来源：Effects of an Isolate of Bacillus subtilis on Southern Blight Severity of Aconitum carmichaelii Debeaux and Its Rhizosphere Microbial Community.（Plants (Basel)）| 编译：DNA Lab Space
导读
乌头（Aconitum carmichaelii）是我国重要药用作物，其白绢病由罗尔斯氏菌（Sclerotium rolfsii）引起，可造成严重产量损失。本研究在田间条件下评估了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）FZ-7菌株对白绢病的生物防治效果，并利用高通量测序揭示了其对根际细菌和真菌群落的调控机制。结果表明，FZ-7菌株对白绢病的相对防治效率达72.43%，并能通过重塑根际微生物群落结构、恢复有益微生物互作关系来抑制病害。
研究背景
乌头（毛茛科）是传统中医药中重要的多年生草本植物，其加工侧根"附子"富含二萜生物碱，广泛用于治疗心血管疾病、类风湿性关节炎及多种炎症性疾病。我国乌头种植历史悠久，主产于四川、云南和陕西等省份，是当地农民的重要经济作物。然而，土传病害严重威胁乌头的产量和品质，尤其是白绢病和根腐病，在四川省可造成每年60%–80%的产量损失。
白绢病由坏死营养型真菌Sclerotium rolfsii（有性型：Athelia rolfsii）引起，典型症状包括萎蔫、根腐以及茎基部或根部出现白色菌丝和褐色菌核。该病原菌产生的菌核可在土壤中存活多年，使病害防控极为困难。目前生产上主要依赖化学杀菌剂（如多菌灵和咯菌腈）进行防治，但化学农药的过度使用引发了环境污染和食品安全等严重问题。因此，开发可持续的生物防治策略具有重要意义。
研究方法
4.1 田间试验与样品采集
田间试验设于中国四川省江油市大康镇（104.82° E, 31.85° N），共设置24个试验小区。该地区长期实行乌头与水稻轮作制度。田间表土检测显示土壤pH接近中性，为6.95；土壤有机质含量丰富，为35.46 g/kg；全量养分浓度分别为全氮2.01 g/kg、全磷0.81 g/kg、全钾13.24 g/kg；速效养分含量分别为碱解氮201.7 mg/kg、Olsen-P 71.5 mg/kg、速效钾173.9 mg/kg。所有小区采用一致的田间管理和农艺操作，以排除外部环境变量的干扰。
乌头幼苗购自江油市当地专业中药材种植合作社，于2024年12月10日移栽。种植布局采用20 cm行距和15 cm株距。枯草芽孢杆菌FZ-7菌株分离并保存于四川省农业科学院经济作物研究所。
试验设置四个处理组：空白对照（C）、单接B. subtilis（B）、单接Sclerotium rolfsii（S）、S. rolfsii与B. subtilis共接（BS）。每个处理包含6个独立小区作为生物学重复，每小区面积为2 m × 5 m，含300株植物。
含1 × 10⁷孢子/毫升的B. subtilis水悬液在出苗后10天通过根灌方式施用，每株50 mL。施入生防菌10天后，在指定接种组的根区土壤表面以下5 cm深处接种约30个S. rolfsii菌核。对照组施用等体积无菌蒸馏水代替两种微生物制剂。
病原菌接种60天后采集根际土壤，同时记录各处理发病率和病情指数。每处理收集6个生物学重复，每个重复的混合样品由10株随机选取的单株亚样品混合而成。将地上部茎叶和地下根茎分离，测量鲜生物量。植物组织带回实验室后，分别在70°C下烘干72小时，称重获得干生物量数据，操作步骤参照Ren等[48]的方案。
根际土壤采样严格无菌操作：轻轻抖落根系上松散的大块土壤，保留附着于根表面的约1 mm薄层土壤。用消毒毛刷刷取紧密结合的根际土壤，立即转移至1.5 mL离心管中。采集的土壤样品置于保温冰盒中，4小时内送达实验室。每个土壤重复分为两份：一份在−80°C保存用于后续总基因组DNA提取，另一份风干用于土壤理化性质测定。
由S. rolfsii引起的白绢病严重度按照Li[49]建立的分级标准进行评分。五级分级标准定义为：0级：根茎无任何坏死病斑；1级：少量分散病斑，覆盖根茎总表面积小于25%；2级：中度病斑覆盖，占根茎组织的25%–50%；3级：大面积病斑占据根茎的50%–75%；4级：融合坏死病斑覆盖整个根茎的75%–100%。根据测定的严重度等级，按文献[50]报道的计算公式计算最终病情指数：
病情指数 = （各严重度等级发病株数 × 相应等级值之和）/（调查总株数 × 病害最高等级值）× 100
