来源：Phytosphingosine promotes intracellular microbial lipid accumulation and cell structure remodeling during adaptive evolution combined with cell fractionation in wild-type Yarrowia lipolytica DSM 3286（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
微生物脂质作为传统动植物油脂的替代品，在可持续生物制造领域备受关注。然而，野生型产油酵母的脂质含量普遍偏低，制约了工业化应用。本研究在前期开发的基于离心分离的适应性实验室进化（ALECF）基础上，创新性地引入植物鞘氨醇——一种参与酵母细胞壁完整性信号通路的生物活性长链氨基醇，仅需8轮传代即可将野生型解脂耶氏酵母DSM 3286的胞内脂质含量从31.2%提升至77.2%，细胞体积扩大6.9倍，细胞壁主要组分显著降低。转录组分析揭示了植物鞘氨醇对鞘脂代谢、细胞壁完整性和碳代谢通路的调控机制，为产油微生物的定向进化提供了全新策略。
研究背景
微生物脂质凭借不受环境制约、不依赖农田、生产周期短和易于规模化等固有优势，成为传统植物油脂和动物油脂的优质替代品。能够积累占生物量20%以上胞内脂质的细菌、酵母、微藻和丝状真菌被定义为产油微生物。其中，产油酵母因其强大的胁迫耐受性、广泛的底物利用能力和优异的发酵规模化特性，被视为微生物脂质生产的理想细胞工厂。
野生型产油酵母脂质含量相对较低，难以满足工业应用需求。虽然"推-拉-阻断"代谢工程策略能够提升产油酵母的脂质积累能力，但工程菌株通常表现出细胞生长与脂质积累之间的失衡、糖代谢受损、辅因子和前体及能量供应不足、环境胁迫耐受性降低等问题，最终导致脂质生产效率低下。适应性实验室进化（ALE）通过在受控实验室条件下人工选择和富集有益突变，为获得具有目标性状的进化菌株提供了创新途径。
本研究在前期建立的ALECF方法基础上，引入植物鞘氨醇这一细胞壁完整性调控分子，旨在加速野生型解脂耶氏酵母的脂质积累进化过程，并探究其潜在的分子机制。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究所用亲本菌株为野生型解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）DSM 3286。菌株活化采用YPD培养基。用于ALECF的合成培养基包含：90.0 g/L葡萄糖、0.44 g/L (NH₄)₂SO₄、1.0 g/L KH₂PO₄、1.0 g/L MgSO₄·7H₂O、1.0 g/L酵母提取物，以及50 µM植物鞘氨醇。
【数据】菌株：Y. lipolytica DSM 3286；葡萄糖：90.0 g/L；(NH₄)₂SO₄：0.44 g/L；KH₂PO₄：1.0 g/L；MgSO₄·7H₂O：1.0 g/L；酵母提取物：1.0 g/L；植物鞘氨醇：50 µM
2.2 基于离心分离的适应性实验室进化（ALECF）
将Y. lipolytica DSM 3286菌株在YPD培养基中、30°C、200 rpm条件下活化24 h作为种子液。将种子液按10%（v/v）比例接种至50 mL合成培养基中，随后在30°C、200 rpm条件下培养144 h。取20 mL培养液转移至50 mL离心管中进行离心分离（Avanti J−26 XP，Beckman Coulter，美国布雷亚）。然后，将5 mL上层培养液转移至50 mL新鲜合成培养基中进行下一轮培养与分离。离心力从0 g逐步增加至53,300 g（离心机最大离心力）。
【数据】活化温度：30°C；转速：200 rpm；活化时间：24h；接种比例：10%（v/v）；培养体积：50 mL；培养时间：144h；离心取液量：20 mL；上层转移量：5 mL；离心力范围：0–53,300 g
2.3 细胞形态观察
使用光学显微镜（Olympus BX43，日本）观察细胞形态。细胞经洗涤、固定、脱水、干燥后，使用场发射扫描电子显微镜（FESEM，JSM-IT800，JEOL，日本）进行观察。
【数据】显微镜型号：Olympus BX43；FESEM型号：JSM-IT800
2.4 BODIPY 493/503荧光染色检测胞内脂滴
