来源：Biodegradation of sulfonamide antibiotics through the heterologous expression of laccases from bacteria and investigation of their potential degradation pathways（Journal of Hazardous Materials）| 编译：DNA Lab Space
导读
磺胺类抗生素在环境中持续残留，对微生物群落和人类健康构成潜在威胁。本研究将七种细菌来源的漆酶基因分别与三种信号肽（PelB、Lpp、Ompa）融合，在E. coli BL21 (DE3)中异源表达，用于降解磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺二甲嘧啶（SMZ）和磺胺甲噁唑（SMX）。结果显示重组菌株6#P在60小时对三种磺胺的去除率分别达到约92.0%、89.0%和88.0%。研究还鉴定了多种转化产物，提出了包括SO₂消除、羟基化、氧化、嘧啶环裂解和N-S键断裂在内的多条降解途径。
研究背景
抗生素不仅用于保护人类健康，还广泛用于畜牧业促进畜禽生长。然而，抗生素无法被人类和动物完全代谢，大量残留通过粪便和尿液排出，进入污水处理厂或直接进入环境。污水处理厂也无法彻底降解大部分抗生素。此外，许多国家将动物粪便用作肥料。因此，抗生素经常在污水处理厂、畜牧场、河水与沉积物、土壤、地下水、地表水甚至饮用水中被检出。环境中的抗生素残留可能对非靶标生物产生不利影响，污染食物和饮用水源，威胁水生生物，并通过选择性杀灭或抑制生态系统中的微生物而显著改变自然微生物群落，加速细菌耐药基因的扩散。漆酶作为一种多铜氧化酶，能够催化多种芳香族化合物的氧化，被认为在抗生素降解中具有应用潜力。本研究通过异源表达细菌漆酶，探索其降解磺胺类抗生素的可行性与机制。
研究方法
2.1 菌株、质粒与试剂
E. coli BL21 (DE3)和pET-22b质粒购自北京百赛生物科技有限公司。研究中使用的限制性内切酶和连接酶购自New England BioLabs（美国）。磺胺嘧啶（纯度≥99.0%）、磺胺二甲嘧啶（纯度≥99.0%）和磺胺甲噁唑（纯度≥99.0%）购自Sigma Aldrich（美国）。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。乙腈（HPLC级）购自天津康科德医药化工有限公司。所有其他化学试剂均为分析纯。所有实验在适用时均使用超纯水。
【数据】菌株：E. coli BL21 (DE3)；质粒：pET-22b；抗生素纯度：≥99.0%；试剂级别：分析纯；水：超纯水
2.2 pET-Ompa和pET-Lpp质粒的构建
Ompa信号肽来源于E. coli外膜蛋白，包含前21个氨基酸，编码序列为：ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCC。Lpp信号肽来源于E. coli脂蛋白，包含N端前9个氨基酸，编码序列为：ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCCAGCAACGCTAAAATCGATCAG。为了利用pET-Ompa和pET-Lpp质粒将异源蛋白分泌到细胞外，Lpp和Ompa的信号肽序列以及负责外源蛋白跨外膜锚定的序列由北京擎科生物科技有限公司合成，该序列主要由Ompa的第46–159位残基组成。pET-22b质粒用BamHⅠ和NdeⅠ在37°C酶切3小时。pET-22b片段和Lpp/Ompa片段使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit纯化。随后，将pET-22b骨架与Lpp或Ompa片段按3:1的浓度比混合，加入1.0 µL缓冲液和0.5 µL T4 DNA连接酶，16°C孵育过夜，构建新质粒pET-Ompa和pET-Lpp。
【数据】酶切温度：37°C；酶切时间：3h；连接比例：3:1；连接酶用量：0.5 µL T4 DNA连接酶；连接温度：16°C；连接时间：过夜
2.3 重组菌株的构建
