来源：Model-guided dynamic control of essential metabolic nodes boosts acetyl-coenzyme A–dependent bioproduction in rewired Pseudomonas putida（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
乙酰辅酶A是众多高附加值产品的重要代谢前体，但恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）从糖类底物合成乙酰辅酶A的能力天然受限。本研究通过构建整合通量组学与代谢组学数据的动力学模型，结合CRISPRi动态基因抑制技术，精准下调柠檬酸合酶（gltA）与乙酰辅酶A羧化酶（accA）两个必需基因的表达，使乙酰辅酶A含量提升8倍。以聚-3-羟基丁酸酯（PHB）为报告产物，经全细胞重构后，在生物反应器中PHB产量提高5倍。
研究背景
微生物代谢工程已能生产多种大宗化学品、精细化学品、药物与生物燃料。常用策略包括选择合适宿主、计算机辅助设计生化网络以及敲除或精细平衡竞争途径。CRISPR-Cas9系统的出现极大推动了微生物代谢潜力的开发与利用。在代谢工程应用中，抑制编码关键酶的基因表达往往是平衡代谢途径、提高产物产量与得率的必要手段。然而，对于必需基因而言，完全敲除并不可行，动态调控其表达水平成为更优选择。恶臭假单胞菌KT2440因其代谢多样性和耐受严苛工业条件的特性而备受关注，但其从糖底物生成乙酰辅酶A的能力有限，制约了其作为乙酰辅酶A依赖型产物细胞工厂的性能。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
本研究所用菌株与质粒列于表1。Escherichia coli 与 P. putida 培养温度分别为37°C与30°C。克隆操作与基因组工程操作中，细胞在LB培养基（10 g L⁻¹胰蛋白胨、5 g L⁻¹酵母提取物、10 g L⁻¹ NaCl；固体培养基另含15 g L⁻¹琼脂）中培养。所有摇瓶培养均在200 rpm振荡条件下进行（MaxQ™ 8000摇床；ThermoFisher Scientific）。卡那霉素（Km）、庆大霉素（Gm）与链霉素（Str）按需分别添加至50 μg mL⁻¹、10 μg mL⁻¹与100 μg mL⁻¹。除非另有说明，摇瓶与自动化生物反应器培养均在de Bont基础培养基（补充数据表S1，按Hartmans等（1989）配方配制）中进行，含1%（w/v）葡萄糖作为碳源。使用Genesys 20分光光度计（Thermo Fisher Scientific）记录600 nm处光密度（OD600）以估算细菌生长量。工程菌株生理表征期间，使用Synergy™ MX酶标仪（BioTek Instruments Inc.）在OD600下进行光程校正的生长动力学监测。
【数据】培养温度：E. coli 37°C / P. putida 30°C；LB培养基：10 g L⁻¹胰蛋白胨、5 g L⁻¹酵母提取物、10 g L⁻¹ NaCl、15 g L⁻¹琼脂（固体）；振荡：200 rpm；Km：50 μg mL⁻¹；Gm：10 μg mL⁻¹；Str：100 μg mL⁻¹；碳源：1%（w/v）葡萄糖
2.2 通用克隆流程与质粒和突变菌株构建
本工作所用全部质粒与寡核苷酸分别列于表1与补充数据表S2。除非另有说明，所有质粒构建均采用尿嘧啶切除（USER）克隆法（Cavaleiro等，2015）。寡核苷酸设计使用AMUSER工具（Genee等，2015）；用于USER克隆的扩增反应中，Phusion™ U高保真DNA聚合酶（ThermoFisher Scientific）按制造商说明使用。菌落PCR使用商业OneTaq™预混液（New England BioLabs）按供应商说明操作。E. coli DH5α λpir（表1）作为通用克隆宿主。化学感受态 E. coli 细胞使用Mix and Go™商业试剂盒（Zymo Research）按制造商指示制备并转化质粒。P. putida 电转感受态细胞通过将LB培养基培养物生物量以300 mM蔗糖洗涤后制备，随后通过电穿孔转化质粒（Choi等，2006；Volke等，2020c）。基因缺失通过可消除质粒辅助的无抗生素等位基因交换实现（Volke等，2020b；Wirth等，2020）。所有质粒与菌株序列通过Mix2Seq测序（Eurofins Genomics）验证。
