苯甲醇生物合成及其亚细胞区室化

📅 2026-08-21 📰 Nat Commun 2026 Jul 13 📂 研究进展 👁 21

来源：Benzyl alcohol biosynthesis and its subcellular compartmentalization enable scent formation and salicylic acid production.（Nat Commun）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：CC BY-NC

📎 相关工具：蛋白可溶性优化分析

导读

苯甲醇是种子植物中广泛存在的芳香族醇类物质，既参与植物与环境互作，又是水杨酸苯丙氨酸依赖型合成途径中苯甲酸苄酯中间体的直接前体。然而，催化苯甲醇生成的酶长期未知。本研究通过经典生物化学、蛋白质组学与遗传学手段，在矮牵牛花中鉴定出两个仅差三个氨基酸的NADPH依赖型苯甲醛还原酶（PhBR1/PhBR2），证实其负责苯甲醇、苯甲酸苄酯及水杨酸甲酯的生成，并揭示该酶在病原菌侵染时对水杨酸积累的关键作用。

研究背景

苯甲醇是一种带有温和甜香气的简单芳香醇，存在于多种植物的花、果实和叶片中。它在半数以上的种子植物科中均有分布，通常只是花香的微量组分，但在茉莉花、杏梅及多种茶树中含量较高。苯甲醇在植物-环境互作中发挥多重功能：作为传粉者吸引物引发天蛾触角反应；通过驱避食草动物或经三营养级互作发挥防御作用；在干旱胁迫下参与植物间通讯；其释放还能促进植物生长发育。此外，苯甲醇是苯丙氨酸依赖型水杨酸合成途径中苯甲酸苄酯的直接前体。然而，催化植物体内苯甲醇生成的酶一直未被鉴定。本研究旨在利用矮牵牛花中苯甲醇高产的特性，通过经典生化手段鉴定该关键酶。

研究方法

植物材料与培养条件

野生型及转基因矮牵牛（Petunia hybrida cv. Mitchell diploid, W115, Ball Seed Co.）植株在标准温室条件下培养，光照时间为6:00至21:00。鉴于PhBR1和PhBR2序列一致性高达99.4%，选用PhBR1中300 bp（CDS核苷酸727–1026）的片段用于同时靶向两个基因，该片段与PhBR2仅有两个碱基差异。

克隆前，利用Sol Genomics Network VIGS工具（http://vigs.solgenomics.net/）验证该片段仅靶向目的基因而不会产生脱靶效应。分析将PhBR1-RNAi靶序列与P. axillaris和P. inflata（矮牵牛的亲本系）基因组进行比对，采用默认参数。预测结果显示，由PhBR双链RNAi触发子产生的小干扰RNA不会靶向其他基因。RNAi片段以矮牵牛花蕾cDNA为模板，用基因特异性引物（补充表3）PCR扩增获得，产物插入pDONR/Zeo载体（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）。序列验证后，利用LR Clonase II（Invitrogen）重组至目的载体pK7GWIWG2(II)，构建由CaMV 35S启动子控制的RNAi表达盒。所得构建体转化农杆菌菌株LBA4404，通过农杆菌介导的叶盘转化法获得转基因矮牵牛植株。

【数据】光照时间：6:00-21:00；RNAi片段：300 bp（CDS 727–1026）；序列一致性：99.4%；转化菌株：LBA4404

苯甲醛还原酶的部分纯化

取开花后第1天（21:00–22:00时采收）的矮牵牛花瓣，液氮速冻后于−80°C保存备用。所有纯化步骤均在冰上或4°C进行。取10克花瓣组织，在液氮中用研钵研磨成细粉，加入45 mL蛋白提取缓冲液，含磷酸盐缓冲液（137 mM氯化钠、2.7 mM氯化钾、10 mM磷酸氢二钠、1.8 mM磷酸二氢钾）、10%（v/v）甘油、10 mM二硫苏糖醇和1 mM苯甲基磺酰氟。匀浆继续研磨10分钟，冰上孵育30分钟并频繁混匀。经双层Miracloth（MilliporeSigma, Burlington, MA, USA）过滤后，滤液于4°C、10,000 × g离心30分钟。收集上清液（粗提物），以10%递增方式加入硫酸铵，从40%饱和度至70%饱和度。每步温和旋转20分钟后，12,000 × g离心10分钟。各沉淀步骤所得蛋白沉淀用10 mL缓冲液A（20 mM Tris, pH 7.4, 10%（v/v）甘油）重悬，检测苯甲醛还原酶活性（补充图3）。收集50–60%硫酸铵饱和度的组分，经Econo-Pac 10DG脱盐柱（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）按说明书脱盐后进一步纯化。脱盐样品经0.45 μm滤膜过滤，上样至预平衡的Mono Q 5/50 GL阴离子交换柱（GE Healthcare, Chicago, IL, USA），使用FPLC系统（AKTA, GE Healthcare）以0.5 mL min⁻¹流速运行。用5 mL缓冲液A洗涤后，以0–500 mM NaCl线性梯度（20 mL）洗脱。收集0.5 mL/管组分，检测苯甲醛还原酶活性，并以12% SDS-PAGE电泳结合考马斯亮蓝R-250染色分析。Mono Q色谱的6个组分（MonoQ 18–23）用于蛋白质组学分析。

