氨酸：1,100.2 mg/L（1.25倍）；RK-5 L-酪氨酸：1,090.6 mg/L（1.24倍）；RK-4 RK：277.6 mg/L（1.28倍）；RK-5 RK：219.9 mg/L；RK-4 OD600下降：10.5%；RK-5 OD600下降：13.1%；RK-6 L-酪氨酸变化：-11.8%；RK-7 L-酪氨酸变化：-2.2%；RK-6 RK：338.1 mg/L（1.47倍）；RK-7 RK：225.8 mg/L（-2.2%）；RK-8 RK：344.7 mg/L（+24.2%）；RK-8 L-酪氨酸：880.2 mg/L
3.3 磷酸戊糖途径工程增强E4P与NADPH供给
L-酪氨酸的合成需要莽草酸途径的两种关键前体：磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）。在解脂耶氏酵母中，PEP由糖酵解途径提供，而E4P来源于PPP的非氧化阶段。此外，L-酪氨酸的生物合成需要NADPH作为辅因子。因此，增强PPP的氧化和非氧化分支，有望同时增加E4P和NADPH的供给，从而促进L-酪氨酸合成（图3a）。为提高E4P供应，在RK-8中分别过表达转酮醇酶基因TAL1、TKL1和TKTA，获得菌株RK-11、RK-12和RK-13。同时，为增强NADPH再生，在RK-8中分别过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶ZWF1和6-磷酸葡糖酸脱氢酶GND1，获得菌株RK-14和RK-15。摇瓶发酵72 h后，RK-11的RK滴度最高，达373.2 mg/L，较RK-8（344.7 mg/L）提高8.3%（图3b）。RK-12和RK-13的RK滴度分别为348.6 mg/L和352.5 mg/L，与RK-8相比无显著提升。在NADPH供给方面，RK-14和RK-15的RK滴度分别为362.3 mg/L和341.8 mg/L，均未超过RK-11。上述结果表明，过表达TAL1以增强E4P供给是提升RK产量的最有效策略。
为进一步提高前体供给，将TAL1过表达与ZWF1过表达进行组合。在RK-11基础上过表达ZWF1，获得菌株RK-16。RK-16的RK滴度达398.5 mg/L，较RK-11提高6.8%（图3b）。同时，L-酪氨酸滴度在RK-16中为1,270.6 mg/L，表明通过PPP工程同时增强了E4P和NADPH供给，有效促进了L-酪氨酸合成与RK生产。
【数据】RK-11 RK：373.2 mg/L（+8.3%）；RK-12 RK：348.6 mg/L；RK-13 RK：352.5 mg/L；RK-14 RK：362.3 mg/L；RK-15 RK：341.8 mg/L；RK-16 RK：398.5 mg/L（+6.8%）；RK-16 L-酪氨酸：1,270.6 mg/L
3.4 增强L-酪氨酸向PCA转化以强化前体供给
在RK-16中，L-酪氨酸积累达1,270.6 mg/L，而PCA和RK滴度分别为76.7 mg/L和398.5 mg/L。L-酪氨酸的大量积累提示，从L-酪氨酸到PCA的转化可能是一个潜在的限速步骤（图4a）。为此，我们评估了L-酪氨酸向PCA转化是否为RK-19中的限速步骤。在RK-16基础上，通过26S rDNA迭代整合额外增加一轮FjTAL拷贝，获得菌株RK-17、RK-18和RK-19。摇瓶发酵72 h后，RK-17、RK-18和RK-19的L-酪氨酸滴度分别为1,150.3、1,090.8和1,020.5 mg/L，均低于RK-16（1,270.6 mg/L），而PCA滴度分别提升至152.3、183.6和210.4 mg/L。其中RK-19的RK滴度最高，达548.3 mg/L，较RK-16（398.5 mg/L）提高37.6%（图4b）。这一结果表明，增加FjTAL拷贝数有效促进了L-酪氨酸向PCA的转化，减少了L-酪氨酸积累，并显著提升了RK产量。
为进一步筛选高RK生产菌株，从24孔板初筛中选取20株高RK转化子进行摇瓶复筛。复筛结果显示，RK-19的RK滴度最高，达548.3 mg/L，OD600为18.5。部分转化子的RK滴度在500–548 mg/L范围内，表明多拷贝FjTAL整合策略的菌株间差异较小，策略具有较好的可重复性。
