来源：A copper-enhanced magnetic biochar-laccase composite achieves synergistic removal of tetracyclines（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space
导读
四环素类抗生素（TCs）在环境中持续残留，对生态安全和公共健康构成严重威胁。本研究在毕赤酵母中异源表达了来自血红密孔菌的漆酶HMLac，并构建了载铜磁性生物炭固定化漆酶复合物CuMBC@HMLac。该复合物在6小时内对四种四环素类抗生素的去除效率达到90.57%–100%，且稳定性、金属离子耐受性和可重复使用性均显著优于游离酶。研究通过LC-QTOF-MS鉴定了转化产物，结合分子对接和自由基分析揭示了ABTS·+介导的协同去除机制。
研究背景
四环素类抗生素因广谱抗菌活性、高效和低成本而被广泛应用于人畜医学。统计数据显示，2017年TCs占欧盟兽用抗菌药物销售总量的30.4%，2019年占中国兽用抗生素使用总量的36.56%。TCs亲水性高，高达75%未被代谢的TCs被排泄到环境中，导致环境浓度超过国际兽药协调会议（VICH）推荐的生态风险阈值。TCs在环境中持久存在，可在土壤和水体沉积物中积累，抑制植物光合作用、改变微生物群落结构并传播抗生素抗性基因。现有物理和化学处理方法虽能有效去除TCs，但适用性有限、降解不完全、运行成本高，亟需开发高效、经济且环境友好的TCs污染控制策略。
研究方法
2.1 化学试剂、菌株与质粒
本研究所用菌株、载体、抗生素、氧化还原介体及其他试剂的详细信息见补充材料（Text S1）。
2.2 血红密孔菌漆酶的异源表达与纯化
HMLac基因序列（GenBank: HM106994.1）经密码子优化后，通过EcoRI和NotI限制性酶切位点克隆插入pPIC9K载体（图S1）。pPIC9K-HMLac质粒经SalI线性化后电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞。阳性转化子先在含梯度浓度G418（0–10 mg/mL）的葡萄糖最小培养基（MD）上初步筛选，随后通过小规模表达诱导鉴定高活性克隆。基因组整合通过PCR验证，使用AOX1-F/R引物（α-factor: 5′-TACTATTGCCAGCTATGCTGC-3′; 3′ AOX: 5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′）。PCR反应体系见表S1。详细实验流程见补充材料Text S2。蛋白表达参照He等[16]的方案进行优化。简言之，最终筛选的阳性转化子在BMGY培养基中培养，并在含0.05 mM Cu²⁺的BMMY培养基中诱导表达，每24小时添加0.25%甲醇，30°C条件下培养8天。培养上清液经Ni-TED琼脂糖树脂6FF（Yeasen Biotechnology, China）纯化，随后进行SDS–PAGE和Western blot分析。为表征毕赤酵母表达系统中的糖基化修饰，纯化蛋白经EndoH（Yeasen Biotechnology, China）处理。
【数据】基因：HMLac（GenBank: HM106994.1）；载体：pPIC9K；酶切位点：EcoRI/NotI；线性化：SalI；宿主：P. pastoris GS115；G418浓度：0–10 mg/mL；Cu²⁺浓度：0.05 mM；甲醇添加量：0.25%/24h；诱导时间：8d；温度：30°C；纯化介质：Ni-TED Agarose Resin 6FF
2.3 CuMBC@HMLac的制备
#### 2.3.1 Cu-MBC的制备
玉米秸秆（取自中国江苏连云港某农场）作为生物炭（BC）生产的原料。风干玉米秸秆先经高速粉碎机粉碎，过60目筛。处理后的样品在管式炉中、500°C、限氧条件下热解2小时。自然冷却至室温后，生物炭经研磨并过100目筛用于后续实验。