【数据】花瓣用量：10 g；提取缓冲液：45 mL；硫酸铵分级：40%→70%（每步10%递增）；离心：10,000 × g 30 min / 12,000 × g 10 min；层析柱：Mono Q 5/50 GL；流速：0.5 mL/min；洗脱梯度：0–500 mM NaCl（20 mL）；收集：0.5 mL/管

MonoQ组分的蛋白质组学分析

MonoQ 18–23组分中的蛋白质经变性、还原和烷基化处理：在含12 mM脱氧胆酸钠、12 mM月桂酰肌氨酸钠和100 mM三乙基碳酸氢铵（TEAB）的缓冲液中，添加10 mM三(2-羧乙基)膦和40 mM氯乙酰胺，95°C振荡孵育10分钟。孵育后，样品用50 mM TEAB稀释5倍，加入MS级胰蛋白酶（Thermo Scientific），酶与蛋白比1:50（w/w），37°C酶解过夜。加入三氟乙酸至终浓度1%（v/v）终止酶解。为去除表面活性剂，加入等体积乙酸乙酯，涡旋2分钟，20,000 × g离心2分钟。弃去上层有机相，重复去污步骤一次。水相经真空离心干燥，用0.1%甲酸（FA）重悬，经自制的C18 StageTips（Empore™ SDB-XC）脱盐。肽段浓度用Pierce™定量比色肽段测定试剂盒（Thermo Scientific）按说明书测定。各组分等体积分装后干燥，用于后续LC-MS/MS分析。

肽段用0.1% FA复溶，按说明书加载至Evotips Pure（EvoSep）。色谱分离在Evosep One LC系统偶联timsTOF HT质谱仪（Bruker）上完成，采用60 SPD方法。分离柱为PepSep C18柱（8 cm × 150 μm, 1.5 μm; Bruker），连接CaptiveSpray离子源，配备20 μm ZDV喷雾发射器。流动相A为0.1% FA水溶液，流动相B为0.1% FA乙腈溶液。timsTOF HT以dia-PASEF模式运行，可变窗口宽度覆盖m/z 300–1200。离子淌度范围设为0.6–1.5 V cm⁻²。累积和斜坡时间均设为100 ms，12次数据非依赖采集-平行累积串行碎裂（dia-PASEF）扫描的总循环时间为1.38 s。碰撞能量（CE）从1.6 V cm⁻²时的59 eV线性降至0.6 V cm⁻²时的20 eV。TIMS维度在正离子模式下用三种Agilent ESI调谐混合离子校准：622.0289（0.9848 V cm⁻²）、922.0097（1.1895 V cm⁻²）和1221.9906（1.3820 V cm⁻²）。

原始LC-MS/MS数据用Spectronaut™ v18（Biognosys）通过directDIA（无库）流程处理。MS/MS谱图用Pulsar搜索引擎检索P. axillaris基因组编码的蛋白序列，消化酶设为trypsin/P，肽段长度5–52个氨基酸。半胱氨酸的氨基甲酰甲基化设为固定修饰，蛋白N端乙酰化和甲硫氨酸氧化为可变修饰（最多5个）。肽段谱图匹配、肽段和蛋白组的错误发现率均设为0.01。保留时间预测采用局部回归校准，鉴定通过动态大小设为库的0.1部分的突变诱饵生成进行验证。定量在MS2水平进行，关闭跨运行归一化，数据基于Q值过滤，不填补缺失值。

【数据】酶解条件：37°C过夜；酶与蛋白比：1:50（w/w）；终止浓度：1% TFA；离心：20,000 × g 2 min；质谱模式：dia-PASEF；m/z范围：300–1200；离子淌度：0.6–1.5 V cm⁻²；循环时间：1.38 s；FDR：0.01