【数据】RK-16 L-酪氨酸：1,270.6 mg/L；RK-16 PCA：76.7 mg/L；RK-16 RK：398.5 mg/L；RK-17 L-酪氨酸：1,150.3 mg/L；RK-18 L-酪氨酸：1,090.8 mg/L；RK-19 L-酪氨酸：1,020.5 mg/L；RK-17 PCA：152.3 mg/L；RK-18 PCA：183.6 mg/L；RK-19 PCA：210.4 mg/L；RK-19 RK：548.3 mg/L（+37.6%）；RK-19 OD600：18.5
3.5 脂质代谢工程与非羧化丙二酰辅酶A模块增强丙二酰辅酶A供给
丙二酰辅酶A是RK生物合成的另一关键前体。在解脂耶氏酵母中，丙二酰辅酶A主要由乙酰辅酶A经乙酰辅酶A羧化酶（ACC1）催化生成。然而，胞内丙二酰辅酶A的供应往往不足以支撑聚酮类化合物的高效合成。为增强丙二酰辅酶A供给，本研究从三个层面进行工程改造（图5a）：（i）强化β-氧化途径以增加乙酰辅酶A供应；（ii）引入非羧化丙二酰辅酶A途径（NCM模块）；（iii）减少中性脂质储存以释放更多丙二酰辅酶A。
首先，为强化β-氧化途径，在RK-19中过表达酰基辅酶A氧化酶基因POX1–POX6，获得菌株RK-20至RK-25。摇瓶发酵72 h后，RK-20（过表达POX1）的RK滴度最高，达566.6 mg/L，较RK-19（548.3 mg/L）提高3.3%。RK-21至RK-25的RK滴度分别为558.2、552.7、549.8、551.3和547.6 mg/L，与RK-19相比提升不显著。同时，过表达POX1的菌株RK-20中，PCA滴度为496.3 mg/L，L-酪氨酸滴度为310.2 mg/L，表明β-氧化强化有效促进了脂质降解并增加了乙酰辅酶A供应。
其次，为引入非羧化丙二酰辅酶A途径，将来源于铜绿假单胞菌的BauA和来源于绿弯菌的MCR-C在RK-20中共同表达，获得菌株RK-26。RK-26的RK滴度达583.4 mg/L，较RK-20提高3.0%。这一结果表明，NCM模块能够绕过ACC1催化的羧化反应，通过非羧化途径直接合成丙二酰辅酶A，有效补充了丙二酰辅酶A池。
第三，为减少中性脂质储存，在RK-20中分别敲除DGA1、DGA2和ARE2基因，获得菌株RK-27、RK-28和RK-29。其中，RK-27（敲除DGA1）的RK滴度最高，达612.8 mg/L，较RK-20提高8.2%。RK-28和RK-29的RK滴度分别为598.3和590.5 mg/L。三株菌的脂质含量均有所下降，表明减少中性脂质储存可释放更多丙二酰辅酶A用于RK合成。
最后，将上述最优策略进行组合。在RK-27基础上，同时过表达BauA和MCR-C，获得菌株RK-30。RK-30的RK滴度达638.5 mg/L，较RK-27提高4.2%。进一步在RK-30中过表达ACC1，获得菌株RK-31。RK-31的RK滴度达652.7 mg/L，较RK-30提高2.2%。然而，RK-31的OD600较RK-19下降12.3%，表明多轮代谢工程改造对细胞生长产生了一定负担。综合最优策略后，菌株RK-31的RK产量较初始菌株T6（170.2 mg/L）提高2.83倍，较RK-19（548.3 mg/L）提高19.0%。
【数据】RK-20（POX1过表达）RK：566.6 mg/L（+3.3%）；RK-21 RK：558.2 mg/L；RK-22 RK：552.7 mg/L；RK-23 RK：549.8 mg/L；RK-24 RK：551.3 mg/L；RK-25 RK：547.6 mg/L；RK-20 PCA：496.3 mg/L；RK-20 L-酪氨酸：310.2 mg/L；RK-26（BauA+MCR-C）RK：583.4 mg/L（+3.0%）；RK-27（ΔDGA1）RK：612.8 mg/L（+8.2%）；RK-28（ΔDGA2）RK：598.3 mg/L；RK-29（ΔARE2）RK：590.5 mg/L；RK-30（ΔDGA1+BauA+MCR-C）RK：638.5 mg/L（+4.2%）；RK-31（RK-30+ACC1）RK：652.7 mg/L（+2.2%）；RK-31 OD600较RK-19下降：12.3%；RK-31较T6提升：2.83倍
3.6 5-L补料分批发酵优化
在摇瓶水平获得高产菌株RK-31后，进一步在5-L生物反应器中评估其补料分批发酵性能。首先采用策略一（葡萄糖脉冲补料）进行发酵。初始培养基含50 g/L葡萄糖，葡萄糖耗尽后一次性补加800 g/L葡萄糖溶液至50 g/L。发酵过程中，RK滴度随发酵时间持续上升，至144 h时达到最高值2,480 mg/L，OD600为45.2（图6a）。然而，葡萄糖脉冲补料导致葡萄糖浓度剧烈波动，可能对细胞代谢造成冲击。
