来源：A laccase gene, CitLAC4, drives lignin biosynthesis in juice sacs during postharvest granulation of Citrus sinensis（Postharvest Biology and Technology）| 编译：DNA Lab Space
导读
柑橘粒化是采后贮藏中常见的衰老相关生理失调，导致汁胞硬化、品质严重下降，其本质是正常多汁的汁胞发生异常木质化。本研究在甜橙基因组中鉴定出22个漆酶基因，通过多季节、多品种的严格表达谱分析，锁定CitLAC4为粒化过程中唯一持续上调的漆酶成员。研究建立了从异源烟草、草莓到同源柑橘果皮、汁胞的逐步功能验证体系，并在离体柚子汁胞中通过原位瞬时过表达证明CitLAC4足以驱动木质素积累（增加26.9%–29.4%），为“细胞壁代谢紊乱”假说提供了直接分子证据。
研究背景
果实衰老过程中的采后品质劣变是全球水果产业面临的关键经济瓶颈（Chen等，2021b）。异常木质化是衰老的一种普遍且不可逆的表现，严重损害果实质地和食用口感。这一现象在多种水果中均有记录，如梨的石细胞发育、枇杷和樱桃的冷诱导果肉木质化等。柑橘中一种类似的生理失调被称为粒化（也称枯水），常在果实成熟后期或采后贮藏期间发生，表现为汁胞逐渐硬化、口感干燥，同时糖和有机酸快速消耗，使果实失去商业价值。尽管诱发环境因素各异，这些现象具有共同的生物学基础：木质素在通常保持多汁的组织中异位合成和积累。木质素是植物结构完整性所必需的复杂酚类聚合物，其生物合成经由高度保守的苯丙烷代谢途径。然而，负责单木质醇末端聚合的具体漆酶基因尚不清楚。本研究旨在系统鉴定柑橘漆酶基因家族，并锁定驱动粒化过程中木质素合成的关键成员。
研究方法
2.1 果实材料
成熟甜橙（Citrus sinensis cv. Fengqi）于2021年12月采自中国重庆某果园。贮藏前，果实经2%（v/v）次氯酸钠（NaClO）表面消毒，并用抑霉唑（杀菌剂）处理。随后，果实逐个套袋，在通风设施中于冬季至春季环境条件下（5–12°C，60–70%相对湿度）贮藏5个月。贮藏结束后，选取60–100个大小均匀、可溶性固形物（TSS）含量>9.5%的果实。小心剥离汁胞，将其分为“正常”和“粒化”两类，立即在液氮中冷冻，并于−80°C保存以备后续RNA-Seq分析。
【数据】品种：甜橙cv. Fengqi；消毒剂：2%（v/v）次氯酸钠；贮藏温度：5–12°C；相对湿度：60–70%；贮藏时间：5个月；果实数量：60–100个；TSS阈值：>9.5%；保存温度：−80°C
2.2 柑橘LAC基因的鉴定与生物信息学分析
从TAIR数据库（www.arabidopsis.org）获取拟南芥LAC家族蛋白序列，作为查询序列，通过本地BLASTP搜索柑橘（C. sinensis v3.0）蛋白数据库（citrus.hzau.edu.cn），E值阈值为1×10⁻⁴。所得候选序列使用Pfam数据库（http://pfam.xfam.org/）验证，确认存在保守的多铜氧化酶结构域（PF00394、PF07731和PF07732）。推测的柑橘序列随后反向BLAST比对拟南芥蛋白质组，保留那些最佳拟南芥比对结果为AtLAC的序列。当一个基因座存在多个异构体时，使用最长的蛋白异构体进行后续分析。使用TBtools软件可视化所鉴定CitLAC的染色体位置、基因结构和蛋白结构域架构。理论等电点（pI）和分子量（MW）使用ExPASy Compute pI/Mw工具（https://web.expasy.org/compute_pi/）计算。
系统发育分析：使用CitLAC、全部AtLAC及其他物种中已鉴定的木质化相关LAC的全长氨基酸序列构建系统发育树，包括白梨（PbrLAC5、PbLAC1）、枇杷（EjLAC12）和荔枝（LcLAC7）（表S1）。比对使用ClustalW完成，建树在MEGA 11中采用邻接法（NJ）、Jones-Taylor-Thornton（JTT）模型、配对删除处理空位、1000次自举重复。序列比对使用ESPript 3.0可视化以突出保守残基。
