来源：Improved expression of Cerrena unicolor Laccase in Aspergillus niger via combined strategies and its applications（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space
导读
漆酶作为绿色环保催化剂在生物技术和工业领域应用前景广阔，但单色革盖菌（Cerrena unicolor）漆酶异构表达产量不足长期制约其商业化。本研究以黑曲霉为宿主，整合密码子优化、分子伴侣共表达及常压室温等离子体（ARTP）诱变三种策略，成功筛选出高产菌株OPT-HacA-M10，在50 L发酵罐中漆酶活性高达416.8 U/mL。重组漆酶rLac2在牛仔布漂白及霉菌毒素降解中展现出优异性能，为工业应用提供了可行方案。
研究背景
漆酶（苯二酚：氧氧化还原酶，EC 1.10.3.2）属于多酚氧化酶家族，能催化氧化多种酚类和非酚类芳香化合物，同时将分子氧还原为水。漆酶底物谱广泛且环境友好——利用空气中的分子氧作为最终电子受体，副产物仅为水，因此被认定为绿色环保催化剂，在食品、环境治理、纺织染料脱色和造纸等行业具有广泛应用。1883年Yoshida首次在日本的漆树中发现漆酶，此后随着生物信息学和分子生物学的发展，漆酶陆续在细菌、真菌和昆虫中被发现。目前研究最深入的是真菌漆酶和细菌漆酶，其中真菌漆酶底物特异性更广，在工业和农业领域应用潜力更大。Zhou等人通过mRNA-Seq方法发现单色革盖菌菌株6884含有六个漆酶基因。然而，该菌来源漆酶的异构表达产量不足，难以满足商业需求，高效表达体系的开发成为研究焦点。
研究方法
菌株、质粒与材料
黑曲霉VT-2（A. niger CICC2422）购自湖南鸿鹰生物科技有限公司（中国湖南）。DNA聚合酶（PrimeSTAR™ HS）、限制性内切酶和T4-DNA连接酶购自Takara Biotechnology（中国大连）。NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix（目录号#E2621L）用于多个DNA片段的连接。寡核苷酸由上海生工生物技术有限公司合成。One Shot® TOP10化学感受态大肠杆菌（Invitrogen）用于质粒扩增。2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)酯（ABTS）、愈创木酚、雷马唑亮蓝R（RBBR）、靛蓝、酸性红和丁香酸甲酯购自Sigma-Aldrich公司。黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素ELISA试剂盒由江苏苏微微生物研究有限公司提供。除非另有说明，所有化学试剂均为分析纯。本研究所用菌株、质粒和引物的详细信息见补充材料S1（表S1-S3）。
【数据】菌株：A. niger VT-2（CICC2422）；试剂来源：Takara、Sigma-Aldrich、上海生工等；试剂盒：AFB1/ZEN/呕吐毒素ELISA试剂盒
单色革盖菌漆酶Lac2的生物信息学分析、模型构建与分子对接
漆酶Lac2的氨基酸序列从NCBI数据库获得（ID：QLF98712），使用SignalP6.0预测蛋白表达信号肽。ProtParam用于预测分子量、等电点和总平均亲水性（GRAVY）等理化参数。此外，使用BLASTP在PDB数据库进行同源结构的在线比对，进化树展示和序列比对分别使用MEGA11.0和ESPript3.0完成。最终蛋白三级结构建模后，使用Alphafold2和Rosetta relax优化侧链结构，选择最优结构模型与催化底物进行分子对接。六种底物分子结构分为两类：染料分子（雷马唑亮蓝R（RBBR）、靛蓝和酸性红）和真菌毒素（黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素），3D分子结构从配体结构数据库PubChem获取。漆酶Lac2蛋白与分子的对接构象使用CB-Dock2获得。
【数据】数据库：NCBI（ID: QLF98712）、PDB、PubChem；软件：SignalP6.0、ProtParam、MEGA11.0、ESPript3.0、Alphafold2、Rosetta relax、CB-Dock2
密码子优化
单色革盖菌漆酶基因Lac2由上海生工合成（NCBI参考序列：MT720692.1）。Lac2-OPT基因根据黑曲霉偏好密码子进行密码子优化（GENE Optimization，上海生工）。密码子优化过程中Lac2-OPT的氨基酸序列未改变。密码子优化后的Lac2-OPT基因已提交至NCBI Sequence Read Archive（登录号：OR742404）。
【数据】基因：Lac2（MT720692.1）、Lac2-OPT（OR742404）；优化策略：黑曲霉偏好密码子；氨基酸序列：未改变
表达载体的构建
