来源：Identification of the biosynthetic gene cluster for desmethylmensacarcin, a phytotoxic polyketide produced by Streptomyces niveiscabiei ST1015（Physiological and Molecular Plant Pathology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
马铃薯疮痂病是全球性病害，由链霉菌属多种病原菌引起。本研究首次在 Streptomyces niveiscabiei ST1015 中鉴定并功能验证了植物毒素 desmethylmensacarcin（dmsn）的生物合成基因簇——一个22基因的II型聚酮合酶簇，与 S. bottropensis 的 mensacarcin 簇高度同源但缺少三个甲基转移酶基因。研究发现 dmsn 仅在植物基质培养基中产生，敲除核心酮合酶基因后植物毒性降低约90%，但突变株在土豆上仍具致病力，提示存在多条冗余的致病途径。
研究背景
马铃薯疮痂病（CS）广泛发生于全球几乎所有马铃薯种植区，典型症状为块茎表面形成坏死性和木栓化病斑，从隆起到深凹陷不等，显著降低块茎商品价值。该病害难以防控的原因包括：对环境诱病因素认识有限、缺乏抗病品种，以及致病原种类多样。已鉴定的病原菌均属于丝状细菌链霉菌属，其中 S. scabiei、S. acidiscabies、S. turgidiscabies 和 S. ipomoeae 研究最为深入。这些物种的致病性主要通过产生一种或多种 thaxtomin 植物毒素实现。Thaxtomin 是一类硝化二酮哌嗪家族化合物，其中 Thaxtomin A 最为常见，通过抑制活跃生长中的纤维素合酶复合体发挥作用。本研究关注的 dmsn 是一种与 mensacarcin 结构相关的聚酮类植物毒素，在常见疮痂病致病过程中参与植物组织损伤，但其生物合成基因簇此前未被鉴定。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用菌株和质粒列于表 S1。大肠杆菌菌株在 Luria-Bertani（LB，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）培养基中37°C培养。链霉菌菌株常规培养使用胰蛋白酶大豆肉汤（TSB，BD Biosciences，美国新泽西州富兰克林湖）或国际链霉菌计划4号培养基（ISP-4，BD Difco™，BD Biosciences，美国新泽西州富兰克林湖），28°C培养。接合转移在大豆粉甘露醇（SFM）琼脂上进行，该培养基含甘露醇、大豆粉和琼脂各20 g/L。高压灭菌后添加MgCl₂至终浓度10 mM。根据需要，培养基补充卡那霉素（50 μg/mL）、阿普拉霉素（100 μg/mL）、萘啶酸（50 μg/mL）、硫链丝菌素（50 μg/mL）和/或氯霉素（25 μg/mL）（Gold Biotechnology，美国密苏里州圣路易斯）[23]。
【数据】培养基：LB、TSB、ISP-4、SFM；温度：37°C（大肠杆菌）、28°C（链霉菌）；抗生素浓度：卡那霉素50 μg/mL、阿普拉霉素100 μg/mL、萘啶酸50 μg/mL、硫链丝菌素50 μg/mL、氯霉素25 μg/mL；MgCl₂终浓度：10 mM；SFM组分：甘露醇/大豆粉/琼脂各20 g/L
2.2 基因组DNA提取
基因组DNA按 Francis 等[23]描述的方法提取，但在DNA沉淀前增加一步：加入2.5 μL浓度为10 mg/mL的RNase A（Gold Biotechnology，美国密苏里州圣路易斯），37°C孵育30分钟。DNA制剂的量和质量使用 NanoDrop™ One© 微量紫外-可见分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）和琼脂糖凝胶电泳（含0.5 μg/mL GoodView™ 核酸染料，SBS Genetech，中国）进行测定。提取的DNA储存于−20°C备用。
