来源：Directed evolution of a thermostable laccase from Geobacillus stearothermophilus for efficient reduction of oxygen（Biochimie）| 编译：DNA Lab Space
导读
漆酶因能催化四电子氧还原为水而成为酶生物燃料电池阴极设计的核心酶类。真菌漆酶虽具有较高氧化还原电位，但热稳定性不足；细菌漆酶稳定性好却电位偏低。本研究从嗜热细菌 Geobacillus stearothermophilus 中鉴定并表征了一种新型漆酶 GbsLac，其最适温度达 70°C、熔解温度高达 91.8°C。通过定点突变 M503L 和 D438A，研究者成功将氧还原反应起始电位分别阳极位移约 120 mV 和 40 mV，为高性能生物阴极的开发提供了新方向。
研究背景
可持续且生物相容的燃料电池体系需要摆脱金属催化剂的负面影响，酶因此成为关注焦点。漆酶（EC No.:1.10.3.2）凭借催化四电子氧还原为水的能力，被视为构建高性能氧还原阴极的关键酶类。多种漆酶已被用于生物阴极的制备，但酶与电极之间的电连接、酶稳定性维持电导率、以及酶活性中心到电极的低电子传递速率导致的功率密度限制，始终制约着酶生物燃料电池的整体性能。
生物阴极通常优先选用真菌漆酶，因其氧化还原电位较高（ET1° > 720 mV），这被认为与 T1 铜轴向位点普遍存在的非配位苯丙氨酸/亮氨酸有关。相比之下，细菌漆酶中轴向甲硫氨酸（SMet）对 T1 铜的额外配位降低了 ET1°。尽管存在这一差异，细菌漆酶在多种生物技术应用中的可靠性已得到验证。寻找同时具备高氧化还原电位和优异稳定性的漆酶，成为该领域的关键需求。
研究方法
2.1 菌株、酶与化学试剂
Geobacillus stearothermophilus（MTCC 1518T）购自印度昌迪加尔微生物类型培养物保藏中心与基因库（Microbial Type Culture Collection and Gene Bank）。限制性内切酶、DNA 连接酶和 Dpn I 购自美国 New England Biolabs（NEB）。ABTS、丁香醛连氮（syringaldazine）、2,6-DMP 和考马斯亮蓝 G-250 购自 Sigma Aldrich。Phusion DNA 聚合酶购自 Thermo Scientific。BL21 Codon Plus RIL 菌株和 pET28a(+) 载体为实验室库存。其余实验用化学品和溶剂均为分析纯级。
【数据】菌株：G. stearothermophilus MTCC 1518T；试剂来源：NEB/Sigma Aldrich/Thermo Scientific；菌株与载体：BL21 Codon Plus RIL、pET28a(+)
2.2 生物信息学分析
在 G. stearothermophilus 全基因组分析中鉴定到一个注释为多铜氧化酶家族蛋白的基因，蛋白 ID 为 WP_033015742.1。使用 Clustal Omega 对来自真菌和细菌来源的多种漆酶进行多序列比对，以识别保守氨基酸序列。酶的 3D 结构（UniProt ID: A0A0K9HLC6）取自 AlphaFold 数据库。为验证结构，生成了 PAE 和 PLDDT 图（图 S1）。使用 Auto Dock Vina 对 AlphaFold 预测的酶结构与底物进行分子对接。计算蛋白（GbsLac）与配体（丁香醛连氮，Compound CID: 135401234）复合物的结合能。网格盒的 XYZ 坐标分别设为 8.769、15.215 和 0.704，盒子尺寸设为 50 × 52 × 40，exhaustiveness 值为 8，能量范围为 4。对接结果获得 9 种不同结合能的结合构象，其中选择第二种构象，结合能为 −6.4 kcal/mol。
【数据】对接软件：Auto Dock Vina；结合能：−6.4 kcal/mol；网格坐标：8.769, 15.215, 0.704；盒子尺寸：50 × 52 × 40；exhaustiveness：8；能量范围：4；构象数：9
2.3 *G. stearothermophilus* 漆酶的克隆、过表达与纯化