【数据】克隆方法：USER克隆；聚合酶：Phusion™ U高保真DNA聚合酶；菌落PCR：OneTaq™预混液；感受态制备：Mix and Go™试剂盒（E. coli）/300 mM蔗糖洗涤（P. putida）；电穿孔转化；基因缺失：无抗生素等位基因交换
2.3 集成模型构建
使用Saa与Nielsen（2015）开发的GRASP平台构建并参数化了 P. putida KT2440中心碳代谢的热力学一致性动力学模型。在该框架中，每个反应根据其酶机制（Cleland，1963）分解为基元反应，基元反应规定了底物结合与产物释放的顺序。每个基元反应采用质量作用动力学建模。遵循集成建模框架（Tran等，2008），GRASP根据（i）反应的吉布斯自由能变化（ΔrG′）、（ii）参考反应通量与（iii）参考代谢物浓度计算速率常数值。首先列出 P. putida KT2440代表中心碳代谢的生化网络中所有反应（补充数据表S3与S4）。为在GRASP框架内参数化模型，使用了：（i）葡萄糖培养的 P. putida KT2440的参考通量分布（Nikel等，2015，2021）；（ii）以mol L⁻¹为单位的稳态代谢物浓度及eQuilibrator（Flamholz等，2012）提供的ΔrG′⁰值计算每个反应的ΔrG′；（iii）酶机制，包括反应物结合与释放顺序、每个酶的亚基数量，以及（iv）酶调控信息，即已知的别构效应物及抑制剂或激活剂（全部信息列于补充数据表S4-S9）。由此构建了一个动力学模型集成，其中每个模型均达到参考状态并与实验数据及系统额外信息一致。该集成由10,000个独立模型组成，用于进行代谢控制分析（MCA）（Moreno-Sánchez等，2008），以找出可影响稳态乙酰辅酶A浓度的酶。模型构建与验证的详细说明见补充方法S1。
【数据】模型平台：GRASP；模型数量：10,000个独立模型；参考通量来源：葡萄糖培养的P. putida KT2440；热力学数据：eQuilibrator
2.4 LC-MS辅助代谢组学分析
在指定时间点，取1 mL培养物等分试样，通过真空过滤（Durapore™膜滤器，0.45 μm）收集生物量。过滤后，细胞用3 mL乙腈-CH₃OH-水溶液[40-40-20%（v/v）]淬灭，并用0.1 M甲酸在−20°C酸化（Rabinowitz和Kimball，2007）。随后，如Nikel等（2021）所述，以17,000×g离心10 min去除细胞碎片。上清液转移至新管中，在30°C、减压条件下蒸发90 min去除溶剂（Concentrator Plus，Eppendorf）。样品冷冻干燥后于−80°C保存。分析前，沉淀物以100 μL去离子水复溶，不溶性颗粒通过17,000×g离心10 min去除。代谢物根据McCloskey等（2016）方法使用LC-MS/MS定量，色谱图使用MultiQuant™软件（Sciex）分析。Prism 8软件（GraphPad Software Inc.）用于绘制选定代谢物的结果。Matplotlib（基于NumPy的跨平台库）用于将数据可视化为热图（Hunter，2007）。取各重复间的平均代谢物浓度，并归一化至对照条件的平均值后进行分析。
【数据】取样量：1 mL；过滤膜孔径：0.45 μm；淬灭液：乙腈-CH₃OH-水[40-40-20%（v/v）] + 0.1 M甲酸；温度：−20°C；离心：17,000×g，10 min；蒸发：30°C，90 min；复溶：100 μL去离子水
2.5 LC-MS/MS全基因组靶向蛋白质组学分析