采用BODIPY 493/503荧光染色法可视化Y. lipolytica胞内脂滴。简要步骤如下：取1 mL酵母培养液，室温下10,000 g离心5 min收集细胞。弃去上清液，用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞沉淀两次。洗涤后的细胞沉淀重悬于500 μL PBS中。将BODIPY 493/503染料溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制10 mM储备液，于−20°C避光保存。使用前，将储备液用PBS按1:1000比例稀释，得到10 μM工作液。随后，将50 μL重悬细胞悬液加入1 mL BODIPY 493/503工作液中。混合物在30°C避光孵育30 min，每10 min温和颠倒混匀一次，确保染色均匀。
【数据】离心：10,000 g，5 min，室温；PBS洗涤：2次，1 mL/次；重悬体积：500 μL PBS；BODIPY储备液：10 mM（DMSO溶解）；稀释比例：1:1000；工作液浓度：10 μM；染色体系：50 μL细胞悬液+1 mL工作液；孵育条件：30°C，30 min，避光
2.5 转录组分析
ALECF完成后，将培养液稀释并涂布于YPD平板上。挑取单菌落接种于合成培养基中培养24 h作为种子液。将种子液接种至三个独立摇瓶的新鲜合成培养基中，培养24 h。通过过滤收集细胞。细胞沉淀立即用液氮速冻，并保存于−80°C。转录组测序由北京擎科生物科技有限公司在Illumina测序平台上完成。
【数据】种子培养时间：24h；独立摇瓶数：3个；培养时间：24h；保存温度：−80°C；测序平台：Illumina
2.6 统计分析
结果以平均值±平均标准误（SEM）表示。图表使用OriginPro 2021版（OriginLab Corporation，美国北安普顿）、GraphPad Prism 9.5（GraphPad Software，美国）和Office Excel绘制。差异显著性判定标准为：P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，****P < 0.0001。
【数据】显著性阈值：P<0.05，P<0.01，P<0.001，****P<0.0001
2.7 细胞体积计算
细胞体积按椭球体积公式计算：V = 4/3 π ABC，其中A、B、C分别为椭球的三个半轴长度。使用ImageJ软件从光学显微镜图像中测量细胞尺寸。通过标准刻度尺进行空间校准，将像素转换为微米。使用直线工具手动描绘细胞长度（A）和宽度（B和C），数值自动计算。为保证统计可靠性，每个菌株从随机视野中测量50个代表性细胞（n = 50）。对照组与实验组之间的统计学显著性采用Student's t检验确定，P值< 0.05视为具有统计学意义。
【数据】细胞测量数：50个/菌株；统计方法：Student's t检验；显著性阈值：P<0.05
2.8 分析方法
使用ImageJ软件（1.46r版）量化50个单细胞的长度和宽度。细胞体积按椭球体积公式计算。使用紫外-可见分光光度计（BIOMATE 3S，Thermo Scientific）在600 nm波长下测定光密度（OD600）监测细胞生长。NADPH和乙酰辅酶A分别使用乙酰辅酶A分析试剂盒和辅酶II分析试剂盒（Comin Biotech）测定。培养液中葡萄糖浓度采用HPLC法测定[22]。脂质含量采用Folch等[37]描述的氯仿-甲醇萃取法分析。细胞壁组分（包括葡聚糖、甘露聚糖和几丁质）通过酸水解法[38,39]进行定量测定。
【数据】OD600测定波长：600 nm；葡萄糖测定：HPLC法；脂质测定：氯仿-甲醇萃取法；细胞壁组分：酸水解法
研究结果
3.1 植物鞘氨醇加速ALECF筛选高脂质含量细胞
野生型Y. lipolytica DSM 3286此前被报道用于柠檬酸生产[40]，表明其具有溢出代谢特征。该菌株的初始胞内脂质含量仅为31.2%（w/w）。采用ALECF方法提升Y. lipolytica DSM 3286的脂质含量（图1a）。选择144 h作为Y. lipolytica DSM 3286的ALE培养时间，原因是Y. lipolytica的脂质发酵时间通常持续120–168 h[6,41,42]。
经8轮传代后，脂质含量提升至45.6%（w/w）。脂质含量、细胞生长（OD600）和残余葡萄糖浓度呈现稳定趋势。形态学观察显示，含有小脂滴的小细胞同时以类酵母形态和菌丝形态共存。虽然ALECF能在一定程度上提升Y. lipolytica的脂质积累能力，但在短期连续传代中这种提升仍然有限。经ALECF获得的菌株命名为Y. lipolytica ALE8。