G. stearothermophilus 在营养肉汤中于 55°C、180 rpm 条件下培养 24 小时。使用 DNA 提取试剂盒（Zymo Research，美国）提取基因组 DNA。编码多铜氧化酶的基因使用热循环仪（Bio-Rad，美国）进行 PCR 扩增（引物列于表 S1）。扩增产物经 Qiaquick® 凝胶提取试剂盒（Qiagen，德国）纯化，随后使用 T4 DNA 连接酶（NEB）克隆至 pET28a(+) 的 BamHI 和 XhoI 位点之间，受 Plac 启动子控制。所得重组载体（pLac-His）转化至 E. coli DH5α 感受态细胞。挑取阳性转化子并提取 pLac-His，用于转化表达宿主 BL21 Codon Plus (RIL)。细胞涂布于含 50 μg/ml 卡那霉素和 34 μg/ml 氯霉素的 LB 琼脂平板进行筛选。为过表达重组酶，含有重组质粒的 BL21 Codon Plus (RIL) 细胞在含适当抗生素的 LB 培养基中于 37°C、180 rpm 振荡培养至 OD600 达到 0.4。用 IPTG（0.3 mM）和 CuSO4（500 μM）诱导表达。诱导后，培养物于 18°C、150 rpm 恒温振荡 20 小时。细胞在 8°C 下以 10,000×g 离心 10 分钟收集，重悬于裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、溶菌酶 1 mg/mL、1X 蛋白酶抑制剂混合物、300 mM NaCl、25 mM 咪唑、5% 甘油）。细胞通过超声裂解，采用交替脉冲（5 秒开：8 秒关），振幅 24%，4°C 下处理 15 分钟。裂解液在 4°C 下以 13,000 rpm 离心 35 分钟收集无细胞提取物。使用 HisPur™ Ni-NTA 树脂（Thermo-Fischer Scientific，美国）进行亲和层析纯化，咪唑梯度浓度从 0 至 500 mM。酶纯度通过 12% SDS-PAGE 分析。纯化级分合并后，对缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、300 mM NaCl、10% 甘油）透析，于 −20°C 保存备用。
【数据】培养温度：55°C；转速：180 rpm；时间：24h；诱导剂：IPTG 0.3 mM + CuSO4 500 μM；诱导温度：18°C；诱导时间：20h；离心：10,000×g，10 min，8°C；超声：24% 振幅，5s 开/8s 关，15 min，4°C；二次离心：13,000 rpm，35 min，4°C；咪唑梯度：0–500 mM；筛选浓度：卡那霉素 50 μg/ml + 氯霉素 34 μg/ml
2.4 漆酶酶谱分析（Zymogram）
凝胶内活性测定使用 10% 聚丙烯酰胺板凝胶。蛋白样品（不经加热和 β-巯基乙醇处理）与蛋白 marker（5-245 kDa）一同电泳。电泳结束后，凝胶用蒸馏水彻底洗涤三次。将凝胶置于 100 ml 50 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5）中，补充 500 μM CuSO4 和 25 μM 丁香醛连氮，于 37°C、50 rpm 恒温振荡孵育 30 分钟。样品中的酶氧化底物后在凝胶中产生粉红色条带，表明纯化酶具有活性。
【数据】凝胶浓度：10%；蛋白 marker：5-245 kDa；缓冲液：50 mM Tris-HCl pH 7.5；CuSO4：500 μM；丁香醛连氮：25 μM；温度：37°C；时间：30 min；转速：50 rpm
2.5 漆酶活性测定与动力学参数