【数据】RNase A用量：2.5 μL（10 mg/mL）；孵育温度：37°C；孵育时间：30 min；DNA储存温度：−20°C；琼脂糖凝胶染料：0.5 μg/mL GoodView™
2.3 基因组测序
S. niveiscabiei ST1015 的基因组使用 Oxford Nanopore Technologies（ONT）平台进行重测序。测序在 MinION R9.4.1 流动池[24]上进行，使用 Rapid Sequencing Kit（SQK-RAD004，Oxford Nanopore Technologies，英国牛津），运行10小时，投入400 ng高分子量基因组DNA。共产生1,776,177,308个碱基，对应基因组177×覆盖度。读段中位长度为1132 bp，中位质量分数为8.7（约85%准确度）。使用 Canu v2.0[25]进行组装。长读段重新比对到一致性组装序列上，并使用 Nanopolish v0.14 工具[26]进行校正。随后使用 Illumina 读段（Novogene）通过 Pilon v1.4 工具[27]进行第二次校正。最终一致性组装为单条重叠群，全长10.17 Mb（RefSeq GCF_003268535.2）。
S. niveiscabiei ST1020 和 S. acidiscabies ST105 的基因组采用长读段与短读段结合的混合策略获得。长读段使用 MinION 流动池[24]配合 Ligation Sequencing Kit v14（SQK-LSK114，Oxford Nanopore Technologies，英国牛津）测序22小时，投入400 ng高分子量基因组DNA。基因组使用 Flye（v2.9.2-b1786）[28]组装，并用 Medaka v1.6.0（https://github.com/nanoporetech/medaka，2024年7月15日访问）以长读段进行抛光。获得的基因组进一步使用 Illumina（Novogene，中国）短读段通过 Polypolish v0.5.0[29]进行抛光。ST1020 基因组共产生460,271,350个碱基，对应44×覆盖度。最终一致性组装包含64条重叠群，总长10.04 Mb（RefSeq GCF_003268555.2）。ST105 基因组共产生682,123,055个碱基，提供62×覆盖度。最终一致性组装由4条重叠群组成，总长11.07 Mb（RefSeq GCF_003584805.2）。
【数据】ST1015测序：ONT平台、MinION R9.4.1流动池、Rapid Sequencing Kit、10 h、400 ng DNA、1,776,177,308碱基、177×覆盖度、中位读长1132 bp、中位质量8.7；ST1020测序：Ligation Sequencing Kit v14、22 h、400 ng DNA、460,271,350碱基、44×覆盖度、64条重叠群、10.04 Mb；ST105测序：682,123,055碱基、62×覆盖度、4条重叠群、11.07 Mb
2.4 dmsn生物合成基因簇（BGC）的搜索、注释与比较
新生成的 S. niveiscabiei ST1015（RefSeq GCF_003268535.2）、S. niveiscabiei ST1020（RefSeq GCF_003268555.2）、S. acidiscabies ST105（RefSeq GCF_003584805.2）基因组，连同从NCBI下载的致病链霉菌基因组（表S2），使用 antiSMASH 7.0 软件[30]进行分析。BGC聚类使用 BiGSCAPE[31]进行。鉴定出的基因簇家族（GCF）显示出与 S. bottropensis Gö C4/4（GenBank登录号KJ437437）中编码msn产生的II型PKS簇的存在，使用 CAGECAT v1 工具[32]进行比较。基因间比对使用 Geneious Prime 2023.1.2（https://www.geneious.com，2024年7月15日访问）进行。
【数据】分析软件：antiSMASH 7.0、BiGSCAPE、CAGECAT v1、Geneious Prime 2023.1.2；参考序列：KJ437437