【数据】BLASTP E值阈值：1×10⁻⁴；保守结构域：PF00394、PF07731、PF07732；系统发育方法：NJ/JTT模型；自举重复：1000次
2.3 基因表达分析
#### 2.3.1 RNA提取
为确保不同组织类型获得高质量RNA产量，本研究采用定制化提取方案。对于标准营养组织和果皮组织（本氏烟草、拟南芥和柑橘黄皮层），使用Steady Pure植物RNA提取试剂盒（Accurate Biotechnology，中国）常规提取总RNA。对于富含多糖的组织（柚子汁胞和草莓果实），采用改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法（Chang等，1993）。简要步骤如下：约0.15 g冷冻组织粉末在700 μL预热（65°C）的CTAB提取缓冲液中匀浆，缓冲液补充2%（v/v）β-巯基乙醇。经两轮氯仿:异戊醇（24:1，v/v）纯化后，使用10 M LiCl在4°C选择性沉淀RNA。所得沉淀重新溶解于RNA提取缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0、1.0 M NaCl、0.5% SDS）中，再次抽提，最后用异丙醇和3 M乙酸钠沉淀。洗涤并风干的RNA沉淀重悬于30–40 μL无RNase水中。
用于RNA-seq的脐橙汁胞RNA按照制造商说明使用TRIzol试剂（Accurate Biology，中国）提取，以满足文库构建要求。RNA完整性通过0.8%琼脂糖凝胶电泳评估，浓度和纯度（A260/A280和A260/A230比值）使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）定量。所有RNA样品于−80°C保存至进一步分析。
【数据】CTAB法组织量：约0.15 g；CTAB缓冲液体积：700 μL；β-巯基乙醇浓度：2%（v/v）；氯仿:异戊醇比例：24:1（v/v）；LiCl浓度：10 M；沉淀温度：4°C；重悬体积：30–40 μL；电泳凝胶浓度：0.8%
#### 2.3.2 RNA-Seq基因表达分析
为全面了解CitLAC表达情况，本研究使用了四个独立的转录组数据集。2021年收获季节甜橙（cv.‘Fengqi’）汁胞的RNA-Seq数据为上述新生成数据。为确保跨季节和跨品种一致性，甜橙（2015年季节）和‘Harumi’杂柑粒化汁胞的原始数据分别取自本实验室前期发表成果（Yao等，2020；Yan等，2024）并重新分析。此外，甜橙汁胞发育和成熟过程中CitLAC的表达谱通过重新分析先前研究（Feng等，2021）的公开转录组数据获得。
对于甜橙汁胞，使用NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒（Illumina，New England BioLabs，美国）按照制造商说明从正常和粒化样品制备cDNA文库。文库由Novogene生物信息技术有限公司（中国北京）在Illumina HiSeq平台上进行双端测序。干净读段比对到相应参考基因组：甜橙样品比对到C. sinensis v3.0。基因表达水平以每千碱基转录本每百万映射片段数（FPKM）量化用于可视化。差异表达分析基于原始读段计数，使用DESeq2软件包（v1.20.0）进行。调整后P值<0.05（Benjamini–Hochberg校正）的基因被鉴定为差异表达。除非另有说明，每个条件使用三个生物学重复，至少一个条件下FPKM>1的基因视为表达。
【数据】测序平台：Illumina HiSeq；参考基因组：C. sinensis v3.0；差异表达阈值：调整后P<0.05；表达阈值：FPKM>1；生物学重复：3个
#### 2.3.3 RT-qPCR和半定量RT-PCR基因表达分析
参照先前方法（Li等，2023；Zhang等，2019），对于柑橘组织（脐橙果皮、柚子果皮）和拟南芥组织的定量分析，使用Steady Pure植物RNA提取试剂盒（Accurate Biology，中国）提取总RNA。使用EasyScript®第一链cDNA合成SuperMix（TransGen Biotech，中国）从500 ng总RNA合成第一链cDNA。RT-qPCR使用PerfectStart® Uni RT&qPCR试剂盒（TransGen Biotech，中国）在CFX384 Touch™实时PCR检测系统（Bio-Rad，美国）上进行。所有引物序列列于表S2。CsActin作为内参；相对表达量（如CitLAC4）采用2⁻ΔΔCt方法计算。除非另有说明，数据以平均值±SD报告，≥3个生物学重复。