CuMBC通过共沉淀和吸附法合成。FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O按化学计量比溶解于超纯水中，与BC在50°C下混合，调节pH至10。经孵育、磁分离和干燥后获得磁性生物炭（MBC）。铜离子通过吸附法负载到MBC上，在CuSO₄缓冲液中以120 rpm、25°C吸附12小时。离心洗涤至检测不到游离Cu²⁺后，最终获得CuMBC。Cu²⁺使用南京建成生物工程研究所的铜测定试剂盒检测。详细信息见补充材料Text S3。
【数据】原料：玉米秸秆；热解温度：500°C；热解时间：2h；筛网：60目/100目；共沉淀温度：50°C；pH：10；Cu²⁺吸附条件：120 rpm、25°C、12h
#### 2.3.2 HMLac的固定化
CuMBC@HMLac通过吸附法制备。简言之，将10 mg CuMBC分散于1 mL 50 mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 4.0）中，加入纯化的HMLac溶液。混合物在25°C、120 rpm条件下孵育不同时间，然后以12000 r/min离心10分钟。游离HMLac用50 mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 4.0）反复洗涤，直至洗涤上清液中检测不到HMLac活性。
采用单因素实验考察不同固定化时间（0–24 h）、酶浓度（0.035–0.243 mg/mL）和pH（4–8）对固定化的影响。优化后的CuMBC@HMLac储存于50 mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 4.0）中，4°C保存。CuMBC的固定化效率通过固定化前后上清液中酶浓度的差值计算。酶浓度使用BCA蛋白测定试剂盒（Beyotime, China）测定。
【数据】CuMBC用量：10 mg；缓冲液：50 mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 4.0）；固定化温度：25°C；转速：120 rpm；离心：12000 r/min、10min；固定化时间范围：0–24h；酶浓度范围：0.035–0.243 mg/mL；pH范围：4–8；储存条件：4°C
#### 2.3.3 材料表征
BC、MBC、CuMBC和CuMBC@HMLac的性能通过多种方法系统表征。每种表征方法的详细实验参数见补充材料Text S4。
2.4 游离与固定化HMLac酶学性质测定
#### 2.4.1 酶活测定
HMLac（游离酶）和CuMBC@HMLac（固定化酶）的酶活以ABTS为底物测定。200 μL反应体系含1 mmol/L ABTS（溶于50 mmol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH 4.0），加入适量酶溶液，30°C孵育5分钟。酶活通过监测420 nm处吸光度定量，一个酶活单位（U）定义为每分钟氧化1 nmol ABTS所需的酶量。
HMLac和CuMBC@HMLac的酶活分别按公式(1)和(2)计算：
(1) HMLac酶活(U/mL) = ΔA ÷ ε × d × V总 × 10⁹ ÷ V样 ÷ T
(2) CuMBC@HMLac酶活(U/g) = ΔA ÷ ε × d × V总 × 10⁹ ÷ V样 × W ÷ V样总 ÷ T
式中，ΔA为420 nm处吸光度增加值；ε（36,000 L/mol/cm）为ABTS摩尔消光系数；d（cm）为光径；V总（L）为反应总体积；V样（mL）为反应中样品体积；t（min）为反应时间；W（g）为样品质量；V样总（mL）为固定化体系体积。
【数据】底物：ABTS（1 mmol/L）；缓冲液：50 mmol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 4.0）；反应体积：200 μL；温度：30°C；时间：5min；检测波长：420nm；ε：36,000 L/mol/cm