【数据】试验地点：四川江油（104.82° E, 31.85° N）；土壤pH：6.95；有机质：35.46 g/kg；全氮：2.01 g/kg；全磷：0.81 g/kg；全钾：13.24 g/kg；碱解氮：201.7 mg/kg；Olsen-P：71.5 mg/kg；速效钾：173.9 mg/kg；移栽日期：2024年12月10日；行距：20 cm；株距：15 cm；小区面积：2 m × 5 m；植株数：300株/小区；B. subtilis浓度：1 × 10⁷孢子/mL；灌根量：50 mL/株；菌核接种量：约30个/株；接种深度：5 cm；采样时间：接种后60天；烘干条件：70°C、72 h
4.2 根际土壤理化性质测定
土壤理化性质按照已发表文献[51,52]中的成熟分析方案测定。土壤pH用赛多利斯pH计（中国深圳）测定，土水比为1:2.5。阳离子交换量（CEC）采用铵饱和扩散法[53]测定。土壤有机质（OM）含量采用重铬酸钾-硫酸氧化法[54]测定。全氮（TN）用半微量凯氏消煮法[55]定量。经高氯酸-硫酸消煮后，全磷（TP）采用钼锑抗比色法[56]检测。全钾（TK）采用钠熔结合火焰原子吸收光谱法[57]分析。碱解氮（AN）采用碱性高锰酸钾滴定法[58]测定。速效磷（AP）先用0.5 M碳酸氢钠溶液（pH 8.5）提取，再用钼锑抗比色法分析，使用UV-2600紫外-可见分光光度计（梅特勒-托利多，中国上海）在700 nm波长处测定[59]。速效钾（AK）用醋酸铵溶液提取后定量[60]。
【数据】土水比：1:2.5；NaHCO₃浓度：0.5 M；pH 8.5；测定波长：700 nm；仪器：Sartorius pH计、UV-2600紫外-可见分光光度计
4.3 DNA提取与测序
使用DNeasy PowerSoil Kit（QIAGEN，杜塞尔多夫，德国）从250 mg根际土壤样品中提取总基因组DNA，严格遵循制造商标准方案。提取的DNA纯度和完整性首先通过1%琼脂糖凝胶电泳（120 V，30 min）检测，同时使用NanoDrop ND-2000分光光度计（Thermo Scientific，威尔明顿，特拉华州，美国）A260/280比值初步检测DNA浓度。此外，使用Qubit 2.0荧光计（Life Technologies，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）进行精确DNA定量。所有DNA样品统一调整至5 ng·μL⁻¹浓度、终体积20 μL，冻干后送至诺禾致源（中国天津）进行16S rRNA和ITS扩增子测序（Illumina NovaSeq 6000，PE250，圣迭戈，加利福尼亚州，美国）。
细菌分析中，16S rRNA基因的V3–V4高变区用引物对515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3′）[61]扩增。真菌ITS1区域用通用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）[62]扩增。所有扩增产物在诺禾致源按标准实验流程在Illumina NovaSeq平台上测序。
细菌测序数据的生物信息学分析使用R 4.10软件进行。DADA2包中嵌入的Cutadapt插件（v2.10）用于从NovaSeq原始读数中修剪引物序列[63]。原始序列用DADA2流程处理和分类注释[64]。具体而言，正向和反向读数分别修剪至240 bp和200 bp，以最小12 bp重叠合并；含有超过18个预测错误的读数被丢弃。去除嵌合体序列并对序列去重复以获得扩增子序列变异体（ASVs），然后对照SILVA v138数据库进行分类注释[65]。真菌双端序列使用QIIME2进行解复用。通过Cutadapt 5.2去除接头和引物并进行质量过滤后，使用DADA2工具进行单端去噪。真菌ITS序列的分类鉴定使用UNITE 8.0数据库[66]。ASVs以97%序列相似性阈值分类，所得数据转换为BIOM格式。仅保留在至少一个样品中相对丰度高于0.01%的ASV用于后续分析。
【数据】DNA提取量：250 mg土壤；电泳条件：1%琼脂糖、120 V、30 min；DNA浓度：5 ng·μL⁻¹；终体积：20 μL；测序平台：Illumina NovaSeq 6000（PE250）；细菌引物：515F/806R（V3–V4区）；真菌引物：ITS1F/ITS2（ITS1区）；正向读长修剪：240 bp；反向读长修剪：200 bp；最小重叠：12 bp；最大预测错误数：18；分类数据库：SILVA v138（细菌）、UNITE 8.0（真菌）；相似性阈值：97%
研究结果
2.1 白绢病对乌头产量和病情指数的影响