半定量RT-PCR（烟草、草莓）：由于CitLAC4并非野生型烟草叶片或草莓果实的内源基因，采用半定量RT-PCR验证转基因表达。PCR扩增使用T100™热循环仪（Bio-Rad，美国）进行。循环数经优化以确保在指数期终止。PCR产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳分离并可视化。NbActin和FaActin分别作为烟草和草莓的内参对照。
【数据】cDNA合成模板量：500 ng总RNA；内参基因：CsActin（柑橘）、NbActin（烟草）、FaActin（草莓）；定量方法：2⁻ΔΔCt；电泳凝胶浓度：0.8%
2.4 CitLAC4农杆菌介导的瞬时过表达实验
载体构建和农杆菌制备参照先前方法（Zhu等，2017）。将CitLAC4全长CDS克隆到pCAMBIA2300载体中，由CaMV 35S启动子驱动表达。所得35S::CitLAC4构建体和空载体（EV，pCAMBIA2300）分别转化到农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株中。对于所有瞬时实验，农杆菌培养物在补充50 μg mL⁻¹卡那霉素和20 μg mL⁻¹利福平的LB培养基中生长至饱和（OD600≈1.0–1.2）。细胞通过离心（4000 × g，10 min）收集，并重悬于特定的渗透培养基中。
【数据】载体：pCAMBIA2300；启动子：CaMV 35S；农杆菌菌株：GV3101；卡那霉素浓度：50 μg mL⁻¹；利福平浓度：20 μg mL⁻¹；OD600：1.0–1.2；离心条件：4000 × g，10 min
研究结果
3.1 甜橙LAC基因家族的全基因组鉴定与特征分析
为系统研究漆酶在柑橘粒化相关木质化中的潜在作用，我们首先对甜橙LAC基因家族进行了全基因组调查。以拟南芥LAC蛋白为BLASTP查询序列，共鉴定到22个CitLAC基因（表S3）。这些基因分布在9条染色体中的8条上，根据其染色体位置系统命名为CitLAC1–22（图S2）。基因结构分析表明，大多数CitLAC成员具有相似的外显子-内含子组织（图S3）。蛋白结构域分析确认，所有鉴定的CitLAC（包括CitLAC4）均含有特征性的多铜氧化酶（Cu-oxidase）结构域（图S4），支持其作为LAC家族成员的注释。这些数据为后续功能分析奠定了基础。
【数据】CitLAC基因总数：22个；染色体分布：9条中的8条；命名范围：CitLAC1–22
3.2 CitLAC与木质化相关漆酶的进化分组
为锁定可能参与木质化的CitLAC基因，我们构建了包含全部22个CitLAC和来自不同物种的已功能鉴定的木质化相关LAC的系统发育树（图1）。这些参考LAC包括来自拟南芥的AtLAC4、AtLAC11、AtLAC15和AtLAC17，以及来自梨的PbLAC1和PbrLAC5、来自枇杷的EjLAC12等已知调控木质素生物合成的漆酶（表S1）。系统发育分析显示，8个CitLAC（CitLAC4、CitLAC8、CitLAC9、CitLAC11、CitLAC15、CitLAC16、CitLAC17和CitLAC18）与这些已知木质化相关LAC紧密聚集（图1）。基于这一进化保守性，这8个基因被选为主要候选基因，用于后续柑橘粒化过程中的表达谱分析。
【数据】候选基因数：8个；参考物种数：4个以上（拟南芥、梨、枇杷、荔枝等）
3.3 CitLAC4在粒化过程中跨季节、跨品种唯一诱导表达
