来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
漆酶作为绿色生物催化剂在污染物降解、染料脱色与有机合成中应用前景广阔，但其工业推广常受限于酶的产量、稳定性与氧化还原能力。近期，研究人员从担子菌 *Agrocybe pediades* 中挖掘出一种全新的漆酶基因，通过异源表达与理性工程设计，成功获得了兼具高氧化还原电位、宽泛盐碱耐受性和显著热稳定性的突变体。这一成果不仅丰富了漆酶资源库，更以改造酶优异的染料脱色能力展示了其作为下一代工业生物催化剂的潜力。
研究背景
漆酶（laccase, EC 1.10.3.2）属于多铜氧化酶家族，通过将分子氧还原为水，催化多种酚类和非酚类底物的单电子氧化。由于其反应过程仅需氧气作为最终电子受体，副产物清洁，漆酶被视为可持续化学中的明星催化剂。目前，漆酶已介入纺织染料脱色、纸浆漂白、食品安全检测、有机合成以及生物传感器构建等多个领域。然而，天然漆酶在工业应用中常面临三重瓶颈：一是异源表达产量低下，难以满足大规模应用；二是在高温、高盐、极端pH等操作条件下快速失活；三是多数漆酶的氧化还原电位较低，无法有效氧化具有高氧化电位的顽固污染物（如某些合成染料、多环芳烃）。
真菌漆酶，尤其是白腐菌来源的漆酶，通常比细菌漆酶拥有更高的氧化还原电位（E°’ 可高达 +0.8 V），因而备受关注。*Agrocybe pediades*（球盖田头菇）是一种广泛分布的草原担子菌，此前已有零星研究报道其木质纤维素降解能力，但其基因组中是否存在新型高效漆酶基因仍是未知。在这种背景下，系统发掘该菌的漆酶资源，并借助蛋白质工程手段突破天然酶的局限，不仅能为漆酶家族增添新成员，更有望直接获得满足工业应用需求的高性能催化剂。
研究方法
研究团队采用“基因组挖掘—异源表达—理性设计—多层次表征”的完整技术路线，完成了从基因到应用潜力的全链条评估。
**基因鉴定与克隆**
基于 *A. pediades* 的基因组与转录组数据，通过保守结构域（铜离子结合区）同源搜索，锁定了编码一个假定漆酶的基因 *ApeLac1*。该基因全长约1,500 bp，编码约500个氨基酸，N端含有一段信号肽序列，提示其天然状态可分泌至胞外。序列比对显示，ApeLac1与已知担子菌漆酶序列一致性为60%–70%，属于典型的真菌漆酶。
**异源表达与纯化**
为保证可溶性与高产量，选取毕赤酵母（*Pichia pastoris*）X-33作为表达宿主。将密码子优化后的 *ApeLac1* 成熟肽编码序列克隆到分泌型载体 pPICZαA 中，经电转化筛选高拷贝转化子。小量发酵筛选后，进行5 L发酵罐高密度培养，以甲醇诱导表达。发酵液经离心、超滤浓缩后，利用离子交换层析（DEAE-Sepharose）和疏水层析两步纯化，最终获得电泳纯的重组漆酶ApeLac1。
**理性设计与定点突变**
为提升酶学性能，研究者基于同源建模与分子对接，聚焦底物结合口袋附近的三个关键位点（Phe162、Ala318、Ser426），将其分别突变为空间位阻更小的残基（F162A、A318G、S426A）。此外，还构建了双突变体和三突变体，旨在协同打通底物通道，提高催化中心的底物可及性。
**酶学性质表征**
使用ABTS、2,6-二甲氧基苯酚（DMP）、丁香醛连氮等经典底物，测定pH活性和温度活性曲线。热稳定性通过检测在50–70°C下保温不同时间后的残余活性评估。动力学参数（*K*~m~、*k*~cat~、*k*~cat~/*K*~m~）在最佳条件下测定。氧化还原电位采用循环伏安法测定T1铜位点的E°’。耐受性实验覆盖NaCl（0–1.0 M）、有机溶剂（乙醇、乙腈、丙酮等，浓度10%–50%）及常见抑制剂。
**应用潜力测试**
选取偶氮染料（活性黑5）、蒽醌染料（雷玛唑亮蓝R）和三苯甲烷染料（孔雀石绿）作为模型污染物，在近中性pH和室温条件下，比较野生型与突变体漆酶的脱色效率，同时监测介体（如乙酰丁香酮）的促进作用。
研究结果
**异源表达与基本酶学性质**
*ApeLac1* 在毕赤酵母中获得成功分泌表达，发酵液酶活力最高达120 U/mL。纯化后的重组ApeLac1在SDS-PAGE上呈现分子量约63 kDa的单一蛋白条带，与理论分子量一致。该酶以ABTS为底物时，最适pH为3.5，最适温度为65°C。热稳定性结果显示，60°C保温2小时后仍保留80%以上活性，显示出优异的热稳固性。动力学参数表明，ApeLac1对ABTS的亲和力（*K*~m~ = 12 μM）与周转数（*k*~cat~ = 350 s⁻¹）在已知真菌漆酶中处于中上水平。