漆酶基因lac1、lac2、lac3、lac4、lac5、lac6和lac7的序列（表1）在NCBI数据库中鉴定，并由北京擎科生物科技有限公司合成。使用SnapGene 4.1.9软件设计的引物（表2）通过聚合酶链式反应（PCR）扩增序列。PCR程序包括98°C初始变性30秒，随后35个循环的98°C变性10秒、50°C退火20秒、72°C延伸30秒，最后72°C终延伸5分钟。扩增产物连接到T载体，并使用引物M13F（5'-GTCGACAACTTGTGACGGAGGCG-3'）和M13R（5'-AGATGACATAAGCCAGATCTGTCGCTTC-3'）通过PCR验证。质粒pET-22b、pET-Ompa和pET-Lpp以及漆酶基因编码序列用限制性内切酶酶切，纯化后用T4 DNA连接酶连接，操作同2.2节所述。含目标基因的重组质粒导入E. coli DH5α感受态细胞进行扩增。转化子在含氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上37°C筛选14小时，并使用引物T7F（5'-AGAGGTTACCTGAACCGGCCGGAGC-3'）和T7R（5'-GTCGACTTCCAGCGGAGTCCGA-3'）通过PCR验证。提取的质粒由北京擎科生物科技有限公司测序。最后，含目标基因的重组质粒转入E. coli BL21 (DE3)获得重组表达菌株。
【数据】PCR变性温度：98°C；退火温度：50°C；延伸温度：72°C；循环数：35；筛选温度：37°C；筛选时间：14h；抗生素：氨苄青霉素
2.4 培养条件
重组菌株在含5.0 mL LB培养基（含100.0 μg/mL氨苄青霉素）的试管中，37°C、220 rpm培养8小时。活化后的重组菌株再转入含100.0 mL LB培养基（含氨苄青霉素）的250 mL锥形瓶中，37°C培养24小时。所得种子培养液用于接种LB培养基，初始光密度（OD600）为0.2。当OD600达到0.8–1.0时，加入IPTG（1.0 mM）诱导表达，20°C、220 rpm继续培养24小时。
【数据】培养基：LB；氨苄青霉素浓度：100.0 μg/mL；培养温度：37°C；转速：220 rpm；初始OD600：0.2；诱导OD600：0.8–1.0；IPTG浓度：1.0 mM；诱导温度：20°C；诱导时间：24h
2.5 生物降解实验
鉴于抗生素经常组合使用，环境中检出的大多数抗生素也以混合物形式存在。因此，制备了1.0 g/L的SDZ、SMZ和SMX储备混合液。为研究重组菌株的磺胺类抗生素（SAs）去除效率，在加入IPTG后24小时，将终浓度为1.0 mg/L的抗生素混合物加入培养基中。为进一步探讨介体对重组菌株降解SAs的影响，在加入混合物的同时加入终浓度为1.0 mM的ABTS、HBT或SA。生物对照组将重组菌株转移到不含抗生素的培养基中。非生物对照组加入抗生素但不接种细菌。所有实验均设三次重复。
【数据】抗生素混合物终浓度：1.0 mg/L；介体浓度：1.0 mM；重复次数：3
2.6 分析方法
为定量SDZ、SMZ和SMX浓度的变化，在0、12、24、36、48和60小时收集1.5 mL样品，4000 g离心10分钟。上清液经0.22 µm孔径聚偏氟乙烯（PVDF）膜过滤（参照Gao等2018年方法）。取滤液（10.0 µL）用配备HyPURITY C18色谱柱（250 × 4.6 mm，5 µm）的SIL-20AXR高效液相色谱仪（岛津，日本）在30°C测定抗生素含量。流动相为含0.1%甲酸的30%乙腈水溶液，流速1.0 mL/min。洗脱液在265 nm波长监测，SDZ、SMZ和SMX的保留时间分别为3.9分钟、4.6分钟和6.2分钟。SAs降解率计算公式为：去除率（%）= 100% ×（C₀ − Cₜ）/ C₀，其中C₀（mg/L）为SAs初始浓度，Cₜ（mg/L）为t时刻培养基中SAs浓度。为测定SDZ、SMZ和SMX的转化产物，取过滤样品（10.0 µL）用配备电喷雾/四极杆飞行时间高分辨率质谱仪（ESI-Q-TOF）的MicroTOF Q-II仪器（Bruker Daltonics，美国）进行液相色谱-质谱联用分析。流动相和色谱柱同上。ESI源在正离子模式（ESI+）下运行，离子喷雾电压为5000 V，质量范围为m/z 150–1500。生物量变化通过使用常规分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司，中国）测量600 nm处光密度（OD600）来跟踪。
【数据】进样量：10.0 µL；色谱柱：HyPURITY C18（250 × 4.6 mm，5 µm）；柱温：30°C；流动相：30%乙腈+0.1%甲酸；流速：1.0 mL/min；检测波长：265 nm；保留时间：SDZ 3.9min、SMZ 4.6min、SMX 6.2min；离子喷雾电压：5000 V；质谱范围：m/z 150–1500
2.7 统计分析
使用Microsoft Excel 2019（微软，美国）进行统计分析。对照组与抗生素处理组之间均值差异的显著性使用Student's t检验确定。p值<0.05的差异被认为具有统计学显著性。
【数据】统计方法：Student's t检验；显著性水平：p<0.05
研究结果
3.1 pET-Lpp/pET-Ompa质粒及重组菌株的构建