采用全基因组蛋白质组学分析定量50 mL摇瓶培养物样品中途径蛋白的相对水平。在文中指示的时间点，从各培养物取1 mL等分试样，以10,000×g离心10 min，液氮速冻。沉淀于−80°C保存，直至按Bongers等（2020）的方法处理。细胞在6 M盐酸胍、5 mM三(2-羧乙基)膦、10 mM氯乙酰胺和100 mM Tris·HCl（pH = 8.5）中裂解，同时使用Mixer Mill（MM 400 Retsch）在室温下以25 Hz破碎5 min，随后在恒温混匀仪中95°C、2,000 rpm处理10 min。以15,000×g离心10 min获得澄清上清液。细胞裂解液中的蛋白质浓度通过二喹啉甲酸法估算，取100 μg蛋白质进行胰蛋白酶消化8 h。消化步骤后，加入10 μL 10%（w/v）三氟乙酸，样品使用StageTip C18（Empore，3M，USA）进行分级。随后，将1 μg纯化肽段注入Orbitrap Exploris 480质谱仪（Thermo Scientific）。仪器以数据依赖采集模式运行，MS级扫描设置如下：Orbitrap分辨率120,000；AGC目标300%；最大注入时间设为自动；强度阈值5.0 × 10³；动态排除20 s。数据依赖性MS2选择以Top 20 Speed模式进行，HCD碰撞能量设为4（原文此处截断，后续参数原文未详述）。
【数据】取样量：1 mL；离心：10,000×g，10 min；裂解液：6 M盐酸胍、5 mM TCEP、10 mM氯乙酰胺、100 mM Tris·HCl（pH=8.5）；破碎：25 Hz，5 min（室温）；热变性：95°C，2,000 rpm，10 min；离心：15,000×g，10 min；蛋白酶解：100 μg蛋白，8 h；肽段上样量：1 μg
研究结果
3.1 基于 *P. putida* KT2440核心动力学模型的代谢控制分析揭示提升乙酰辅酶A可用性的关键操作靶点
乙酰辅酶A是中心碳代谢的关键中间体，也是大多数工业相关化合物的必需构建模块，与其他代谢节点高度互联。本研究首先探索了哪些干预措施在提高 P. putida KT2440乙酰辅酶A可用性方面最具潜力。为此，使用GRASP构建了代表 P. putida KT2440生化网络的动力学模型集成。该模型聚焦于中心碳代谢的反应，包含全面的动力学机制。基于菌株KT2440最新的基因组规模代谢重构（Belda等，2016；Nogales等，2020），核心动力学模型包含葡萄糖摄取（及糖的氧化衍生物）、糖酵解（以EDEMP循环体现）、磷酸戊糖途径和三羧酸（TCA）循环相关反应的详细描述（图1A及补充数据表S3）。此外，模型还包含（i）脂肪酸生物合成的三个关键反应，这些反应直接消耗乙酰辅酶A作为前体或使用该辅酶作为酰基供体（编码为ACCOAC、MCOATA和KAS15）；（ii）两个氧化磷酸化集合反应（NADH或醌依赖型）；（iii）五个辅因子再生反应，确保其在（伪）稳态条件下细胞内浓度平衡。其中，ACCOAC代表乙酰辅酶A羧化酶反应，提供丙二酰辅酶A作为脂肪酸合成的关键起始物。MCOATA和KAS15分别是由FabB[丙二酰辅酶A-酰基载体蛋白（ACP）转酰基酶]和FabH缩合酶催化的反应。这些反应通过将酰基辅酶A引物与丙二酰-ACP缩合来启动脂肪酸延伸循环（Mezzina等，2021；Thompson等，2020）。此外，为提高计算机模拟预测的准确性，重构中包含了菌株KT2440中心碳代谢42种酶的动力学机制（补充数据表S4与S5）。同时，关键酶已知的调控模式（如别构抑制或激活）——即Zwf（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）、GntZ（6-磷酸葡糖酸脱氢酶）、Edd（6-磷酸葡糖酸脱水酶）、Pyk（丙酮酸激酶）、苹果酸酶、异柠檬酸脱氢酶和柠檬酸合酶——也被添加到核心模型中（补充数据表S6）。为在给定反应集合下找到稳态通量分布，使用节俭酶使用通量平衡分析（pFBA）（Lewis等，2010）对iJN1463重构（Nogales等，2020）进行分析，以葡萄糖为碳源。模型以葡萄糖培养的 P. putida KT2440获得的通量值（Nikel等，2015）作为约束。首先进行一致性检查以验证模型（图S1），通过评估计算机模拟代谢敲除（葡萄糖转运蛋白）、敲低（Edd）和代谢扰动（ATP和NADPH缺乏）实现。模拟结果显示对 P. putida 代谢具有良好预测能力，例如归一化ATP、NADPH、乙酰辅酶A和丙酮酸浓度的时间分辨预测曲线（图S1）与先前报道的实验观察结果一致（Nikel等，2021）。以验证后的动力学模型为基础，运行代谢控制分析（MCA），以乙酰辅酶A浓度控制系数（CCC）的形式识别影响乙酰辅酶A可用性的反应（图1B及补充数据图S2），从而指导靶点评估过程。