在合成培养基中添加50 μM植物鞘氨醇进行细胞培养。随后将培养液用于不进行离心分离的ALE（图1b）。结果显示，在第一轮传代中出现了少量含有相对较多胞内脂滴的大细胞。然而，随着ALE的进行，这些大细胞逐渐消失，可能是由于其较低的细胞生长速率。在ALE过程中，脂质含量和细胞密度保持恒定。形态学观察显示，ALE过程中类酵母细胞比例增加，而菌丝逐渐消失。这表明植物鞘氨醇参与酵母形态的调控，与先前报道一致[43]。类酵母形态更有利于Y. lipolytica中脂质和脂溶性产物的生物合成与储存[44]。
进一步在Y. lipolytica DSM 3286中进行了植物鞘氨醇处理的ALECF（图1c）。结果显示，仅2轮传代后脂质含量即显著提升至64.8%（w/w），最终在8轮传代后达到77.2%（w/w）。同时，细胞生长和葡萄糖消耗均得到增强。经植物鞘氨醇处理的进化细胞呈现纯类酵母形态，细胞体积较亲本细胞更大，胞内空间充满脂滴。植物鞘氨醇的添加协同促进了ALECF对Y. lipolytica脂质含量的提升。经植物鞘氨醇处理的ALECF获得的菌株命名为Y. lipolytica PHS8。
在无胁迫条件下连续传代六次后，Y. lipolytica PHS8的脂质产量和细胞形态未出现明显退化，表明该菌株具有良好的遗传稳定性（图S1）。在3 L发酵罐中测试了Y. lipolytica PHS8脂质含量的变化（图S2）。144 h的发酵时间足以积累脂质，在144 h时脂质含量达到73.91%。
【数据】初始脂质含量：31.2%（w/w）；ALECF 8轮后脂质含量：45.6%（w/w）；植物鞘氨醇浓度：50 μM；PHS8在2轮后脂质含量：64.8%（w/w）；PHS8在8轮后脂质含量：77.2%（w/w）；3 L发酵罐144 h脂质含量：73.91%；ALE培养时间：144 h；发酵时间范围：120–168 h；遗传稳定性传代次数：6次
3.2 进化菌株的形态与代谢特征
为保证细胞表型稳定并实施严格的单变量控制以避免不同适应性进化传代引起的实验偏差，所有后续表征实验均选用第8轮传代的细胞。对通过ALECF和植物鞘氨醇处理ALECF获得的Y. lipolytica ALE8和Y. lipolytica PHS8菌株进行了进一步表征。
FESEM显示，与Y. lipolytica ALE8相比，Y. lipolytica PHS8表现出显著更大的细胞体积和相对光滑的细胞表面（图2a）。两种菌株表面均可观察到出芽生殖产生的芽痕。对不同生长阶段的Y. lipolytica ALE8和Y. lipolytica PHS8进行显微观察发现，两种菌株在生长早期表现出相似的Y. lipolytica特征细胞形态（图S3）。然而，在生长后期，Y. lipolytica PHS8中增加的脂质含量导致了显著的细胞增大和形态圆化[21]。胞内脂质荧光染色进一步证明，Y. lipolytica PHS8的整个细胞质中密集填充了脂滴，且与亲本菌株相比表现出更强的荧光信号（图S4）。
Y. lipolytica ALE8的平均细胞体积为26.2 ± 9.4 μm³，而Y. lipolytica PHS8的平均细胞体积达到181.0 ± 73.3 μm³，增加了6.9倍（图2b）。Y. lipolytica PHS8的主要细胞壁组分——葡聚糖、甘露聚糖和几丁质——含量分别仅为Y. lipolytica ALE8的50.8%、66.9%和62.8%（图2c）。葡聚糖和甘露聚糖首先水解为葡萄糖和甘露糖，释放的单糖通过HPLC定量。从HPLC色谱图（图S5）中也可以看出，Y. lipolytica PHS8中葡萄糖和甘露糖的峰面积显著低于Y. lipolytica ALE8。更薄的细胞壁有利于细胞扩张，为脂质储存提供更充足的胞内空间[45,46]。
先前研究报道，较薄的细胞壁通常与环境胁迫抗性降低相关[47]，而较厚的细胞壁赋予酵母菌株增强的胁迫耐受性[48,49]。然而，我们前期的工作表明，进化的T. cutaneum和R. toruloides菌株分别在木质纤维素水解液和粗甘油中表现出增强的脂质生产能力。因此，本研究进化Y. lipolytica菌株的环境胁迫抗性以及细胞响应植物鞘氨醇调控下游细胞壁降解和重塑的内在机制需要进一步研究。