根据文献中细菌漆酶成功异源表达的报道，选择了七个漆酶基因（表1）。为探究细菌漆酶氨基酸序列之间的相似性，使用DNAMAN软件进行多序列比对，如图1所示。Streptomyces ipomoeae漆酶的氨基酸序列与Bacillus菌株差异较大，而Bacillus菌株之间差异较小。它们均含有四个典型的保守氨基酸序列，即L1: VKTVVHLHG；L2: WYHDHAMALTR；L3: HPIHLHLVSF；L4: HCHILEHEDYDMMRP。其中，L1和L3是漆酶特有的保守序列，而L2和L4存在于所有多铜氧化酶家族中。这四个保守区域含有一个半胱氨酸残基和十个组氨酸残基，它们是活性中心铜原子的配体。使用SWISS-MODEL在线工具获得由三个结构域组成的漆酶蛋白三维结构（图S1）。
信号肽在异源蛋白分泌中起关键作用。PelB和Ompa信号肽因其强大的分泌能力而常用于E. coli。Mukherjee等（2004）报道，当单链抗体片段（scFv）与PelB信号序列融合时，90.0%的重组scFv片段被E. coli分泌到培养上清液中，胞外scFv浓度高达160 mg/L。Li等（2012）报道，来自Paenibacillus macerans JFB05–01的cgt基因与Ompa信号肽结合后在E. coli BL21 (DE3)中成功表达。当同时加入Gly和Triton X-100并孵育48小时，胞外α-CGTase活性达到48.0 U/mL，比不加任何添加剂的对照组高20倍。Lpp信号肽用于细胞表面展示技术。与其他外膜蛋白不同，靶向和插入外膜所需的全部信息都位于信号肽序列的前9个氨基酸中。来自七种不同细菌的漆酶基因分别克隆到pET-22b/pET-Lpp/pET-Ompa质粒中，最终在E. coli BL21 (DE3)中表达，用于SAs的降解（图S1和S2）。
【数据】保守序列：L1: VKTVVHLHG、L2: WYHDHAMALTR、L3: HPIHLHLVSF、L4: HCHILEHEDYDMMRP；保守残基：1个半胱氨酸+10个组氨酸；scFv分泌率：90.0%；scFv浓度：160 mg/L；α-CGTase活性：48.0 U/mL
3.2 重组菌株对SAs降解的影响
如图2所示，携带不同信号肽的重组菌株对SAs的去除率不同，且没有明显趋势。数字1–7分别代表漆酶基因lac1、lac2、lac3、lac4、lac5、lac6和lac7；字母P/L/O分别代表信号肽PelB、Lpp和Ompa。例如，7#O代表携带漆酶基因lac7和Ompa信号肽的重组菌株。对SAs降解效果最好的是携带B. vallismortis fmb-103漆酶基因的重组菌株（图2F），而表达B. subtilis X1基因的菌株降解效率最低（图2B）。对SDZ、SMZ和SMX降解效果最高的重组菌株顺序分别为7#O>6#P>4#L>1#O>3#P>5#L（图2G1、F1、D1、A1、C1和E1）、6#P>1#O>4#L>3#P>5#L>7#O（图2F2、A2、D2、C2、E2和G2）和6#P>4#P>1#O>2#P>3#P>5#L（图2F3、D3、A3、B3、C3和E3）。最高去除率分别约为97.0%（图2G1，方形）、89.0%（图2F2，五边形）和88.0%（图2F3，圆形）。类似地，从Pleurotus ostreatus HAUCC 162获得的三种漆酶同工酶（LACC6、LACC9和LACC10）在Pichia pastoris中表达并表征，60分钟内对SDZ、SMZ和SMX的降解率分别达到约98.1%、97.5%和97.8%。然而，本研究中的漆酶基因来源于细菌。这些结果表明，漆酶基因的异源表达是废水中SAs降解的潜在策略。此外，在三种磺胺类药物中，SDZ和SMZ表现出良好的生物降解性，而SMX则更难降解。一般来说，化学结构的差异导致降解途径的不同。SDZ和SMZ的磺酰胺基连接在含有两个N取代基的六元环上，N-C键不稳定且容易断裂。相比之下，SMX的磺酰胺基连接在五元环结构上，角张力小且相对稳定，但具体原理需要进一步研究。
【数据】最高去除率：SDZ约97.0%、SMZ约89.0%、SMX约88.0%；对照漆酶降解率（60min）：SDZ 98.1%、SMZ 97.5%、SMX 97.8%
3.3 中间产物的鉴定及可能的转化途径