为鉴定与粒化特异性相关的CitLAC基因，我们分析了不同生理阶段和品种中的表达谱。首先，对脐橙果实发育和成熟过程中的全基因组表达数据（Feng等，2021）分析显示，大多数CitLAC表达水平极低。以FPKM>1为表达阈值，仅CitLAC4、CitLAC8和CitLAC15表现出可检测的表达，并在果实成熟时呈上升趋势（图2A）。接下来，我们在两个独立生长季节中调查了‘Fengqi’脐橙采后粒化过程中CitLAC的表达。值得注意的是，虽然大多数家族成员保持转录沉默，但CitLAC4在两个季节的粒化汁胞中相对于正常汁胞均持续上调（图2B、C）。为进一步验证这一相关性，我们检测了‘Harumi’杂柑（一种易感粒化的杂交柑橘品种）中CitLAC的表达。结果一致，CitLAC4在‘Harumi’粒化汁胞中也被诱导表达（图2D）。综上，比较全局基因表达分析确定CitLAC4是唯一在多个季节中表现出与粒化紧密相关的持续上调模式的家族成员。因此，我们选择CitLAC4进行功能验证。
【数据】表达阈值：FPKM>1；上调基因：CitLAC4（唯一）；检测品种：'Fengqi'脐橙（两季）、'Harumi'杂柑；可检测表达基因数：3个（CitLAC4、CitLAC8、CitLAC15）
3.4 CitLAC4增强本氏烟草叶片中的木质素生物合成
为研究CitLAC4的催化功能，我们首先分析了其蛋白序列。CitLAC4含有三个特征性铜氧化酶结构域（图3A），并与其他物种已知木质化相关LAC共享高度保守的铜结合基序（植物漆酶共有基序）（图S5），表明其具有保守的酶学功能。随后，我们使用35S::CitLAC4构建体（图3B）在本氏烟草叶片中进行瞬时过表达实验。渗透后48小时，半定量RT-PCR证实CitLAC4在渗透叶片中相对于空载体（EV）对照有强表达（图3C）。一致地，CitLAC4过表达叶片中的总LAC活性显著升高（图3D）。后续分析显示，CitLAC4过表达叶片相对于对照的总木质素含量显著增加29.6%（图3E）。这些结果表明CitLAC4编码一种功能性漆酶，能够在异源系统中增强木质素生物合成。
【数据】渗透后时间：48h；木质素含量增加：29.6%；异源系统：本氏烟草叶片
3.5 CitLAC4在甜橙同源果皮中的功能验证
在烟草中验证其活性后，我们接下来在柑橘同源系统中确认CitLAC4的功能。通过农杆菌渗透在甜橙果皮中瞬时过表达CitLAC4。虽然在渗透后4天（dpi）未观察到可见的表型变化（图4A），但RT-qPCR确认CitLAC4转录水平相对于空载体（EV）对照显著增加了17.66倍（图4B）。这种转录上调转化为总LAC酶活性的显著增加（比EV高1.39倍；图4C）。重要的是，这种升高的LAC活性足以导致CitLAC4过表达组织中木质素含量增加19.7%（图4D）。这些数据支持CitLAC4在柑橘同源果皮中促进木质素积累的作用。
【数据】观察时间点：4 dpi；转录水平增加：17.66倍；LAC活性增加：1.39倍；木质素含量增加：19.7%
3.6 CitLAC4增强柚子果皮中的木质素生物合成和组织硬化
为进一步证实其功能，我们将分析扩展到柚子（Citrus grandis）果皮。虽然在渗透后9天（dpi）未观察到宏观变化（图5A），但RT-qPCR确认三个独立生物学重复中CitLAC4显著上调，相对于EV对照为1.79至7.99倍（图5B）。这种转录诱导导致总LAC酶活性显著增加（增加42.0%–137.0%；图5C）。关键的是，这种生化变化转化为可测量的物理表型：CitLAC4过表达组织中的果皮硬度显著增加8.9%–19.3%（图5D）。一致地，各重复中木质素含量升高了46.8%–70.0%（图5E）。这些发现表明，CitLAC4的过表达足以促进柑橘果皮中的木质素积累和随后的组织硬化。
【数据】观察时间点：9 dpi；转录水平增加范围：1.79–7.99倍；LAC活性增加范围：42.0%–137.0%；果皮硬度增加范围：8.9%–19.3%；木质素含量增加范围：46.8%–70.0%；生物学重复：3个
3.7 CitLAC4原位过表达促进离体柚子汁胞的木质化
为直接评估其在粒化最相关组织中的功能，我们在离体柚子汁胞中瞬时过表达CitLAC4。虽然未观察到宏观形态变化（图6A），但RT-qPCR确认两个独立实验中CitLAC4成功过表达，转录水平分别增加22.2倍和6.1倍（图6B）。这种上调导致总LAC酶活性显著提升（最高增加261%；图6C）。最重要的是，这导致细胞壁物质（CWM）的大量积累，在两个实验中分别增加16.3%和30.5%（图6D）。相应地，木质素含量在两个实验中显著上升29.4%和26.9%（图6E）。CWM和木质素的增加在两个独立批次中均观察到，与LAC活性增加一致。这些结果为CitLAC4足以驱动柑橘汁胞细胞壁木质化提供了直接的原位证据。