#### 2.4.2 酶稳定性与可重复使用性分析
评估了HMLac和CuMBC@HMLac的pH稳定性、热稳定性和金属离子耐受性。相对活性以最大活性设为100%计算。考察了六种金属离子（Zn²⁺、Al³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺和Fe³⁺）对酶活的影响（详见Text S5）。
储存稳定性评估中，HMLac和CuMBC@HMLac样品在4°C和25°C下孵育30天，在第0、3、7、10、15和30天测定残余活性。以第0天测定的活性作为100%参考，计算整个储存期间的相对活性。所有测量均进行三次重复。
CuMBC@HMLac的可重复使用性通过连续八个反应循环评估。以ABTS为底物，按2.4.1节方案进行酶活测定。每轮循环后，固定化HMLac通过磁分离回收，用50 mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 4.0）洗涤，转移至新鲜反应介质中。每轮循环的相对活性以第一轮循环的活性为100%参考计算。每轮循环进行三次重复测量。
【数据】金属离子：Zn²⁺、Al³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺；储存温度：4°C/25°C；储存时间：30d；检测时间点：0、3、7、10、15、30d；重复使用循环数：8次
#### 2.4.3 酶动力学分析
参照Zou等[31]的方法，使用Michaelis-Menten方程测定HMLac和CuMBC@HMLac以ABTS为底物的酶动力学参数。
2.5 CuMBC@HMLac去除四环素类抗生素
#### 2.5.1 单因素实验
通过单因素设计系统考察了关键因素对TCs去除的影响，包括pH（3–8）、反应时间（0–6 h）、氧化还原介体（ABTS/HBT/SA，0–1 mmol/L）和HMLac浓度（0.035–0.273 mg/mL）。1 mL反应体系含10 mg/mL TCs（溶于50 mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液）、100 μL CuMBC@HMLac溶液及指定氧化还原介体。
介体评估设置六个实验组：（A）空白对照（无酶/介体）、（B）热灭活CuMBC@HMLac对照、（C）CuMBC@HMLac、（D–F）CuMBC@HMLac加一种特定氧化还原介体（丁香醛SA；2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)ABTS；或1-羟基苯并三唑水合物HBT）。所有反应在30°C、120 rpm连续振荡条件下进行三次重复。
TCs去除效率计算公式如下：去除效率(%) = (C₀ − Cₜ) ÷ C₀ × 100%，其中C₀为TCs初始浓度，Cₜ为t时刻TCs浓度（mg/L）。
【数据】pH范围：3–8；反应时间：0–6h；介体浓度：0–1 mmol/L；HMLac浓度：0.035–0.273 mg/mL；TCs浓度：10 mg/mL；反应体积：1mL；温度：30°C；转速：120rpm
研究结果
3.1 HMLac在毕赤酵母中的高效重组表达与分泌
重组质粒pPIC9k-HMLac经EcoRI和NotI双酶切验证，结果显示约1500 bp处出现目标条带（图S2）。线性化后获得约10,700 bp的单一条带（图1a）。线性化质粒电转化至GS115感受态细胞后，48小时在MD平板上观察到白色单菌落（图1b）。随机选取12个菌落进行PCR检测，约1700 bp处出现条带（图1c），证实HMLac基因成功整合至酵母基因组。随后对转化子进行G418抗性初筛（图1d）和小规模诱导表达复筛（图1e）。结果显示转化子#8具有最高的HMLac酶活。