尽管乙酰辅酶A节点具有高度互联性，仅少数生化反应被发现对辅酶稳态浓度有显著影响。如图1B所示，CCC绝对值最高的反应为PDH（v23，丙酮酸脱氢酶复合体，1.36）、AKGDH（v27，α-酮戊二酸脱氢酶，−0.41）、CS（v24，柠檬酸合酶，−1.09）、ACCOAC（v36，乙酰辅酶A羧化酶——更新模型中显式添加的反应之一，−0.26）和SUCDi（v28，琥珀酸脱氢酶组分，0.42）。PDH是模型中唯一产生乙酰辅酶A的反应，因此对稳态辅酶浓度具有高正向影响——即通过PDH的通量越高，乙酰辅酶A可用性越大。在消耗乙酰辅酶A的多个反应中，CS和ACCOAC对模拟辅酶浓度的影响最为显著。CS的影响似乎大于ACCOAC，这可能是因为前者的通量显著高于后者（Nikel等，2015）。由于丙二酰辅酶A仅需相对较低水平即可满足脂质生物合成需求（Polyak等，2012），ACCOAC的通量相对较低。AKGDH作为TCA循环的一部分，对乙酰辅酶A浓度具有中等负向影响，因其消耗辅酶A，从而与PDH竞争并影响乙酰辅酶A产生。有趣的是，SUCDi对辅酶可用性表现出正向效应——通过SUCDi的更高通量会将碳流从TCA循环转向糖异生（即使用苹果酸酶而非苹果酸脱氢酶），进而通过补充丙酮酸池导致PDH通量升高。然而，由于该酶复合体复杂的调控模式（Ku等，2020），通过直接操作同源基因提高PDH通量已被证明非常困难，因此放弃了这一可能性。另一方面，SUCDi是膜复合体，过表达同源基因同样棘手，可能导致蛋白质聚集。因此，pFBA和CCC分析指出了两个明显的下调代谢靶点：CS（由gltA编码，PP_4194）和ACCOAC（Acc，由accA（PP_1607）、accB（PP_0559）、accC（PP_0558）和accD（PP_1996）编码的四亚基复合体）。这两个反应在细菌生存中被认为是必需的（Tokuyama等，2019；Tovilla-Coutiño等，2020；Udaondo等，2016），通过基因敲除消除它们并不可行——这使其成为CRISPRi介导的同源基因转录调控的理想靶点，如下节所述。
【数据】CCC值：PDH 1.36；AKGDH −0.41；CS −1.09；ACCOAC −0.26；SUCDi 0.42；关键基因：gltA（PP_4194）、accA（PP_1607）、accB（PP_0559）、accC（PP_0558）、accD（PP_1996）
3.2 单靶点与双靶点CRISPRi敲低平衡了基因组精简 *P. putida* 菌株中的乙酰辅酶A水平
开发了一系列3-甲基苯甲酸（3-mBz）诱导型CRISPRi质粒（pMCRi），用于在 P. putida 中调节单基因和多基因靶标的表达（图2A）。pMCRi载体中引入BsaI限制性酶切位点便于针对不同基因的spacer直接克隆，该质粒中来自 Streptococcus pyogenes 的dCas9基因置于XylS/Pm表达系统的转录控制之下。与此同时，P. putida EM42——菌株KT2440的基因组精简衍生株（Martínez-García等，2014b）——被进一步重构以利于CRISPRi工具箱的使用，从而建立乙酰辅酶A依赖型生物生产平台菌株。由于 P. putida 代谢苯甲酸盐（Feist和Hegeman，1969；Jiménez等，2002），产生棕色产物[儿茶酚及其聚合物；Jiménez等（2014）]，在菌株EM42中删除了benABCD簇以消除3-mBz的氧化。该操作使3-mBz成为XylS/Pm系统的非代谢型（gratuitous）诱导剂，并允许在培养物中进行精确的OD600测量，不受儿茶酚及聚合产物通常造成的干扰。此外（原文截断，后续内容未提供）。