重组蛋白的异源表达与纯化

为验证矮牵牛cv. Mitchell中PhBR1和PhBR2的编码序列，用一对同时靶向两个基因的引物（补充表3）从花蕾cDNA中扩增其编码序列（CDS）。PCR产物纯化后克隆测序，获得对应PhBR1和PhBR2的两个不同序列。PhBR1和PhBR2的编码序列由Twist Bioscience（South San Francisco, CA, USA）合成，针对大肠杆菌表达进行密码子优化。PhCAD1的编码序列及本氏烟草（N. tabacum）……

【数据】基因合成：Twist Bioscience；表达宿主：大肠杆菌；密码子优化：是

▲ a β-Oxidative pathway for benzaldehyde and benzyl alcohol biosynthesis in petunia flowers. 3O3PP-CoA 3-oxo-3-phenylpropanoyl-CoA, BPBT benzoyl-CoA:benzyl alcohol/2-phenylethanol benzoyltransferase, BS benzaldehyde synthase, CHD cinnamoyl-CoA hydratase/dehydrogenase, CNL cinnamate-CoA ligase, KAT 3-k

研究结果

苯甲醛还原酶的鉴定

我们前期研究显示，矮牵牛花中PhBS基因的下调可降低苯甲醇和苯甲酸苄酯水平，而将β-氧化苯甲醛生物合成途径在本氏烟草中重构并添加苯丙氨酸饲喂，可产生高水平的苯甲醇。这些结果连同氘标记苯丙氨酸和苯甲酸的饲喂实验，以及²H₇-苯甲醇饲喂实验（显示苯甲醛向苯甲醇转化的可逆性），共同表明苯甲醇源自苯甲醛。苯甲醛向苯甲醇的转化可能由醛还原酶或醇脱氢酶催化。迄今为止，催化苯乙醛还原为2-苯乙醇的苯乙醛还原酶（PARs）已在番茄、玫瑰和杨树中被鉴定。尽管这些酶具有底物混杂性，体外可利用苯甲醛作为底物，但其对番茄中苯甲醛的催化效率不足对苯乙醛的3%，而玫瑰PAR对苯甲醛的活性为苯乙醛活性的47%。除PARs外，来自拟南芥、桉树（Eucalyptus gunnii）和苜蓿（Medicago sativa）的非典型CADs在体外也表现出苯甲醛还原活性。因此，我们在矮牵牛亲本之一Petunia axillaris（贡献矮牵牛约96%的基因空间）基因组中搜索PAR和CAD同源物。选取氨基酸序列相似性≥70%的候选基因（补充表1），分析其表达谱及已知矮牵牛花香生物合成基因在花冠两个发育阶段（花前第1天和第2天）及昼夜循环三个时间点的RNA-Seq数据。PAR和CAD同源物在香气释放高峰（21:00）附近的表达量低至极低（<25 TPM），与花香基因相比差异显著——但Peaxi162Scf00016g02329除外，该基因表达水平较高且与花香生物合成基因相关。因此，将该基因编码的蛋白在大肠杆菌中重组表达并分析底物特异性（补充图2）。生化鉴定确认该酶为真正的CAD，命名为PhCAD1，对苯甲醛的活性可忽略不计。因此，采用经典生物化学方法鉴定负责苯甲醇生成的酶。

利用开花后第1天和第2天21:00时采集的矮牵牛花瓣粗提物分析BR活性。在NADPH作为还原辅因子的条件下检测到高效的苯甲醇生成，而NADH存在时仅观察到该活性的9.4–11.4%（图1b和c）。缺乏辅因子或含变性粗提物的对照反应未检测到产物，表明苯甲醇生成依赖于一个假定的BR，该酶催化苯甲醛以NADPH为主的还原反应生成相应醇（图1b）。通过硫酸铵沉淀（50–60%饱和度；补充图3）和MonoQ阴离子交换色谱（图1d）对BR进行部分纯化，比活性提高达27倍，回收率8%（表1）。MonoQ 18–23组分（比活性42.6至2529.2 pKat·mg蛋白⁻¹）用于蛋白质组学分析（图1e）。在timsTOF质谱仪上采集的MS/MS谱图检索Petunia axillaris基因组编码的蛋白序列，鉴定出2853种蛋白质。将肽段丰度谱与各组分BR活性比较，筛选出45个候选蛋白呈现相关丰度模式。鉴于BR的辅因子依赖性，进一步筛选含NAD(P)结合结构域的候选蛋白，获得两个蛋白：Peaxi162Scf01125g00411和Peaxi162Scf00956g00411。相应cDNA从Petunia hybrida中获得，基于下文结果，编码蛋白分别命名为矮牵牛苯甲醛还原酶1和2（PhBR1和PhBR2）（图1e）。有趣的是，这些蛋白属于生物信息学分析鉴定的CAD同源物（补充表1和补充图1），与AtCAD7和AtCAD8具有72–74%的序列同源性。此外，组分蛋白质组中还检测到另外5个CAD同源物（补充表1和补充图1），但它们丰度极低且与BR活性不相关（图1e），表明其对苯甲醇生成的贡献有限。