与未接种对照（C）相比，单独接种B. subtilis（B）显著促进了乌头的生长，使地上部鲜重从3.01 kg增至3.45 kg，根茎鲜重从4.01 kg增至4.96 kg，地上部干重从0.69 kg增至0.85 kg，根茎干重从1.02 kg增至1.35 kg（图1）。相比之下，单独接种S. rolfsii（S）严重抑制了植物生长，鲜重和干重均大幅下降：地上部鲜重降至2.11 kg，根茎鲜重降至2.15 kg，地上部干重降至0.42 kg，根茎干重降至0.51 kg，较对照分别下降29.9%、46.4%、39.1%和50.0%。
值得注意的是，B. subtilis与S. rolfsii共接（BS）有效缓解了病原菌引起的生长抑制。与单独接种S. rolfsii处理相比，BS处理的地上部鲜重增加41.2%（达2.98 kg），根茎鲜重增加73.0%（达3.72 kg），地上部和根茎干重分别恢复至0.62 kg和0.86 kg，与未接种对照水平接近。
空白对照组（C）和单独接种B. subtilis组（B）均未观察到病害症状，发病率和病情指数均保持为0（表1，图S1）。仅接种S. rolfsii的S组发病率达100%，病情指数高达76.29。两菌共接的BS组发病率降至36.22%，病情指数降至21.03，相对防治效率达72.43%。各处理间差异显著，证实B. subtilis能有效抑制S. rolfsii引起的病害损伤，对乌头白绢病具有突出的生物防治潜力。
【数据】B处理地上部鲜重：3.45 kg（对照3.01 kg）；B处理根茎鲜重：4.96 kg（对照4.01 kg）；B处理地上部干重：0.85 kg（对照0.69 kg）；B处理根茎干重：1.35 kg（对照1.02 kg）；S处理地上部鲜重：2.11 kg（−29.9%）；S处理根茎鲜重：2.15 kg（−46.4%）；S处理地上部干重：0.42 kg（−39.1%）；S处理根茎干重：0.51 kg（−50.0%）；BS处理地上部鲜重：2.98 kg（较S+41.2%）；BS处理根茎鲜重：3.72 kg（较S+73.0%）；BS处理地上部干重：0.62 kg；BS处理根茎干重：0.86 kg；S组发病率：100%；S组病情指数：76.29；BS组发病率：36.22%；BS组病情指数：21.03；相对防治效率：72.43%
2.2 Illumina NovaSeq PE250测序结果总体特征
共对24份土壤样品基于条形码标记的扩增子序列进行区分和分析。真菌鉴定方面，所有样品共产生2,067,807条环化共有序列（CCS）读数，单个样品产生78,274至93,074条读数（平均86,159条）。细菌分类注释方面，共获得1,510,624条CCS读数，每样品52,455至82,629条（平均62,942条）。经质量过滤、条形码处理和嵌合体去除后，高质量有效读数的比例超过98%。平均每个样品产生65,962条优化的真菌CCS读数，其中超过95%的质量评分≥30。细菌方面，平均每样品优化的CCS读数为46,866条，有效率为97%，超过91%的序列评分≥Q30。这些指标证实测序数据足够可靠和稳健，可用于下游生物信息学分析。细菌和真菌OTU的稀释曲线均在大约每样品20,000条序列处趋于平缓，表明测序深度充分捕获了根际微生物多样性的大部分信息（图2）。
【数据】真菌CCS总数：2,067,807条；真菌单样品CCS范围：78,274–93,074条（均值86,159）；细菌CCS总数：1,510,624条；细菌单样品CCS范围：52,455–82,629条（均值62,942）；高质量有效读数比例：>98%；真菌优化CCS均值：65,962条/样品（≥Q30比例>95%）；细菌优化CCS均值：46,866条/样品（有效率97%，≥Q30比例>91%）；稀释曲线平台期：约20,000条序列/样品
2.3 OTU韦恩图分析
24份土壤样品平均产生7,795个细菌操作分类单元（OTU）和3,360个真菌OTU，覆盖率分别超过97%和98%。这些数值表明测序深度足以支持根际微生物群落可靠的后续分析。
构建韦恩图以直观展示健康和患病样品中OTU的分布，突出共有和特有分类群。细菌方面，四个处理共有的OTU为2,112个（图3A），构成核心根际微生物组。B处理检出的独有细菌OTU最多（702个），其次是BS（623个）、S（617个）和C（593个）。真菌群落方面（图3B），四组共有488个OTU。B处理的独有真菌OTU数量最高（419个），其次是BS（435个）、S（370个）和C（317个）。