2.5 dmsnK1-K2缺失突变体的构建
S. niveiscabiei ST1015 的 dmsnK1-K2 缺失突变体使用质粒 pAMR4 构建，该质粒通过双同源重组将目标基因替换为阿普拉霉素（aac(3)IV）抗性 cassette[33]。目标基因上游和下游各3-kb区域使用 Herculase II Fusion DNA Polymerase（Agilent Technologies）扩增（表S3），克隆至 pCR-BluntII-TOPO（Invitrogen），并送测序验证（Laragen Inc.，美国加利福尼亚州Culver City）。构建体分别用 MfeI/BamHI 和 AvrII/HindIII（New England Biolabs）酶切，释放上游和下游区域，随后克隆至 pAMR4 载体[33]。所得 pAMR4SnUD 缺失构建体（表S1）通过热激导入含有 pUZ8002 质粒[34]的大肠杆菌 ET12567，并通过属间接合转移从转化的大肠杆菌菌株转移至 S. niveiscabiei ST1015。接合子在 SFM 培养基[34]（30 mL）上回收，24小时后覆盖萘啶酸和阿普拉霉素，并在 ISP-2 培养基[34]上测试卡那霉素敏感性。目标基因正确缺失的验证通过聚合酶链式反应（PCR）（图S1）使用表S3所列引物进行。
【数据】同源臂长度：各3 kb；限制性内切酶：MfeI/BamHI、AvrII/HindIII；接合子回收：SFM培养基30 mL、24 h后覆盖抗生素；PCR验证：引物见表S3
2.6 dmsnK1-K2缺失突变体的遗传互补
覆盖从 dmsnK1 到 dmsnO1 的6182-bp片段使用引物 MIL20 和 MIL21（表S3）进行PCR扩增。该扩增子克隆至质粒 pAU3-45-ermEp 的 XbaI 位点，生成 pAU3-45-cdmsn。质粒 pAU3-45-ermEp 的构建方法为：将从 pIJ8641[35]以引物 imf33/imf158 扩增的 ermE 启动子克隆至质粒 pAU3-45[36]的 BamHI 位点。质粒 pAU3-45-cdmsn 通过上述属间接合转移导入三个独立生成的 ST1015ΔdmsnK1-K2 突变株。接合子在 SFM 培养基上回收，28°C孵育24小时后覆盖萘啶酸、硫链丝菌素和阿普拉霉素[34]。从每个互补突变体背景中随机选择一个经PCR验证的接合子菌落用于表型分析。由于这些互补菌株来源于独立的突变体背景，这些实验中的生物学重复定义为菌株水平而非菌落水平。
【数据】互补片段长度：6182 bp（dmsnK1至dmsnO1）；克隆位点：XbaI；启动子：ermE；抗生素：萘啶酸、硫链丝菌素、阿普拉霉素；孵育温度：28°C；时间：24 h
2.7 萝卜生物测定
萝卜幼苗实验用于评估细菌的致病能力或细菌培养物上清液中植物毒性化合物的存在。将24小时TSB培养物（5 mL）的细菌细胞制备为接种物，方法同 Lapaz 等[10]先前描述。为获得培养上清液，将按上述方法培养的TSB预培养物细胞离心沉淀，洗涤两次，重悬于1 mL无菌蒸馏水中，调节600 nm光密度（OD600nm）为1。取200 μL这些菌丝体悬浮液等分试样，接种至50 mL TSB、燕麦麸肉汤（OBB）[37]、马铃薯泥肉汤（PMB，每升12.5 g干马铃薯片）、基于ISP-4培养基成分（BD Biosciences，美国新泽西州富兰克林湖）去除琼脂的肉汤，和/或基于ISP-2培养基成分（BD Biosciences，美国新泽西州富兰克林湖）去除琼脂的肉汤中。培养物在28°C、220 rpm下孵育1–7天。培养物离心后，上清液通过0.45 μm注射器过滤器过滤。滤液用于萝卜幼苗植物毒性测试（每颗发芽种子200 μL）。过滤的未接种培养基作为阴性对照。每个处理包含每重复6棵幼苗，实验重复三次。
【数据】接种物：OD600nm = 1；接种量：200 μL/50 mL培养基；培养基：TSB、OBB、PMB（12.5 g/L干马铃薯片）、ISP-4无琼脂、ISP-2无琼脂；培养条件：28°C、220 rpm、1–7天；过滤：0.45 μm滤膜；萝卜幼苗处理量：200 μL/种子；每重复6棵幼苗；重复3次