表1 矮牵牛花瓣中苯甲醛还原酶的纯化

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| 粗提物（10 g组织） | 7219 | 77.13 | 93.60 | 1.00 | 100.00 |

| 硫酸铵（50–60%） | 4470 | 12.08 | 370.0 | 3.95 | 61.92 |

| MonoQ-18 | 16.7 | 0.39 | 42.58 | 0.45 | 0.23 |

| MonoQ-19 | 49.4 | 0.30 | 165.9 | 1.77 | 0.68 |

| MonoQ-20 | 586.8 | 0.30 | 1945 | 20.78 | 8.13 |

| MonoQ-21 | 574.8 | 0.23 | 2529 | 27.02 | 7.96 |

| MonoQ-22 | 133.5 | 0.26 | 520.5 | 5.56 | 1.85 |

| MonoQ-23 | 23.07 | 0.25 | 93.90 | 1.00 | 0.32 |

PhBR1和PhBR2分别编码39.5 kDa和39.4 kDa的蛋白，各含一个醇脱氢酶GroES样结构域和一个NAD(P)结合Rossmann折叠结构域。两者一致性达99.2%，仅三个氨基酸差异：PhBR1的Ser82、Trp97和Thr327对应PhBR2的Asn82、Cys97和Ile327（补充图4）。系统发育分析显示，PhBR1和PhBR2属于CAD多基因家族的II类，该家族属于中链脱氢酶/还原酶（MDR）超家族（补充图5和6）。与含有保守基序和活性位点残基、参与木质素单体生物合成的I类真CADs不同，II类成员在底物结合口袋存在氨基酸替换，导致底物特异性更广或改变、Km值普遍更高、对木质素单体底物的催化活性降低，提示它们在植物体内执行多种生理功能。

【数据】NADH活性：NADPH的9.4–11.4%；纯化倍数：27倍；回收率：8%；MonoQ比活性：42.6–2529.2 pKat/mg；鉴定蛋白数：2853；候选蛋白：45个；PhBR1/PhBR2分子量：39.5/39.4 kDa；序列一致性：99.2%；与AtCAD7/8同源性：72–74%

▲ a Cofactor preferences of PhBRs for reducing benzaldehyde to benzyl alcohol. b PhBR-catalyzed reduction and oxidation reactions with benzaldehyde in the presence of 1 mM NADPH and benzyl alcohol in the presence of 1 mM NADP + , respectively. c Substrate specificities of PhBR1 and PhBR2. Activities w

PhBRs的生化表征

在大肠杆菌中重组表达并经亲和色谱纯化的PhBR1和PhBR2（补充图7）的生化表征揭示，两种酶均催化NADPH依赖的苯甲醛还原反应（图2a）。NADH存在时，PhBR1和PhBR2分别仅表现出NADPH活性的1.5%和8%（图2a），与粗提物中检测到的水平相当（图1c）。鉴于PhBRs属于能催化可逆反应的MDR超家族，以苯甲醇为底物、NADP⁺为辅因子评估其醇脱氢酶活性。PhBR1和PhBR2的氧化活性分别仅为各自还原活性的2.9%和9.2%（图2b），表明这些酶强烈偏向正向还原反应。尺寸排阻色谱显示PhBR1和PhBR2的表观分子量分别约为77和73 kDa（补充图8），提示这两种酶以同源二聚体形式发挥活性。两种酶的pH最适值略有不同：PhBR1在pH 7.5时活性最高，PhBR2在pH 8.6时最高（补充图9a），两者均在44°C时表现出最大活性（补充图9b）。

▲ 图1 矮牵牛花第2天15:00时不同组织（花、叶、茎）及花发育阶段（花蕾至花后第7天，15:00时）中PhBR1和PhBR2的表达谱（a、b）。数据为平均值±SEM（a中n=3个生物学重复，b中n=4个生物学重复）。c 花发育过程中及两个昼夜循环中粗提取物的BR活性。组织于9:00时（灰色）和21:00时（白色）采集。数据为平均值±SEM（n=3个生物学重复）。源数据见源数据文件。

【数据】NADH相对活性：PhBR1为NADPH的1.5%，PhBR2为8%；氧化活性：PhBR1为还原活性的2.9%，PhBR2为9.2%；表观分子量：PhBR1约77 kDa，PhBR2约73 kDa；pH最适：PhBR1为7.5，PhBR2为8.6；最适温度：44°C