综合来看，这些发现表明各处理维持了由独有和共有分类群组成的独特微生物组合。值得注意的是，BS共接组拥有丰富的独有OTU，暗示B. subtilis与S. rolfsii的联合互作重塑了根际微生物结构。同时，大量共有OTU表明乌头根际存在相对稳定的核心群落，而各处理特有的OTU则显示了核心群落之外的明显变化。
【数据】细菌OTU均值：7,795个/样品；真菌OTU均值：3,360个/样品；细菌覆盖率：>97%；真菌覆盖率：>98%；细菌共有OTU：2,112个；独有细菌OTU：B=702、BS=623、S=617、C=593；真菌共有OTU：488个；独有真菌OTU：B=419、BS=435、S=370、C=317
2.4 根际土壤微生物群落Alpha多样性分析
进行Alpha多样性分析以评估根际土壤中细菌和真菌的丰度、多样性和均匀度。细菌群落方面（图4A），各处理间的Alpha多样性指数存在显著差异：Simpson、Shannon、Chao1和ACE指数呈极显著差异（p < 0.01），observed species和PD_whole_tree指数呈显著差异（p < 0.05）。单独接种S. rolfsii组的细菌均匀度最高，Shannon和Simpson指数分别达8.61和0.98，显著高于对照组。单独接种B. subtilis组的细菌多样性也显著高于C组，而共接组BS的细菌丰富度和系统发育多样性最低，observed species和PD_whole_tree分别降至1,840.83和173.13。
真菌群落方面（图4B），全部六项Alpha多样性指数在四个处理间也表现出极显著差异（p < 0.001）。与细菌群落的趋势不同，与对照组相比，单独接种B. subtilis组的真菌丰富度、均匀度和系统发育多样性显著升高，observed species从837.33增至922.00，Shannon指数从5.03升至5.43，PD_whole_tree从311.32增至336.41。相反，单独接种S. rolfsii组的所有真菌Alpha多样性指数较C组显著降低，而共接组的真菌多样性在所有处理中最低，observed species、Shannon指数和PD_whole_tree分别降至569.00、3.99和233.79。
综合来看，这些结果表明接种B. subtilis和/或S. rolfsii显著改变了乌头根际真菌和细菌群落的Alpha多样性，其中真菌群落对共接处理更为敏感，而细菌群落对单一病原菌接种表现出更明显的响应。
【数据】细菌—S组Shannon指数：8.61、Simpson指数：0.98；BS组observed species：1,840.83、PD_whole_tree：173.13；细菌指数差异：Simpson/Shannon/Chao1/ACE p < 0.01，observed species/PD_whole_tree p < 0.05；真菌—B组observed species：837.33→922.00、Shannon：5.03→5.43、PD_whole_tree：311.32→336.41；BS组真菌observed species：569.00、Shannon：3.99、PD_whole_tree：233.79；真菌指数差异：全部p < 0.001
2.5 根际微生物群落组装
基于Bray-Curtis相异度的主坐标分析（PCoA）用于评估接种处理对乌头根际微生物群落整体结构的影响。细菌群落方面（图5A），前两个主坐标（PC1和PC2）分别解释了总变异的46.61%和17.22%，样品按处理明显分离。未接种对照、B. subtilis接种、S. rolfsii接种和共接组形成明显不同的聚类，表明各处理间细菌群落组成存在显著差异。真菌群落方面（图5B），PC1和PC2分别解释了43.05%和19.85%的变异。各处理样品在排序空间中清晰分离，C、B、S和BS组形成明显且不重叠的聚类。
这些结果表明，接种处理显著改变了乌头根际微生物群落的整体结构，且细菌和真菌群落的响应模式存在差异。
【数据】细菌PCoA：PC1=46.61%、PC2=17.22%；真菌PCoA：PC1=43.05%、PC2=19.85%
2.6 根际微生物群落组成与生物标志物分析
在门和属水平上对根际细菌和真菌群落的相对丰度进行了分类学总结（图6）。细菌群落在门水平以放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）为主要优势类群；属水平上，各处理间的优势属组成存在差异。真菌群落在门水平以子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）为主。
基于相对丰度构建了四个处理中丰度前100属的细菌和真菌系统发育树（图7）。