针对标志性底物 ABTS（ε = 36,000 M⁻¹ cm⁻¹，420 nm）、丁香醛连氮（ε = 65,000 M⁻¹ cm⁻¹，525 nm）和 2,6-DMP（ε = 49,600 M⁻¹ cm⁻¹，470 nm）的漆酶活性测定参照 Baltierra-Trejo 等方法。测定混合物含 50 mM Tris-HCl pH 7.5、500 μM CuSO4 和 0.045 mM 丁香醛连氮或 1 mM ABTS 和 2,6-DMP。在 70°C 预孵育 1 分钟后，加入底物启动反应，通过紫外-可见分光光度计在各自波长下监测氧化引起的每分钟吸光度变化。一个活性单位定义为每分钟催化转化 1 μmol 底物所需的酶量。底物氧化的动力学参数针对丁香醛连氮和 2,6-DMP 测定，底物浓度从 5 μM 变化至 300 μM，酶浓度为 2 μM。反应参数通过 Lineweaver-Burk 图获得。漆酶的最适 pH 和温度谱通过记录相对活性获得：pH 范围 2.5 至 8，缓冲液从 20 mM 柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 2.5–6）更换为 20 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7–8）；温度范围 30°C 至 80°C。漆酶的温度稳定性通过测定酶在 55°C、65°C 和 75°C 三个温度下的残余活性来评估。测定组成与上述漆酶活性测定相同。
【数据】ABTS 摩尔消光系数：36,000 M⁻¹ cm⁻¹（420 nm）；丁香醛连氮：65,000 M⁻¹ cm⁻¹（525 nm）；2,6-DMP：49,600 M⁻¹ cm⁻¹（470 nm）；底物浓度：丁香醛连氮 0.045 mM / ABTS 和 2,6-DMP 1 mM；预孵育：70°C，1 min；动力学底物范围：5–300 μM；酶浓度：2 μM；pH 范围：2.5–8；温度范围：30–80°C；稳定性测定温度：55/65/75°C
2.6 差示扫描量热法
使用差示扫描量热仪（DSC2500）测定漆酶的熔解温度。约 4 mg 酶样品溶于 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）中，密封于带穿刺盖的铝坩埚中（预先称重作为对照样品）。扫描从 20°C 至 200°C，升温速率为 5°C min⁻¹。扣除缓冲液热谱图。根据所得 DSC 曲线记录最大熔解点（Tm，峰温度）。
【数据】样品量：~4 mg；缓冲液：50 mM Tris-HCl pH 7.5；扫描范围：20–200°C；升温速率：5°C/min
2.7 金属离子、有机溶剂、抑制剂和盐浓度对漆酶活性的影响
分析了 Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺ 和 Fe³⁺ 等多种金属离子对漆酶活性的影响。脱辅基酶通过将蛋白对 EDTA（2 mM，溶于 50 mM Tris-HCl pH 7.5）透析制备。脱辅基酶与 1 mM 各种金属离子孵育 1 小时，测定残余活性。同样地，分析了不同有机溶剂（乙醇、甲醇、丙酮、乙腈和二甲基亚砜 DMSO）在 5%、10% 和 20% 浓度下对漆酶活性的影响。使用 1 mM 的 SDS、DTT、半胱氨酸、β-巯基乙醇和叠氮化钠分析不同抑制剂对漆酶活性的影响。还测试了盐（50 mM–5 M NaCl）对漆酶活性的影响。使用前述方法以丁香醛连氮为底物测定酶的残余活性。
【数据】金属离子浓度：1 mM；孵育时间：1h；有机溶剂浓度：5%/10%/20%；抑制剂浓度：1 mM；NaCl 范围：50 mM–5 M；EDTA 浓度：2 mM
2.8 漆酶中金属含量：ICP-OES
使用 ICP-OES（Agilent Technologies）测定漆酶中的铜含量。蛋白样品（13 μM）加入 3.0–3.5 mL 超纯硝酸（~65–70%）中，室温消化过夜。金属分析时，消化样品用 0.5% 硝酸稀释。铜离子浓度根据标准校准曲线测定。
【数据】蛋白浓度：13 μM；硝酸：~65–70%，3.0–3.5 mL；消化：室温过夜；稀释液：0.5% 硝酸
2.9 定点突变
M503F、M503L 和 D438A 突变（原文节选至此，具体操作细节原文未完整呈现）。
【数据】突变位点：M503F、M503L、D438A
研究结果
3.1 *G. stearothermophilus* 推定漆酶的异源表达与纯化