为提高RK产量，采用策略二（恒速流加葡萄糖）进行发酵。葡萄糖耗尽后，以恒定流速补加800 g/L葡萄糖溶液，维持残余葡萄糖浓度在5–10 g/L。发酵至168 h时，RK滴度达3,650 mg/L，较策略一提高47.2%。OD600为52.8。这一结果表明，恒速流加策略有效避免了葡萄糖浓度的剧烈波动，有利于细胞生长和RK合成。
为进一步提升RK产量，采用策略三（葡萄糖恒速流加+10× YP批次补料）进行发酵。在策略二的基础上，每12 h补加10× YP溶液（含100 g/L酵母提取物和50 g/L蛋白胨）。发酵至192 h时，RK滴度达5,120 mg/L，较策略二提高40.3%。OD600为58.6。氮源的补充有效延长了细胞生长和产物合成周期。
最后，采用策略四（IS培养基+葡萄糖恒速流加+10× YP批次补料）进行发酵。将初始培养基替换为IS培养基（含50 g/L葡萄糖、5.0 g/L (NH4)2SO4、3.5 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O和3 mL/L维生素溶液），流加方式与策略三相同。发酵至216 h时，RK滴度达7.24 g/L，较策略三提高41.4%。OD600为62.5。这一结果表明，无机盐培养基有效减少了初始培养基中的有机氮源消耗，配合恒速葡萄糖流加和定期氮源补加，实现了RK的高效合成。最终，在最优发酵条件下，RK滴度达7.24 g/L，较初始摇瓶菌株T6（170.2 mg/L）提高42.5倍。
【数据】策略一最高RK：2,480 mg/L（144 h）；策略一OD600：45.2；策略二最高RK：3,650 mg/L（168 h，+47.2%）；策略二OD600：52.8；策略三最高RK：5,120 mg/L（192 h，+40.3%）；策略三OD600：58.6；策略四最高RK：7.24 g/L（216 h，+41.4%）；策略四OD600：62.5；较T6提升：42.5倍
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程与发酵工艺优化的协同策略，在解脂耶氏酵母中实现了覆盆子酮的高效从头合成。研究首先在26S rDNA位点迭代整合RK生物合成途径，获得170.2 mg/L的初始产量。莽草酸途径强化（解除反馈抑制、阻断竞争分支）将L-酪氨酸供给提升至1,270.6 mg/L，RK产量提高至373.2 mg/L。PPP工程通过增强E4P和NADPH供给，进一步将RK提升至548.3 mg/L。增强L-酪氨酸向PCA转化后RK达566.6 mg/L。脂质代谢工程（β-氧化强化、非羧化丙二酰辅酶A途径、中性脂质储存减少）将RK提升至652.7 mg/L。5-L补料分批发酵中，通过碳源流加策略优化、初始培养基替换和氮源补加，最终实现7.24 g/L RK——据已发表文献，这是微生物发酵从头合成RK的最高报道滴度。上述结果证实了解脂耶氏酵母作为高水平RK生物合成平台的潜力，为工业化应用奠定了实践基础。
编译者解读
本研究展示了典型的"途径构建—前体供给—发酵工艺"三段式合成生物学研发范式。值得关注的是，研究者并未止步于单一途径强化，而是精准识别了L-酪氨酸和丙二酰辅酶A两大前体瓶颈，并通过多模块协同工程逐一击破。非羧化丙二酰辅酶A途径的引入尤为巧妙——绕过ACC1的羧化反应直接合成丙二酰辅酶A，为聚酮类化合物生产提供了新思路。从170.2 mg/L到7.24 g/L的42.5倍提升，体现了系统级代谢工程的累积效应。不过，多轮工程改造导致的生长负担（OD600下降12.3%）提示，未来可借助动态调控或适应性进化进一步平衡细胞生长与产物合成。该研究为其他依赖双前体的天然产物微生物合成提供了可借鉴的工程范式。
参考来源
Li, Y. (2026). High-titer de novo raspberry ketone production in Yarrowia lipolytica via precursor supply engineering and fed-batch fermentation optimization. Bioresource Technology. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134232
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134232