【数据】诱导剂：3-mBz（1 mM）；CRISPRi载体：pMCRi；dCas9来源：Streptococcus pyogenes；表达系统：XylS/Pm；菌株：P. putida EM42（KT2440基因组精简株）；基因缺失：benABCD簇
3.3 CRISPRi重构 *P. putida* 菌株的全网络比较蛋白质组学分析
菌株 P. putida SEM1.3携带分别靶向accA、gltA或同时靶向accA和gltA的pMCRi质粒，在补充了1%（w/v）葡萄糖、100 μg mL⁻¹ Sm和1 mM 3-mBz（作为CRISPRi诱导剂）的de Bont基础培养基中培养（图3）。蛋白质组学分析揭示了CRISPRi介导的基因抑制对全网络蛋白质水平的广泛影响（原文截断，详细结果未在节选中提供）。
【数据】培养基：de Bont基础培养基；葡萄糖：1%（w/v）；Sm：100 μg mL⁻¹；3-mBz：1 mM
3.4 *P. putida* 中聚(3-羟基丁酸酯)（PHB）生物合成合成途径的工程改造
在 P. putida 中工程改造了PHB生物合成途径（图4A）。经典途径与NphT7依赖型PHB生物合成路线并置展示。在替代路线中，NphT7介导丙二酰辅酶A依赖型的乙酰乙酰辅酶A合成。产生或消耗乙酰辅酶A的两个关键反应被突出显示（原文截断，详细结果未在节选中完整提供）。
【数据】PHB途径：经典途径与NphT7依赖型途径；关键反应：乙酰辅酶A产生与消耗
3.5 自动化生物反应器培养中重构 *P. putida* 菌株的聚(3-羟基丁酸酯)（PHB）生物合成
使用Ambr™ 250生物反应器系统对 P. putida 菌株（源自 P. putida SEM1.3）进行受控培养（图5A）。表中指示了不同菌株，相同颜色代码标识不同菌株（原文截断，详细结果未在节选中完整提供）。将细胞形态作为CRISPRi方法的额外靶点后，完全重构的 P. putida 菌株在利用葡萄糖的反应器培养中PHB滴度增加了5倍。
【数据】反应器：Ambr™ 250；碳源：葡萄糖；PHB滴度提升：5倍
讨论与解读
生物量积累与目标化合物生产之间不可避免的竞争是生物制造中公认的挑战——这种权衡影响（往往限制）产物滴度与生物工艺可放大性。对于源自中心代谢物的产品，这一问题尤为突出，因为中心代谢物既可转化为生物量组分，也可转化为目标化合物。因此，操纵代谢节点以将通量从中心前体代谢物转向生物生产，是建立稳健细胞工厂的关键。经典的靶点预测方法包括基于基因组规模或动力学模型的通量平衡分析指导方法，以及基于动力学模型的代谢控制分析。动力学集成建模近期已被证明在预测 P. putida KT2440代谢扰动影响方面非常有用。
本研究通过将精细的动力学模型与CRISPRi动态调控工具相结合，成功实现了对 P. putida 必需代谢基因的精准表达调控。8倍的乙酰辅酶A含量提升和5倍的PHB产量增加，有力验证了该策略的有效性。尤其值得关注的是，该方法适用于无法通过基因敲除消除的必需基因——这是代谢工程中长期存在的瓶颈。
编译者解读
本研究的核心价值在于"模型引导+动态调控"的策略整合。与传统的静态敲除不同，CRISPRi允许对必需基因进行可逆、可调的部分抑制，避免了完全失活带来的生长缺陷。动力学模型精确预测了乙酰辅酶A节点的控制位点，减少了盲目筛选的工作量。以PHB作为乙酰辅酶A可用性的报告分子，巧妙地将代谢物水平的变化转化为易于定量的聚合物产量。该策略的可推广性强——对于其他中心代谢物依赖型产物的生产，这一"计算预测-动态调控-产物验证"的闭环流程具有直接借鉴意义。局限在于，模型预测高度依赖输入数据的质量，且CRISPRi的抑制效率在不同靶基因位点间可能存在差异，需要进一步的系统优化。
参考来源
Kozaeva, E. (2021). Model-guided dynamic control of essential metabolic nodes boosts acetyl-coenzyme A–dependent bioproduction in rewired Pseudomonas putida. Metabolic Engineering, 2021.
DOI: 10.1016/j.ymben.2021.07.014
DOI: 10.1016/j.ymben.2021.07.014