利用线性判别分析效应大小（LEfSe）鉴定根际微生物生物标志物（图8）。细菌生物标志物包括乳杆菌属（Lactobacillus）、候选硝化螺菌属（Candidatus Nitrosotalea）、罗德杆菌属（Rhodanobacter）和鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）等；真菌生物标志物包括毛壳菌属（Trichocladium）、锥盖伞属（Conocybe）、丛赤壳属（Plectosphaerella）和阿太菌属（Athelia）等。BS组中芽孢杆菌属（Bacillus）、楚氏杆菌属（Chujaibacter）和罗德杆菌属（Rhodanobacter）显著富集。
【数据】细菌生物标志物：Lactobacillus、Candidatus Nitrosotalea、Rhodanobacter、Sphingomonas；真菌生物标志物：Trichocladium、Conocybe、Plectosphaerella、Athelia；BS组富集类群：Bacillus、Chujaibacter、Rhodanobacter
2.7 微生物群落与环境因子的关联
冗余分析（RDA）三元图展示了微生物群落与土壤理化特性之间的关系（图9A）。Mantel检验表明微生物群落与土壤性质之间存在相关性，并通过Pearson相关进行两两比较（图9B）。前20个微生物属与土壤环境因子的Pearson相关系数热图显示（图9C），土壤有机质、pH和阳离子交换量是塑造微生物群落组成的主要环境因子。CEC：阳离子交换量；OM：有机质；TN：全氮；TP：全磷；TK：全钾；AN：碱解氮；AP：速效磷；AK：速效钾。*表示显著性p < 0.05，**表示显著性p < 0.01。
【数据】主要环境因子：土壤有机质（OM）、pH、阳离子交换量（CEC）；显著性阈值：* p < 0.05、** p < 0.01
2.8 共现网络分析
基于细菌属水平构建了四个处理的共现网络（图10）。节点大小与连接数（度）成正比，节点间连接颜色表示正相关（红色）或负相关（蓝色），节点颜色代表不同门类。共接S. rolfsii和B. subtilis（BS）部分恢复了微生物间的合作关系。
基于真菌属水平同样构建了共现网络（图11）。网络拓扑参数显示，不同处理间的网络复杂性和连接模式存在差异。BS处理的网络结构介于单独接种处理之间，表明共接处理在一定程度上恢复了微生物群落的合作性关联。
【数据】网络连接：正相关=红色、负相关=蓝色；节点大小=连接度（degree）
讨论与解读
S. rolfsii引起的白绢病是乌头最具破坏性的土传病害之一，导致严重产量损失和品质下降。本研究证明B. subtilis FZ-7在田间条件下有效抑制了白绢病并促进植物生长，相对防治效率达72.43%。该效率与已报道的其他芽孢杆菌菌株相当——B. velezensis YN-2-6S对乌头白绢病的田间防治效率为91.00%，B. subtilis JY-7-2L的防效最高达30%且持效期62天，B. velezensis Soil-4-2在2023年和2024年的防效分别为89.9%和68.0%。不同菌株间防效差异可能源于菌株特性、环境条件和试验年份的差异。
本研究提供了B. subtilis通过重塑根际微生物组组装、共现网络和土壤理化环境来抑制病害的新见解。图12总结了B. subtilis FZ-7多层面生物防治策略的机制模型。该菌株不仅通过直接拮抗作用，还通过调节根际微生物群落来发挥生防功能。
编译者解读： 该研究亮点在于将生防效果评估与根际微生态机制解析相结合，从"群落组装—网络互作—环境因子"多维度阐释了生防菌的作用方式。72.43%的田间防效和BS组根茎鲜重73.0%的恢复幅度具有实际应用价值。值得注意的是，单接B. subtilis显著提升真菌多样性而共接后多样性反而最低，这种非线性响应提示生防菌与病原菌的互作并非简单的叠加效应。未来若能在更多产区、多年份验证该菌株的稳定性，并进一步解析关键富集类群（如Rhodanobacter）的功能角色，将有助于推动其商业化应用。
参考来源
Sun X, Liu Y, Ye P, He L, Dai S. Effects of an Isolate of Bacillus subtilis on Southern Blight Severity of Aconitum carmichaelii Debeaux and Its Rhizosphere Microbial Community. Plants (Basel). PMID: 42588811.
PMID: 42588811