来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
漆酶作为一种含铜的多酚氧化酶，在工业废水处理、染料脱色、食品加工和生物传感器等领域具有广泛应用价值。然而，天然真菌漆酶产量低、发酵周期长，严重制约其产业化进程。韩国研究团队成功将寄生隐丛赤壳菌（*Cryphonectria parasitica*）漆酶1基因（*lac1*）克隆并在酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）中实现高效异源分泌表达，重组酶兼具高酶活力和良好的稳定性。这一成果表明酿酒酵母有望成为真菌漆酶大规模生产的理想底盘，为漆酶的工业化应用提供了新的思路。相关研究发表于2024年《Mycobiology》。
研究背景
漆酶（EC 1.10.3.2）属于蓝色多铜氧化酶家族，能够催化氧化多种酚类和非酚类化合物，同时将分子氧还原为水，无需昂贵的辅因子，因而被视为“绿色催化剂”。真菌漆酶因其氧化还原电位高、底物谱宽而备受工业界青睐，但天然菌株普遍存在产酶水平低、异源表达困难等问题。寄生隐丛赤壳菌是引起栗疫病的子囊菌，其基因组编码多种漆酶，其中漆酶1（Lac1）被证明参与色素沉着、致病力和木质素降解等关键生理过程，具有突出的催化特性。然而，该酶在天然宿主中表达量极低，且分离纯化步骤繁琐，难以满足应用需求。
酿酒酵母是公认安全的模式真核微生物，具备翻译后修饰和分泌能力，是异源表达真菌酶的理想宿主。但其糖基化模式与丝状真菌存在差异，且外源蛋白的高效分泌常受信号肽选择、折叠效率等多重因素限制。因此，构建能高产并分泌有活性*C. parasitica* Lac1的酿酒酵母工程菌株，不仅有助于理解该酶的结构与功能，也为漆酶低成本规模化生产奠定基础。
研究方法
研究团队首先从寄生隐丛赤壳菌标准菌株EP155中提取总RNA，经逆转录PCR扩增获得*lac1*基因编码序列。该基因全长约1.8 kb，编码约600个氨基酸，包含其自身信号肽。为评估不同分泌信号对表达的影响，研究者分别构建两种表达载体：一种保留天然信号肽，另一种将其替换为酿酒酵母α交配因子（MFα）信号肽。目标基因被克隆至酵母游离型表达载体pYES2，置于GAL1启动子严格控制之下，并以半乳糖诱导表达。
重组载体经电穿孔法转化酿酒酵母BY4741菌株，通过尿嘧啶营养缺陷筛选获得阳性转化子。挑取单克隆在含2%棉子糖的合成培养基中过夜培养，随后转接至含2%半乳糖的诱导培养基，在30℃下培养48小时以诱导Lac1分泌表达。培养上清经离心收集后，利用超滤管浓缩，采用以2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）为底物的分光光度法测定漆酶活性。同时，通过SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表达水平和分子量。
为进一步纯化重组酶，将浓缩上清经过阴离子交换层析和分子筛层析两步纯化，获得电泳纯的Lac1蛋白。纯化后的酶进行了详细的生化表征，包括最适温度与pH、温度稳定性、金属离子和抑制剂的影响，以及底物动力学参数测定。此外，还利用纯化酶对多种合成染料进行脱色实验，评估其应用潜力。
研究结果
实验结果显示，无论是携带天然信号肽还是MFα信号肽的重组菌株，均能在诱导后向培养基中分泌具有漆酶活性的蛋白。其中，MFα信号肽融合株的胞外漆酶活性显著高于天然信号肽株，最高总酶活达到约35 U/L，表明酵母自身的分泌信号能更有效地引导异源漆酶高效分泌。SDS-PAGE和Western blot证实，分泌的重组Lac1分子量约为66 kDa，与理论分子量相符，且未见明显降解，提示蛋白稳定性良好。
纯化后的重组Lac1展现出典型的真菌漆酶特性。其催化ABTS的最适pH为3.0，最适温度为50℃。该酶在酸性条件下（pH 3.0–5.0）保持较高活性，并在40℃以下孵育1小时后活性几乎无损失，表现出较好的热稳定性。常见金属离子如Cu²⁺、Mn²⁺对酶活性有促进作用，而Fe²⁺和SDS则强烈抑制活性，这与典型真菌漆酶的特征一致。在底物特异性方面，重组Lac1对ABTS的催化效率最高（*k*cat/*K*m为4.8×10⁵ M⁻¹s⁻¹），对丁香醛连氮和愈创木酚也表现明显活性，而对2,6-二甲氧基苯酚亲和力较低。
染料脱色实验中，重组Lac1在无氧化还原介体的情况下，对偶氮染料酸性红1和蒽醌染料雷马素亮蓝R的脱色率在1小时内分别达到85%和95%以上；对三苯甲烷染料结晶紫也展现一定的脱色能力。当加入1-羟基苯并三唑作为介体时，脱色效率和速率进一步提升，拓展了其可降解染料的种类。这些结果充分证明，酿酒酵母分泌表达的*C. parasitica* Lac1具备工业应用所需的高催化活性和宽底物范围。
讨论与展望
该研究首次实现了寄生隐丛赤壳菌漆酶1在酿酒酵母中的功能性分泌表达，并证实MFα信号肽在引导外源真菌漆酶分泌方面更具优势。重组Lac1在酸性、中温条件下表现出优异的催化活性和稳定性，无需介体即可高效降解多种合成染料，暗示其在纺织印染废水处理等酸性环境中具有直接应用的潜力。
值得注意的是，虽然摇瓶水平产量已达35 U/L，但相比少数已报道的高产曲霉漆酶重组菌株仍有差距。未来可通过优化启动子强度、增加基因拷贝数、共表达分子伴侣或改造分泌途径等方式进一步提高产酶水平。此外，酵母的糖基化修饰对该漆酶的稳定性与催化行为的具体影响仍不明确，后续研究可结合蛋白质组学手段深入解析。*C. parasitica* Lac1的成功异源表达为探索该酶在木质素增值转化、酚类污染物生物修复等更广泛场景的应用提供了坚实的物质基础，也为其他难表达真菌漆酶的工业底盘构建提供了可借鉴的策略。
参考来源
So KK, Hernandez Alvarado FA, Han G, Kim J, Kim TG. Heterologous Expression of Laccase1 from *Cryphonectria parasitica* in *Saccharomyces cerevisiae*. *Mycobiology*, 2024. DOI: 10.1080/12298093.2024.2439646.
DOI: 10.1080/12298093.2024.2439646