在24 h、48 h和72 h时测定了胞内NADPH和乙酰辅酶A——脂质生物合成的关键前体——的含量（图2d和图2e）。结果显示，在24 h至72 h之间，Y. lipolytica PHS8的NADPH含量是Y. lipolytica ALE8的2.1–2.6倍（图2d）。在24 h时，Y. lipolytica PHS8的乙酰辅酶A含量是Y. lipolytica ALE8的3.2倍，而在48 h和72 h时未观察到显著差异（图2e）。充足的胞内空间以及NADPH和乙酰辅酶A的丰富供应有利于高效的脂质积累[50,51]。
【数据】ALE8平均细胞体积：26.2 ± 9.4 μm³；PHS8平均细胞体积：181.0 ± 73.3 μm³；细胞体积增加倍数：6.9倍；PHS8葡聚糖含量：ALE8的50.8%；PHS8甘露聚糖含量：ALE8的66.9%；PHS8几丁质含量：ALE8的62.8%；NADPH含量倍数：2.1–2.6倍（24–72 h）；乙酰辅酶A含量倍数：3.2倍（24 h）；48 h和72 h乙酰辅酶A差异：无显著差异
3.3 全转录组分析
为研究植物鞘氨醇对关键基因表达水平的影响，对Y. lipolytica ALE8和Y. lipolytica PHS8进行了全局比较转录组分析。表达水平显著上调的基因（P < 0.05，log2倍数变化> 1.0）共769个，表达水平显著下调的基因（P < 0.05，log2倍数变化< −1.0）共917个（图S6）。这些显著差异表达基因（DEGs）用于京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析（图S7）。
KEGG富集分析显示，核糖体和核糖体生物合成通路整体下调。这一观察结果表明，植物鞘氨醇作为鞘脂信号分子[52]，可能触发强烈的细胞应激反应。为维持细胞稳态，菌株下调了蛋白质翻译和核糖体组装等能量密集型过程。除翻译相关通路外，大量DEGs富集于多种代谢通路。参与氨基酸代谢和丙酸酯代谢的上调基因比例增加。氨基酸的生物降解...
【数据】上调基因数：769个（P<0.05，log2FC>1.0）；下调基因数：917个（P<0.05，log2FC<−1.0）；主要富集通路：核糖体、核糖体生物合成、氨基酸代谢、丙酸酯代谢
讨论与解读
本研究将细胞壁完整性调控分子植物鞘氨醇添加至野生型Y. lipolytica DSM 3286的培养基中，随后进行ALECF。结果显示，胞内脂质含量在2轮传代后从31.2%显著提升至64.8%，最终在8轮传代后达到77.2%。作为对照，仅通过ALECF处理的脂质含量仅提升至45.6%。表征分析揭示，与未添加植物鞘氨醇的进化细胞相比，添加植物鞘氨醇的进化细胞表现出更大的细胞体积、更薄的细胞壁以及增加的NADPH和乙酰辅酶A供应。比较转录组分析进一步表明，添加植物鞘氨醇改变了Y. lipolytica中与鞘脂代谢、细胞壁完整性和碳代谢相关通路的表达水平。虽然植物鞘氨醇通过ALECF促进脂质积累的功效需要在更多产油酵母中进一步验证，但本研究建立了一种新型的植物鞘氨醇处理ALECF方法，用于提升野生型Y. lipolytica的脂质含量，并为未来脂质生物合成和细胞结构的理性代谢工程提供了有前景的遗传靶点。
编译者解读
本研究巧妙地将信号分子干预与适应性进化相结合——植物鞘氨醇不仅作为细胞壁完整性通路的调节因子触发细胞应激响应，还通过重塑细胞形态（类酵母化、体积增大、细胞壁变薄）为脂质积累创造了物理空间。这种"化学引导+进化筛选"的协同策略显著缩短了传统ALE所需的传代次数，2轮即达64.8%的脂质含量颇具实用性。值得注意的是，细胞壁减薄与胁迫耐受性之间的潜在权衡仍需关注，未来可结合细胞壁工程或共底物策略进一步优化。该方法为其他产油微生物的脂质积累强化提供了可借鉴的范式。
参考来源
Li S. Phytosphingosine promotes intracellular microbial lipid accumulation and cell structure remodeling during adaptive evolution combined with cell fractionation in wild-type Yarrowia lipolytica DSM 3286. Biochemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.bej.2026.110293
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110293