为研究SAs可能的转化途径，收集对SAs有明显降解效果的重组菌株1#P、3#P、4#P、6#P、4#L、5#L、7#L、1#O、3#L、6#L和7#L在0、24和60小时的上清液，通过ESI-Q-TOF分析转化产物。使用含抗生素但不含重组菌株的等量混合物作为对照组，以消除抗生素自发分解对目标产物信号峰的干扰。在所有系统中共检测到十种SDZ转化产物，包括SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6、SD7、SD8、SD9和SD10，m/z分别为187、203、172、283、175、281、215、174、159和267。质谱图和可能的化学式见表S2和图S4。可以推断出SDZ的五种可能转化途径（图3a）。首先，SD1b或SD1a（m/z为187）通过从SDZ中消除SO₂或重排形成。随后，SD1b失去-NH形成SD3（m/z为172）。或者，SD1a的苯胺环可以被羟基化形成SD2（m/z为203），这与Zhang等（2019）和Xu等（2020）的报道相似。其次，SDZ苯环上潜在的N7-H裂解位点和嘧啶环被羟基化形成SD4（m/z为283）。随后，SD4被•OH自由基进一步攻击，嘧啶环被裂解，S8-N9键断裂形成SD5（m/z为175）。第三，SDZ可以被直接氧化形成常见的氧化产物SD10（m/z为281）。第四，SDZ的两个C-N键不稳定，容易被带负电的反应物攻击。因此，SDZ的嘧啶环裂解形成SD7（m/z为215）。SD7的潜在S8-N9攻击位点被裂解并羟基化形成SD8（m/z为174）。随后，SD8失去NH₂形成SD9（m/z为159）。最后，SDZ的C5或C15位点被羟基化形成SD10a和SD10b（m/z为267）。
在所有系统中共检测到六种SMZ转化产物，包括SM1、SM2、SM3、SM4、SM5和SM6，m/z分别为295、215、245、158、188和174。质谱图和可能的化学式见表S3和图S5。可以推断出SMZ的四种可能转化途径（图3b）。首先，SMZ的N7或N9位点被•OH自由基直接攻击生成SM1a或SM1b（m/z为295）。其次，SMZ失去SO₂生成SM2a（m/z为215），N7位点容易被氧化生成SM3a（m/z为245）。第三，SM2b（m/z为215）通过重排生成，随后N7位点氧化生成SM3b（m/z为245）。第四，SMZ的S8-N9键可以断裂生成SM4（m/z为158）。随后，S8位点被•OH自由基攻击生成SM6（m/z为174），或者N7位点可以被氧化……
【数据】SDZ转化产物：10种（m/z 187、203、172、283、175、281、215、174、159、267）；SMZ转化产物：6种（m/z 295、215、245、158、188、174）
3.4 介体对SAs降解的影响
如图4所示，ABTS（1.0 mM）的添加对大多数携带不同信号肽的重组菌株去除磺胺类药物有轻微促进作用，特别是对重组菌株2#O。HBT（1.0 mM）对磺胺类药物去除的影响因重组菌株而异（图5）。SA（1.0 mM）对磺胺类药物的去除有轻微抑制作用，其中对菌株7#L和7#O的影响最为显著（图6）。不同介体对携带不同信号肽的不同重组菌株生物量的影响如图7所示。
【数据】ABTS浓度：1.0 mM；HBT浓度：1.0 mM；SA浓度：1.0 mM
讨论与解读
本研究通过将七种细菌来源的漆酶基因与三种不同信号肽（PelB、Lpp、Ompa）融合，在E. coli中实现了异源表达，并系统评估了重组菌株对三种磺胺类抗生素的降解能力。结果表明，信号肽类型对降解效率没有呈现一致的规律性影响，但不同组合的降解效果存在显著差异。最佳重组菌株6#P在60小时对SDZ、SMZ和SMX的去除率分别达到约92.0%、89.0%和88.0%。研究还鉴定了多种转化产物，提出了包括SO₂消除、羟基化、氧化、嘧啶环裂解和N-S键断裂在内的多种降解途径。不同介体通过不同机制参与抗生素降解，不同抗生素对同一介体的响应也不同。
编译者解读
该研究展示了合成生物学策略在环境修复中的应用潜力——通过信号肽筛选实现细菌漆酶的分泌表达，为磺胺类抗生素的生物降解提供了可行的酶学工具。研究亮点在于系统比较了三种信号肽和七种漆酶基因的组合效应，并借助高分辨质谱解析了降解途径。值得肯定的是，研究使用了混合抗生素体系，更贴近实际污染场景。不过，实验仍处于摇瓶水平，距离实际废水处理应用还有距离；介体对降解的促进作用有限，且SA表现出抑制效应，说明介体选择需要针对具体菌株和底物进行优化。未来可考虑定向进化漆酶以提高其氧化还原电位，或通过固定化技术增强酶的稳定性与重复使用性。
参考来源
Yang, L.-H. (2021). Biodegradation of sulfonamide antibiotics through the heterologous expression of laccases from bacteria and investigation of their potential degradation pathways. Journal of Hazardous Materials, 2021. DOI: 10.1016/j.jhazmat.2021.125815
DOI: 10.1016/j.jhazmat.2021.125815