研究结果
3.1 dmsn在植物基质培养基中的产生
通过萝卜幼苗实验评估了不同培养基7天龄上清液中植物毒性化合物的产生。植物毒性以相对于水处理对照的芽长比进行定量，结果显示不同培养基间存在高度显著差异（单因素方差分析，F(4,10) = 79.03，p = 1.58 × 10⁻⁷，n = 3；表S4）。用 OBB 和 PMB 培养物的无细胞上清液处理的幼苗表现出明显的生长抑制和根部坏死，而用 TSB、ISP-2 或 ISP-4 培养物上清液处理的幼苗未检测到植物毒性（图1）。
OBB 和 PMB 培养上清液的植物毒性通常在接种后两天开始观察到（图S2）。此外，OBB 培养上清液中存在 dmsn 而 TSB 上清液中不存在 dmsn 的事实得到了化学分析的进一步支持。对接种后1、2、3、5和7天收集的培养上清液进行HPLC分析，结果显示在 OBB 和 PMB 培养基中均存在与纯化 dmsn 标准品保留时间一致的峰（图S3），最早在接种后2天即可检测到（图S4）。在 TSB 培养物的上清液中，任何时间点均未检测到 dmsn 峰（图S4）。同时，时间过程 ¹H NMR 分析确认了 OBB 上清液中 dmsn 特征信号从接种后3天开始出现。特别是，芳香环上 H-6、H-7 和 H-8 质子、连氧碳上的 H-4、H-10、H-12 和 H-13 质子，以及 CH₃-14 和 CH₃-15 甲基质子的共振信号可以被明确鉴定（图S5）。另一方面，这些信号在 TSB 上清液中在整个7天期间始终不存在（图S6）。这些结果表明，dmsn 仅在植物基质培养基中被检测到，且其存在与培养上清液的植物毒性活性相一致。
【数据】统计：F(4,10) = 79.03，p = 1.58 × 10⁻⁷，n = 3；植物毒性起始时间：接种后2天；HPLC检测到dmsn：OBB和PMB中2 dpi起；NMR检测到dmsn信号：OBB中3 dpi起；TSB中始终未检测到dmsn
3.2 S. niveiscabiei ST1015 含有与 S. bottropensis Gö C4/4 的 msn BGC 高度同源的22基因簇
对新生成的 S. niveiscabiei ST1015 完整基因组进行分析，以鉴定负责产生植物毒性聚酮化合物 dmsn 的BGC——该化合物已被证明可在马铃薯块茎上引起深凹陷坏死病斑[19]。AntiSMASH 分析共揭示41个推定的次级代谢物基因簇，其中包括一个与 S. bottropensis Gö C4/4 的 msn 生物合成簇具有84%同源性的基因簇（簇40）（表1）。此外还预测到多个高置信度（>80%相似性）的生物合成簇，编码铁载体 coelichelin 和 desferrioaxamine B [40,41]、抗菌化合物 albaflavenone 和 nikkomycin [42,43]、渗透调节物质 ectoine [44]、一种通常在链霉菌中调控抗生素产生和分化的γ-丁内酯信号分子[45]，以及参与控制膜流动性并减少离子通过细胞膜被动扩散的类藿烷 hopene [44]（表1）。
簇40代表 S. niveiscabiei ST1015 的 dmsn 簇，包含22个开放阅读框（ORF）。所有ORF均与 S. bottropensis Gö C4/4 的 msn 簇中相应基因具有同源性（表2）。此外，两个簇之间的基因顺序和方向是保守的。ST1015 的 dmsn 簇包含编码以下蛋白的基因：最小PKS系统的三个蛋白（两个酮合酶和一个酰基载体蛋白）、五个还原酶、六个加氧酶、三个环化酶、两个调控因子（其中一个属于链霉菌抗生素调控蛋白（SARP）家族[46]）、一个主要促进子超家族（MFS）转运蛋白、一个NAD(P)H结合蛋白、一个磷酸转移酶和一个α/β折叠水解酶。与 dmsn 的化学结构一致[19]，参与 msn 甲基化的三个基因 msnM1、msnM2 和 msnM3 在 ST1015 的 dmsn 簇中未被发现（表2）。
【数据】AntiSMASH预测簇总数：41；簇40与msn簇同源性：84%；dmsn簇ORF数：22；编码蛋白：3个PKS核心蛋白、5个还原酶、6个加氧酶、3个环化酶、2个调控因子、1个MFS转运蛋白、1个NAD(P)H结合蛋白、1个磷酸转移酶、1个α/β水解酶；缺失基因：msnM1、msnM2、msnM3