酵母表达系统具有操作简便、生长快速、遗传稳定性高和培养成本低的特点。更重要的是，该系统具备真核翻译后修饰能力，如蛋白水解加工[29,34]。糖基化是酵母表达系统在不同酵母物种中保守的内在特征[35]。然而，过度糖基化可能对酶的性质和活性产生不利影响[36]。本研究中，SDS–PAGE和Western blot分析显示纯化的HMLac分子量约为85 kDa（图1f）。经EndoH消化后，分子量降至约60 kDa（图1g）。该分子量与毕赤酵母特征性糖基化和HMLac理论分子量一致，也与先前报道的血红密孔菌漆酶分子量（61.4 kDa–80 kDa）相似[37,38]。这些结果表明HMLac在工程毕赤酵母中成功表达。
【数据】目标条带：~1500bp（双酶切验证）；线性化产物：~10,700bp；PCR条带：~1700bp；HMLac分子量：~85kDa；EndoH处理后：~60kDa；最高酶活转化子：#8
3.2 HMLac与CuMBC的固定化及表征
#### 3.2.1 HMLac在CuMBC上固定化的条件优化及Cu²⁺的作用
固定化时间和酶浓度对CuMBC固定化HMLac的效率有显著影响（图S3a, b）。低浓度HMLac（0.035–0.052 mg/mL）在3小时内即可达到100%固定化率。相比之下，较高浓度HMLac（0.177–0.243 mg/mL）需24小时才能达到100%固定化率。这一现象可能归因于CuMBC表面丰富的吸附位点，能够在早期阶段实现酶的快速固定化。在较高HMLac浓度下，延长固定化时间可使CuMBC与HMLac充分接触，从而提高固定化效率。初始HMLac浓度为0.097 mg/mL时，6小时固定化效率为90.81%，对应CuMBC@HMLac的最高相对酶活。较高的酶负载往往导致酶在载体上积累，阻止底物接近活性位点，从而降低酶活[39]。然而，Pandey等[40]报道初始酶量增加对酶固定化无显著影响。这些差异结果可能归因于固定化载体上结合位点丰度的不同。
此外，固定化体系的pH对漆酶的催化活性、空间构象和氧化速率也至关重要[41]。如图S3c所示，固定化HMLac在pH 4时活性最高，而pH高于6时活性显著降低（降至最高活性的8.17%）。多数研究表明，弱酸性条件可增强漆酶固定化[41,42]，这可能与漆酶的稳定性以及漆酶（等电点约3.5）与MBC（等电点约5.95）之间的静电吸引有关[43]。
Cu²⁺作为蓝色多铜氧化还原酶，对漆酶的催化活性也至关重要。本研究中，CuMBC@HMLac的酶活显著高于MBC@HMLac（图S4）。Cu²⁺可能通过特异性增强基因转录、促进蛋白正确折叠和组装以及稳定漆酶含铜催化中心来促进漆酶活性[29,44–46]。
【数据】低浓度HMLac（0.035–0.052 mg/mL）：3h达100%固定化；高浓度HMLac（0.177–0.243 mg/mL）：24h达100%固定化；最优初始浓度：0.097 mg/mL（6h固定化效率90.81%）；最佳pH：4；pH>6时活性降至最高活性的8.17%；漆酶等电点：~3.5；MBC等电点：~5.95
#### 3.2.2 改性生物炭和固定化HMLac的结构特征与磁回收性能
SEM–EDS分析（图2a–d）显示BC具有有序的管状束结构。磁性改性导致MBC和CuMBC表面出现团聚的球形团簇，同时孔径减小、表面粗糙度增加。CuMBC@HMLac的微孔结构为TCs提供了丰富的吸附位点。元素分析鉴定C、O和K为BC的主要元素。磁性改性导致MBC和CuMBC中Fe和O的比例显著增加（图S4）。
MBC和CuMBC的FTIR光谱在530 cm⁻¹（Fe-O振动）、786 cm⁻¹和1380 cm⁻¹（芳香族C-H弯曲）以及3291 cm⁻¹（-OH伸缩）处显示特征峰（图2f）。这些官能团积极参与与TCs的π-π电子供体-受体（EDA）相互作用，从而促进TCs在固定化载体上的吸附[47,48]。XRD图谱确认了特征性Fe₃O₄峰的存在（2θ = 30.3°、35.5°、43.1°、53.5°、57.0°和62.6°）（图2e），且酶固定化后CuMBC@HMLac中磁性晶体结构得以保持。所有MBC、CuMBC和CuMBC@HMLac均表现出超顺磁行为，如S形磁滞回线所示（图2g）。这一特性便于CuMBC@HMLac的磁回收和再利用，从而降低运营成本。MBC的饱和磁化强度为31.04 emu/g，依次负载Cu²⁺和HMLac后降至23.67 emu/g（图2g）。