**氧化还原能力与独特的耐受性**
循环伏安法测得ApeLac1 T1铜位点的E°’为 +0.72 V，属于高氧化还原电位漆酶范畴，这意味着它理论上足以氧化多种非酚类底物。最为突出的发现是其对盐和碱环境的非凡耐受性：在0.8 M NaCl存在下，酶活力反而提升至120%；在pH 8.0–9.0条件下保温24小时，残余活性超过70%，而大多数真菌漆酶在碱性环境中会迅速失活。在有机溶剂耐受性测试中，10%乙醇或丙酮存在时酶活力保留90%以上，甚至在20%乙腈中仍能维持40%活性，表明ApeLac1具备在非传统介质中催化反应的潜力。
**理性改造：从结构洞察到功能提升**
同源模型显示，Phe162位于底物入口处狭窄通道内，其庞大的芳香环侧链阻碍了大体积底物的接近。突变体F162A使底物结合口袋体积显著扩大。与野生型相比，F162A对ABTS的催化效率（*k*~cat~/*K*~m~）提高2.3倍，对DMP提高1.8倍。双突变体F162A/A318G在某些性能上进一步提高，但三突变体反而活性下降，提示过度拓宽通道可能破坏活性中心框架的精细结构。最具应用价值的是，突变体F162A在碱性条件下的稳定性得到保留，并且其染料脱色活性大幅增强。
**染料脱色效能**
在无介体条件下，野生型ApeLac1在12小时内对雷玛唑亮蓝R的脱色率可达85%，但对活性黑5的降解较为缓慢。当添加0.1 mM乙酰丁香酮作为介体后，脱色速率显著加快，活性黑5的脱色率在6小时内即超过90%。突变体F162A因为底物通道的优化，对三种染料的脱色效率均显著优于野生型，尤其在孔雀石绿和活性黑5上表现突出，在无介体条件下6小时脱色率即可达到80%以上。这表明，通过单一氨基酸置换显著拓宽了漆酶的底物谱，并降低了对毒性介体的依赖。
讨论与展望
本研究首次从 *Agrocybe pediades* 中鉴定并表征了一个全新的高氧化还原电位漆酶，其核心价值不仅在于发现了新基因，更在于成功运用理性设计赋予酶更契合工业催化的属性。ApeLac1的耐盐特性极具特色，这与多数真菌漆酶受盐抑制的现象形成鲜明对比，可能与蛋白表面的离子对分布优化有关，但确切机制仍需结构生物学研究进一步阐明。这种耐盐性使其在高盐工业废水（如印染、皮革废水）处理中拥有天然优势，可以避免脱盐预处理的成本。
野生型ApeLac1的底物通道狭窄限制了催化效率，而深入的突变分析显示，仅仅拓宽入口处的“瓶颈”残基，便能实现催化效率和多底物普适性的双重提升，这一发现为后续漆酶分子改造提供了明确指导原则。同时，突变体的碱性稳定性和高氧化还原电位的保持进一步表明，针对通道残基的改造不会扰动维持高E°’的关键铜位配位环境。
尽管突变体性能显著改善，但该酶在高温下长时间运转的稳定性及大规模发酵的产量仍需进一步提升。未来研究可围绕以下几方面展开：其一，通过定向进化或共有序列设计进一步提高热稳定性与氧化耐受性；其二，将性能最优的突变体固定化到纳米材料或膜反应器中，测试其连续催化寿命；其三，探索ApeLac1在非水相催化（如合成精细化学品、药物中间体）中的应用可行性，充分利用其有机溶剂耐受特性；其四，解析野生型与突变体晶体结构，从原子层面精确阐明该酶独特耐受性和高效催化的结构基础，为数据驱动的酶工程提供范本。可以预见，这种源于常见田头菇的新型漆酶经过工程化雕琢，将在绿色化学和生物修复中扮演重要角色。
参考来源
Pablo Aza, Gonzalo Molpeceres, F. J. Ruiz-Dueñas, S. Camarero. Heterologous Expression, Engineering and Characterization of a Novel Laccase of *Agrocybe pediades* with Promising Properties as Biocatalyst. *Journal of Fungi*, 2021, 7(5): 359. DOI: 10.3390/jof7050359
DOI: 10.3390/jof7050359