工业界对热稳定漆酶的需求日益增长，从嗜热细菌中开发漆酶用于工业过程受到广泛关注——嗜热来源的漆酶对各种苛刻条件具有更高的稳定性。本研究选择了革兰氏阳性超嗜热菌 Geobacillus stearothermophilus，预期其漆酶具有热稳定性，区别于其他中温来源的漆酶。G. stearothermophilus 基因组分析鉴定到一个注释为多铜氧化酶家族蛋白的基因（ID: WP_033015742.1），其开放阅读框为 1586 碱基对。图 1 中的多序列比对显示，该多铜氧化酶具有四个铜结合区域，其催化位点的保守氨基酸残基与其他蓝色漆酶相似。因此，将其鉴定为 G. stearothermophilus 中的推定漆酶。全面的 BLASTp 搜索显示，与多铜氧化酶同源的酶在多种 Geobacillus 菌株中高度丰富（表 S2），但文献中记录的研究有限。鉴于嗜热来源漆酶的重要性，表征和探索这些推定漆酶的潜力具有重要的科学意义。
在将上述编码多铜氧化酶的基因（WP_033015742.1）鉴定为推定漆酶（GbsLac）后，本研究将该基因克隆至 pET28a(+) 载体。重组载体保存于 E. coli DH5α 中，并转化至 BL21 Codon Plus (RIL) 感受态细胞进行蛋白表达。在优化的蛋白表达条件下，添加铜离子使蛋白正确折叠，实现可溶性表达。重组 GbsLac 通过 Ni-NTA 亲和层析纯化。结合蛋白在 150 mM 咪唑下洗脱，经 12% SDS-PAGE 可视化。纯化 GbsLac 的洗脱图谱显示一条约 63 kDa 的条带（图 2）。酶谱分析中单一底物氧化条带表明 GbsLac 为单体形式。
【数据】ORF 长度：1586 bp；洗脱咪唑浓度：150 mM；SDS-PAGE 条带：~63 kDa；铜结合区域：4 个
3.2 *G. stearothermophilus* 热稳定漆酶的酶动力学与特征
纯化 GbsLac 后，我们表征了其对漆酶标志性底物 ABTS、2,6-DMP 和丁香醛连氮的特异性。在添加 500 μM CuSO4 的优化条件下，GbsLac 氧化丁香醛连氮的比活性为 3.3 U/mg。酶的米氏常数（KM）和催化效率（kcat/KM）分别为 7.48 ± 2.2 μM 和 20.28 μM⁻¹ min⁻¹。然而，GbsLac 对 2,6-DMP 的催化效率降低约 40%，且对 ABTS（漆酶的合成非酚类模型底物）无活性。从 AlphaFold 蛋白结构数据库推导的 GbsLac 模型结构（图 S2）显示，在 T1 铜位点的底物腔附近存在一个从 Met210 延伸至 Met240 的大柔性环，这种结构存在于细菌铜氧化酶中，对细菌铜抗性至关重要。该环还参与铜稳态期间亚铜离子的螯合。甲硫氨酸中的硫醚硫原子使其成为 Cu⁺ 结合结构域。该环作为 Cu⁺ 转运体，在铜缺乏时经常参与向酶的 T2/T3 三核铜簇供应铜离子。CueO 的酚氧化酶活性通常较低，因为富含 Met 的插入环作为酚类底物物理屏障。在 E. coli 的铜外排氧化酶（CueO）中也观察到类似情况，删除 Pro357-His406 的环区后，酶对 ABTS 的活性显著提高。T1 铜原子附近的这种柔性环可能决定了狭窄的底物通道，对较大底物（如 ABTS）产生显著的空间位阻，而较小底物（如丁香醛连氮和 2,6-DMP）则受影响较小。对非酚类底物 ABTS 无活性的另一个可能解释是：参与铜转运的柔性环调节了 T1 铜附近的电子环境，从而降低了 T1 铜的氧化还原电位，阻碍了对高氧化还原电位底物的氧化。
鉴于 Geobacillus 属在高温下生长，我们进一步考察了温度对酶活性的影响。研究发现，GbsLac 在 65°C 至 75°C 的高温下具有活性，最适温度为 70°C（图 3a）。与真菌漆酶在 pH 6 以上失活不同，GbsLac 在 pH 6.5–7.5 范围内表现出酶活性，最适 pH 为 7（图 3b）。通过 DSC 评估 GbsLac 的热稳定性（图 3c），观察到高熔解温度（Tm）为 91.84°C。此外，酶热稳定性研究表明，在 55°C、65°C 和 75°C 孵育 1 小时后，酶仍保留超过 70% 的残余活性（图 3d）。
文献中仅有少数报道记录了 Geobacillus 属漆酶的嗜热特性。来自 G. thermopakistaniensis 的 Gt-Cuo 和来自 G. yumthangensis 的 pLac Gy 的最适活性温度均为 60°C，而 Geobacillus sp. ID17 漆酶对丁香醛连氮的最适温度为 55°C、最适 pH 为 6.5。因此，GbsLac 可被认为是一种兼具嗜热性和热稳定性的酶，这是生物催化剂所需的关键特性。