3.3 dmsn簇也存在于其他链霉菌物种中
为探索编码 thaxtomin 和 msn/dmsn 生物合成途径的BGC的多样性和分布，使用 BiG-SCAPE[31]进行了相似性网络分析。共鉴定出三个不同的GCF，每个GCF包含序列高度相似的BGC（图2）。
两个GCF对应 thaxtomin 样BGC。最大的GCF以 MiBIG 参考簇 BGC00002089 为中心，汇集了多个链霉菌物种的BGC，其中 S. scabiei（粉色节点）占主导。该簇表现出高度保守性，成员间连接紧密，表明 thaxtomin 生物合成能力在致病链霉菌物种中分布广泛且保守。此外，一个较小的GCF包含 BGC0000444，由来自 S. turgidiscabies 菌株（棕色节点）的更分散簇组成。第三个GCF与 msn/dmsn 生物合成相关。该家族包括先前已表征的来自 S. bottropensis 的 msn BGC（黄色节点）。此外，来自 S. acidiscabies（绿色节点）和 S. niveiscabiei（橙色节点）的密切相关的BGC也被纳入，表明 msn/dmsn 样生物合成能力在链霉菌属中的分布比先前认识的更为广泛。
为进一步研究 msn/dmsn 相关GCF中BGC的遗传架构，我们使用 Cagecat 对代表性簇进行了共线性比较（图3）。
来自 S. bottropensis Gö C4/4 的BGC（先前与 msn 生物合成相关）作为参考。分析揭示了 S. bottropensis、S. acidiscabies 和 S. niveiscabiei 的BGC之间存在高度的基因保守性和共线性，主要聚酮合酶和修饰基因在所有菌株中一致存在。如先前在 S. niveiscabiei ST1015 中所注意到的，msnM1–M3 基因在其他 S. niveiscabiei 菌株以及 S. acidiscabies 的BGC中同样缺失。
【数据】GCF数量：3个；thaxtomin样GCF：2个；msn/dmsn样GCF：1个；参考簇：BGC00002089、BGC0000444、KJ437437；msnM1–M3在S. niveiscabiei和S. acidiscabies中均缺失
3.4 将dmsn BGC的基因组变异与植物毒素产生相关联
Croce 等[39]的先前工作表明，在已测序的 S. niveiscabiei 菌株中，只有 ST1015 能够在培养上清液中产生 dmsn，而 ST1020 不能。对于 S. acidiscabies 物种，所测试的菌株均未发现产生这种代谢物。在本研究中，我们使用比较基因组分析来检验这些菌株之间BGC结构或序列内容的差异是否可以解释观察到的 dmsn 产生差异。
构成 dmsn BGC 的大多数基因在 S. niveiscabiei 菌株 ST1015 和 ST1020 之间高度相似。然而，三个基因（dmsnO2、dmsnK2 和 dmsnO11）显示出较低的序列同源性（图3）。进一步的序列比对（图S7）揭示了 ST1020 菌株中这三个基因存在提前终止密码子。特别是 dmsnK2 基因——编码核心生物合成酶——含有一个提前终止密码子，其后紧跟一个替代起始密码子（GTG）（图S7A）。这种排列可能导致翻译产生仅由116个氨基酸组成的截短蛋白，其功能不确定。相比之下，S. acidiscabies 菌株中未检测到 dmsn 的原因不能通过特定生物合成基因的缺失或提前终止密码子等破坏性突变来解释。然而，如图3所示，dmsnR2 基因——一个推定的调控基因——在 S. acidiscabies 菌株内部高度保守，但与 S. niveiscabiei 菌株相比时则不然（图S7D）。
【数据】ST1020中突变基因：dmsnO2、dmsnK2、dmsnO11；dmsnK2截短蛋白长度：116个氨基酸；突变类型：提前终止密码子；替代起始密码子：GTG；S. acidiscabies中无基因缺失或提前终止密码子
3.5 敲除dmsnK1-K2消除dmsn的产生