【数据】转录水平增加：22.2倍和6.1倍；LAC活性最高增加：261%；CWM增加：16.3%和30.5%；木质素含量增加：29.4%和26.9%；独立实验批次：2个
3.8 CitLAC4促进草莓果实中的木质素积累
为测试在远缘非跃变型果实系统中的功能保守性，我们在草莓（Fragaria × ananassa）花托中瞬时过表达CitLAC4。虽然在4 dpi时未观察到外部表型变化（图7A），但半定量RT-PCR证实外源CitLAC4基因的强表达（图7B）。生化分析显示，CitLAC4注射组织中总LAC活性相对于对照显著增加约6倍（图7C）。一致地，这导致木质素含量显著增加20.8%（图7D）。这些结果表明CitLAC4促进木质化的功能在远缘果实物种中也是保守的。
【数据】观察时间点：4 dpi；LAC活性增加：约6倍；木质素含量增加：20.8%；果实系统：草莓（非跃变型）
3.9 CitLAC4稳定过表达促进拟南芥中的木质素积累
为进一步验证CitLAC4的功能保守性，我们生成了稳定过表达CitLAC4的拟南芥转基因株系。PCR确认了CitLAC4在独立转基因株系基因组DNA中的整合（图8A）。RT-qPCR分析显示，阳性转基因株系（L1、L2、L6、L9）中CitLAC4转录水平相对于空载体（EV）对照显著升高（图8B）。对茎组织的木质素含量分析表明，CitLAC4过表达株系的木质素含量最高增加36.5%。这些结果在稳定遗传系统中进一步证实了CitLAC4促进木质素生物合成的功能。
【数据】转基因株系：L1、L2、L6、L9；茎组织木质素含量最高增加：36.5%；表达系统：拟南芥稳定转基因
讨论与解读
4.1 CitLAC4将粒化与汁胞中木质素末端聚合步骤联系起来
为填补柑橘粒化过程中介导木质化的结构基因的知识空白，本研究对LAC基因家族进行了系统分析。在甜橙基因组中鉴定出22个CitLAC成员。跨品种和生长季节的严格表达谱分析确定CitLAC4是粒化过程中持续上调的主要成员。随后建立了涵盖多种异源（烟草叶片、草莓果实）和同源（柑橘果皮和汁胞）瞬时表达系统以及稳定拟南芥转化系统的综合功能验证体系。这些实验一致确认了CitLAC4催化单木质醇聚合的能力，从而将其鉴定为驱动粒化汁胞异常木质化的关键末端酶编码基因。
4.2 CitLAC4强化了“细胞壁代谢紊乱”假说
柑橘粒化近一个世纪以来一直是采后领域的持续性挑战。历史上，研究主要被“果皮再生长”与“果皮衰老”这两个相互矛盾的生理假说所主导，这些假说对产业有重要贡献，但也未能提供明确有效的粒化控制策略。本研究团队先前提出了“细胞壁代谢紊乱”假说。本研究中CitLAC4的鉴定和功能验证为该假说提供了直接的分子证据——粒化的本质是汁胞细胞壁代谢的异常，而非简单的果皮生理状态问题。
编译者解读
本研究最值得称道之处在于其功能验证的梯度设计——从异源叶片到同源果皮再到离体汁胞，层层递进，最终在粒化发生的原位上证明了单个漆酶基因CitLAC4的充分性。这种“原位验证”策略在果实木质化研究中并不多见，为采后品质调控提供了极具操作性的遗传靶点。从合成生物学应用角度看，CitLAC4的表达受衰老信号调控，未来若能在品种选育或基因编辑中精准调控其时空表达，有望在不影响果实正常发育的前提下抑制粒化发生。不过，研究主要聚焦于转录水平的调控，漆酶活性的翻译后修饰及底物供给的协同调控仍有待深入探索。
参考来源
Yang Q. A laccase gene, CitLAC4, drives lignin biosynthesis in juice sacs during postharvest granulation of Citrus sinensis. Postharvest Biology and Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.postharvbio.2026.114182
DOI: 10.1016/j.postharvbio.2026.114182