【数据】FTIR特征峰：530 cm⁻¹（Fe-O）、786 cm⁻¹和1380 cm⁻¹（芳香C-H）、3291 cm⁻¹（-OH）；XRD特征峰：2θ=30.3°、35.5°、43.1°、53.5°、57.0°、62.6°；MBC饱和磁化强度：31.04 emu/g；CuMBC@HMLac饱和磁化强度：23.67 emu/g
3.3 固定化对HMLac环境耐受性的影响
#### 3.3.1 最适pH和最适温度
固定化显著增强了HMLac的pH和温度耐受性。HMLac和CuMBC@HMLac均在pH 3时表现出最高活性。然而，CuMBC@HMLac在pH 6时保留了初始活性的46.44%；相比之下，HMLac仅保留初始活性的16.95%（图3a）。已有研究表明，真菌漆酶通常在酸性条件（pH 3.6–5.2）下表现出最佳活性，主要因为真菌适宜在酸性环境中生长。相比之下，植物胞内漆酶的最适活性通常在生理pH（6.8–7.4）下观察到[49]。
此外，真菌漆酶的最适pH也取决于底物。与我们的发现一致，先前研究指出真菌漆酶氧化ABTS在pH低于4时最有效，而其他底物如2,6-二甲氧基苯酚、愈创木酚和丁香醛连氮则在更宽的pH范围（4–7）内被氧化[50]。此外，漆酶氧化速率、初级自由基的次级反应以及转化产物的形成也受pH变化的影响[50]。
CuMBC@HMLac在20°C至80°C的宽温度范围内保留了超过60%的相对活性，最适活性在70°C时观察到（图3b）。值得注意的是，漆酶的最适温度因来源不同而有显著差异。例如，糙皮侧耳和变色栓菌来源的漆酶通常在约55°C时表现出最适活性[51,52]，而血红密孔菌来源的漆酶最适活性接近70°C[53]。相比之下，细菌漆酶通常具有更优异的热稳定性[54]。
【数据】最适pH：3（两者）；pH 6时CuMBC@HMLac残余活性：46.44%；pH 6时HMLac残余活性：16.95%；CuMBC@HMLac温度范围：20–80°C（>60%相对活性）；最适温度：70°C
#### 3.3.2 pH稳定性和热稳定性
固定化可降低酶蛋白构象剧烈变化的概率，从而增强其在不同环境条件下的稳定性。
（原文此处截断，后续内容未提供）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究首先在毕赤酵母中实现了HMLac的异源表达，随后利用Cu²⁺对HMLac的激活作用，首次开发了载铜磁性生物炭作为HMLac的固定化载体，显著提高了固定化HMLac的活性、稳定性和可重复使用性。ABTS显著增强了TCs的去除效果，生物降解是CuMBC@HMLac/ABTS体系中TCs去除的主要机制。羟基化、脱氨基、氧化、脱羰基、水合、脱甲基和脱羟基是体系中TCs的主要转化途径，ABTS·+是TCs去除的关键因素。CuMBC@HMLac/ABTS体系对去除TCs具有环境安全性。这些发现为实现环境中TCs的绿色、高效和可持续修复提供了重要见解。
编译者解读
该研究的技术路线具有清晰的"酶工程-载体工程-应用验证"逻辑链条。将Cu²⁺负载于磁性生物炭载体上、利用其双重功能（既激活漆酶又作为吸附位点）是颇具巧思的设计——一种材料同时解决酶活性提升和污染物富集两个问题。固定化后酶在pH 6下残余活性从16.95%提升至46.44%，拓宽了实际应用场景。但需注意，研究中TCs去除是酶催化降解与载体吸附的协同结果，如何区分两种机制的相对贡献、以及固定化载体在连续流反应器中的长期运行稳定性，仍是后续工程化应用需要回答的问题。此外，Cu²⁺从载体上的潜在释放及其环境归趋也值得关注。
参考来源
Xu Xiangyue. A copper-enhanced magnetic biochar-laccase composite achieves synergistic removal of tetracyclines. Chemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.cej.2026.174661
DOI: 10.1016/j.cej.2026.174661