【数据】比活性：3.3 U/mg（丁香醛连氮）；KM：7.48 ± 2.2 μM；kcat/KM：20.28 μM⁻¹ min⁻¹；2,6-DMP 催化效率：降低 ~40%；最适温度：70°C；最适 pH：7；Tm：91.84°C；残余活性：>70%（55/65/75°C，1h）
3.3 金属离子对 GbsLac 活性的影响
以下实验观察了漆酶对各种金属离子的敏感性。用不同金属离子重构脱辅基酶后，GbsLac 在铜存在下记录到最高活性（图 4b）。铜离子基本占据全部铜结合位点，提供高活性。有趣的是，用 Co²⁺ 重构后也恢复了 90% 的活性。然而，其他金属离子未能较大程度地支持漆酶活性，Fe³⁺ 除外——Fe³⁺ 导致漆酶活性完全失活（图 4b）。据报道，钴在漆酶中执行氧还原的机制与铜离子类似。事实上，许多氧化还原酶以 Co²⁺ 作为辅因子。这为 Co²⁺ 存在下的漆酶活性提供了有力论据。在 Bacillus tequilensis SN4、Ganoderma lucidum 的漆酶以及 Kurthia huakuii LAM0618 的多酚氧化酶中，均观察到添加 Co²⁺ 后活性加速。在 BSAO 中，Cu²⁺ 和 Co²⁺ 据报道发挥相似的构象作用，用 Co²⁺ 替换 Cu²⁺ 对整体蛋白结构产生的扭曲较小，能很好地适配金属结合位点。在 Anoxybacillus 的细菌漆酶和 rLacNS2324 中也观察到添加 Zn²⁺ 后漆酶活性被抑制高达 60%。Zn²⁺ 已知会诱导蛋白构象的微妙变化，可能破坏分子内电子传递途径，从而部分影响酶活性。类似地，Ni²⁺ 可能通过影响酶结构来干扰电子传递途径。Fe³⁺ 导致的完全失活可能是由于该金属离子干扰了漆酶的电子传递机制。通过与 T1 铜位点相互作用，Fe³⁺ 中断了来自底物的单电子传递并阻碍其氧化。
【数据】Co²⁺ 重构活性恢复：90%；Zn²⁺ 抑制：~60%；Fe³⁺：完全失活；金属离子浓度：1 mM
3.4 抑制剂、有机溶剂的影响
（原文节选至此，该小节后续内容未完整呈现）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究在嗜热细菌 Geobacillus stearothermophilus MTCC 1518T 中鉴定了一种属于多铜氧化酶家族蛋白的推定漆酶。GbsLac 表征结果显示该酶具有高度热稳定性，并对酚类底物的氧化具有特异性。GbsLac 的一级和二级配位突变中，M503F 因铜含量低导致活性完全丧失。M503L 和 D438A 则降低了催化效率，但 D438A 对丁香醛连氮的氧化除外。尽管突变体的催化转换率较低，但 ORR 的催化活性显示起始电位分别提升了 120 ± 25 mV（M503L）和 40 ± 10 mV（D438A）。这明确表明氧化还原电位（ET1°）的增强。因此，T1 铜位点微环境中静电偶极的消除降低了重组能，从而引导了氧化还原电位的增强。本研究聚焦于单点突变，但考察双突变组合效应将更具价值。T1 位点突变显著改善了 ORR 的起始电位，归因于 ET1° 的增加。这增强了 GbsLac 用于生物阴极制造的潜力。
编译者解读
该研究巧妙地在"稳定性"与"高电位"之间寻找平衡点——细菌漆酶天然稳定但电位不足，作者通过理性设计靶向 T1 铜配位球，以最小幅度的突变（单点替换）实现了电位提升，策略精准且高效。值得注意的是，M503L 在降低催化效率的同时提升了 ORR 起始电位，提示催化效率与电子传递速率并非简单正相关，这对生物电催化器件设计具有直接参考价值。但研究仅验证了单突变效应，双突变协同作用及突变体在实际电极体系中的长期运行稳定性仍有待探索。从合成生物学应用角度看，该酶若能与碳纳米材料或导电聚合物复合，其热电稳定性与改良电位的组合优势有望在生物燃料电池中充分释放。
参考来源
Dey B. Directed evolution of a thermostable laccase from Geobacillus stearothermophilus for efficient reduction of oxygen. Biochimie, 2026. DOI: 10.1016/j.biochi.2026.04.005
DOI: 10.1016/j.biochi.2026.04.005