为将植物毒素 dmsn 的产生与已鉴定的PKS簇联系起来，并评估其在细菌感染过程中的重要性，构建了缺失突变体——将生物合成簇中两个中心基因（酮合酶基因 dmsnK1 和 dmsnK2）的区域替换为质粒 pAMR4[33]上携带的阿普拉霉素（aac(3)IV）抗性 cassette。对三个独立生成的突变体分离株进行了评估。
萝卜幼苗实验显示，与野生型 ST1015 相比，三个独立生成的 ST1015ΔdmsnK1-K2 突变体分离株的细菌悬浮液（OD600 = 1.0）处理的种子表现出明显减轻的植物毒性症状（图4）。为进一步定量分析，使用来自野生型、突变体和互补菌株的培养上清液进行萝卜幼苗实验和马铃薯块茎盘实验（图5）。
基于幼苗长度相对于水对照的比值进行的定量分析显示，与野生型相比，缺乏核心酮合酶基因（dmsnK1–K2）的突变体培养上清液的植物毒性效应减少了约90%（p < 0.001）（图6）。
突变体的遗传互补将植物毒性恢复至野生型水平（图6）。¹H NMR 分析进一步证实，六个独立生成的 ST1015ΔdmsnK1-K2 突变体分离株的7天龄 OBB 培养上清液中均不存在 dmsn 特征信号，而野生型菌株 ST1015 的上清液中存在这些信号（图7）。
【数据】植物毒性降低：约90%（p < 0.001）；突变体数量：3个独立分离株（表型实验）、6个独立分离株（NMR验证）；互补后植物毒性恢复至野生型水平；NMR确认：6个突变体上清液中均无dmsn信号
讨论与解读
Desmethylmensacarcin（dmsn）是一种与 msn 结构相关的聚酮化合物，msn 最初从 S. bottropensis 中分离并具有抗肿瘤活性[21]。近期，dmsn 在 S. niveiscabiei ST1015 中被鉴定，并证明其在疮痂病过程中作为植物毒素参与植物组织损伤[19]。本研究鉴定并功能验证了负责 dmsn 产生的BGC，扩展了对马铃薯疮痂病发病机制中次级代谢物的认识。
研究发现 dmsn 的生物合成受生长环境的强烈影响，仅在植物基质培养条件下被激活。这种模式表明 dmsn 的产生受特定营养或植物来源信号的调控，而非一般的代谢活动。这种早期且培养基特异性的激活与已知的链霉菌中许多BGC表达受营养可用性、胁迫或植物来源信号调节的报道一致[47,48]。类似现象在 thaxtomin A 中已有描述——多种致病链霉菌物种（包括 S. scabiei）的主要植物毒素，其生物合成在纤维二糖、纤维三糖等纤维素寡糖以及软木脂（马铃薯周皮的关键成分）存在时被诱导[49,50]。
比较基因组分析显示，S. niveiscabiei ST1015 中的 dmsn 基因簇与 S. bottropensis 的 msn 簇高度同源，但缺少三个甲基转移酶基因。BiG-SCAPE 分析揭示 msn/dmsn 样BGC在致病链霉菌物种中的分布比先前认识的更广泛，尽管部分菌株因提前终止密码子或可能的调控差异而携带非功能性簇。突变体在土豆上仍具致病力，提示 dmsn 并非 ST1015 致病性的唯一决定因素，可能存在多条潜在冗余的植物毒性途径共同参与疮痂病发病机制。
编译者解读：该研究在合成生物学层面展示了植物病原菌次级代谢"一菌多簇"的复杂性——dmsn 簇的培养基特异性激活提示植物信号是开启沉默基因簇的关键开关，这对理解病原-宿主互作和设计抗病策略具有参考价值。敲除核心基因后毒性下降90%但致病力未完全丧失，说明靶向单一毒素的防控策略可能不够，需考虑多基因冗余。此外，msn/dmsn 簇在多个致病种中广泛分布且部分因突变失活，为研究基因簇的进化命运和水平转移提供了天然案例。后续若能解析植物来源的具体诱导信号分子，将有助于开发针对性的病害防控手段。
参考来源
Lapaz M.I. Identification of the biosynthetic gene cluster for desmethylmensacarcin, a phytotoxic polyketide produced by Streptomyces niveiscabiei ST1015. Physiological and Molecular Plant Pathology, 2026. DOI: 10.1016/j.pmpp.2025.103072
DOI: 10.1016/j.pmpp.2025.103072