PhBRs的表达模式

▲ a PhBR1 and PhBR2 transcript levels at 21:00 h in day 2 post-anthesis petunia flowers from wild type (WT), empty vector control (EV), and three transgenic RNAi lines (28, 45, and 73). Data are presented relative to WT set as 1 and are means ± SEM ( n = 11, 4, 3, 4, and 3 biological replicates for WT

【数据】表达分析时间点：15:00；组织类型：花不同组织、叶、茎；发育阶段：花蕾至花后第7天；生物学重复：组织实验n=3，发育实验n=4

RNAi沉默对苯甲醇及水杨酸代谢的影响

▲ a 空载体对照（EV）和三个转基因RNAi系（28、45和73）茎中PhBR1和PhBR2转录本水平。数据为平均值±SEM（n=3个生物学重复）。b 经模拟处理（10 mM MgCl₂）和Psm感染后，空载体对照（EV）和三个转基因RNAi系（28、45和73）茎中PhBR1和PhBR2转录本水平。数据为平均值±SEM（n=3个生物学重复）。（a–c）中P值通过单因素方差分析（Dunnett多重比较检验，相对于EV对照）确定并显示。c EV和三个转基因RNAi系茎组织中的SA水平。

【数据】RNAi株系：28、45、73；生物学重复：WT n=11，EV n=4，RNAi株系各n=3-4；挥发物测定重复：WT n=15，EV和RNAi株系各n=10；统计方法：单因素方差分析+Dunnett多重比较

▲ The phylogeny was inferred by the Maximum Likelihood method and Whelan-Goldman WAG model of amino acid substitutions and the tree with the highest log likelihood is shown. The tree is drawn to scale, with branch lengths measured in the number of substitutions per site. The analysis involved 106 amin

【数据】系统发育分析：最大似然法；WAG模型；序列数：106条；同源序列检索阈值：80%氨基酸序列一致性；PTS1信号：C端[S/A]-[K/R]-[L/M/I]

▲ Enzymes responsible for each biochemical reaction are shown in bold. Transporters involved in metabolite trafficking between peroxisomes (purple) and cytosol (blue) are shown as orange boxes with question marks for hypothetical transporters. High production of benzaldehyde and benzyl alcohol in N. t

【数据】区室化定位：过氧化物酶体或细胞质（物种特异性）；转运蛋白：推测存在但未鉴定（问号标注）

讨论与解读

苯甲醇是至少50个植物科花香成分的组成部分，也为部分水果和茶增添风味。随着近期在十字花科以外的维管植物中发现经苯甲酸苄酯的苯丙氨酸依赖型水杨酸合成途径，产生苯甲醇的植物种类大幅扩展。然而，此前尚无植物体内负责苯甲醇生物合成的基因被报道。在花香和风味器官之外，苯甲醇通常仅积累至极低甚至检测不到的水平。本研究利用矮牵牛花中苯甲醇高生成量的特性，通过经典生化方法鉴定出编码PhBRs的基因。鉴定出的PhBRs及来自多种植物的同源物在CAD多基因家族II类中形成独特的BR亚组。进一步的生化与遗传学分析证明，该亚组成员负责苯甲醇的产生，并参与经苯甲酸苄酯中间体的水杨酸生物合成。此外，PhBR同源物在开花植物中的亚细胞定位具有物种特异性——定位于过氧化物酶体或细胞质——表明不同物种采用不同的区室化组织方式执行苯丙氨酸依赖型水杨酸生物合成。

编译者解读

本研究采用经典生化纯化路线（硫酸铵分级+阴离子交换+蛋白质组学关联分析）而非直接反向遗传学筛选，成功鉴定了长期悬而未决的苯甲醛还原酶，体现了传统方法在酶发现中的不可替代价值。PhBR1与PhBR2仅三个氨基酸差异却共享同一生物学功能，为研究MDR超家族底物特异性的分子决定簇提供了理想体系。值得注意的是，该酶在矮牵牛中定位于细胞质，而其他物种中部分同源物含过氧化物酶体靶向信号——这种区室化差异可能影响水杨酸合成的通量分配，对合成生物学中跨物种途径重构具有直接参考意义。未来若能在作物中调控该酶表达，或可同时优化花香性状与病原防御能力。

参考来源

Lee JH, Huang XQ, Bergman ME, Morgan JA, Liu YK. Benzyl alcohol biosynthesis and its subcellular compartmentalization enable scent formation and salicylic acid production. Nat Commun. PMID: 42443198.

PMID: 42443198

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