以pMD18-T-Lac2载体和密码子优化的pUC57-Lac2-OPT载体为模板，分别用引物Lac2-F/Lac2-R和Lac2-OPT-F/Lac2-OPT-R扩增全长Lac2和Lac2-OPT基因片段。黑曲霉表达载体pANEXP和分子伴侣载体pANpki的构建方法见补充材料S2中的图S1和S2。这些PCR片段设计为与pANEXP载体有30 bp重叠。随后通过NEBuilder® HiFi DNA assembly方法，将XbaI线性化的pANEXP载体与Lac2或Lac2-OPT片段连接，形成pANEXP-Lac2和pANEXP-Lac2-OPT载体。以相应的基因合成分子伴侣载体为模板（PUC-HacA、PUC-PDI、PUC-ERO1），用特异性引物对扩增编码分子伴侣HacA（AAQ73495.1）、PDI（XP_001400609.1）、ERO1（XP_001398061.1）和BIP（XP_001394413.1）的基因。采用相同方法，成功构建了pANpki-HacA、pANpki-PDI、pANpki-BIP和pANpki-ERO1等载体。
【数据】载体：pANEXP-Lac2、pANEXP-Lac2-OPT、pANpki-HacA、pANpki-PDI、pANpki-BIP、pANpki-ERO1；重叠长度：30 bp；分子伴侣基因：HacA、PDI、ERO1、BIP
原生质体转化及漆酶菌株筛选方法
按照Baltz等人建立的方案制备并转化黑曲霉VT-002菌株的原生质体，详细方法见补充材料S2。pANEXP-Lac2和pANEXP-Lac2-OPT质粒用Bgl II（Thermo Scientific，Waltham, MA, USA）线性化后，通过原生质体介导的转化分别转入黑曲霉VT-2。转化后的原生质体涂布在含有1 M山梨醇和潮霉素B（300 µg/mL）的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上。为筛选产漆酶菌株，样品在30°C培养6天，然后用含0.1%愈创木酚的PDA培养基点接转化子。培养后根据颜色强度判断酶活性——颜色越深表示酶活性越高。在愈创木酚筛选培养基上呈现深色区域的菌落被转移至24孔深孔板，每孔加入2 mL马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）培养基，继续培养3天。随后使用ABTS酶学测定法测量漆酶活性。根据酶活性，选择活性最高的前20株重组菌株进行初始摇瓶发酵。从这些菌株中，选择酶活性最高的菌株进行三次平行摇瓶发酵验证。
【数据】筛选培养基：PDA + 1 M山梨醇 + 潮霉素B（300 µg/mL）；培养温度：30°C；培养时间：6天（平板）/3天（深孔板）；筛选试剂：0.1%愈创木酚；检测方法：ABTS酶学测定法
分子伴侣共表达
选择漆酶活性最高的重组菌株作为宿主菌株。随后用表达分泌分子伴侣的线性化载体转化该菌株。转化后，原生质体在含有1 M山梨醇和Zeocin（100 µg/mL）的PDA琼脂平板上培养。从这些平板中，每种分子伴侣共表达重组菌株各筛选200个单菌落，使用愈创木酚筛选培养基进行筛选。筛选程序遵循前述漆酶菌株筛选方法。选择活性最高的重组菌株进行三次平行摇瓶发酵。
【数据】筛选培养基：PDA + 1 M山梨醇 + Zeocin（100 µg/mL）；筛选数量：每种分子伴侣200个单菌落；筛选方法：愈创木酚筛选培养基
ARTP诱变及阳性突变菌株筛选
本研究采用ARTP系统（型号ARTP-II，北京思清源生物技术有限公司，中国北京）对漆酶酶活性最高的菌株进行诱变。菌株诱变方案基于Wang等人建立的方法。将10 µL原生质体悬浮液涂布在铁碟上，并暴露于等离子体射流中。诱变参数设置如下：处理功率120 W，气体流速10 slm（标准升/分钟），处理时间从0秒到300秒，间隔30秒。等离子体射流喷嘴与铁碟之间的距离保持在2 mm。随后对菌落进行计数并绘制存活率曲线。阳性突变菌株的筛选：在30°C培养6天后，用含0.1%愈创木酚的PDA培养基点接转化子。在愈创木酚筛选培养基上呈现深色区域的菌落被转移至24孔深孔板，每孔加入2 mL PDB培养基，继续培养3天。筛选方法遵循前述漆酶菌株筛选方法。选择活性最高的前20株重组菌株进行摇瓶发酵。突变体的遗传稳定性通过监测各代漆酶酶活性进行评估。
【数据】诱变仪器：ARTP-II；功率：120 W；气体流速：10 slm；处理时间：0-300 s（间隔30 s）；喷嘴距离：2 mm；原生质体量：10 µL；培养温度：30°C；培养时间：6天
研究结果
漆酶Lac2的生物信息学分析、模型构建与分子对接
通过PDB数据库序列比对，从不同物种中筛选出9个相似度超过60%的漆酶表达序列（补充材料S1：图S1）。序列比对显示漆酶的活性催化中心具有高度的位点保守性，由四个铜离子组成。去除前21个氨基酸的信号肽后，使用Alphafold2对漆酶Lac2的氨基酸序列进行局部结构预测，获得整体残基置信度得分（pLDDT）大于97的3D结构模型。使用Rosetta relax模块优化结构侧链。本研究通过CB-Dock2成功识别出漆酶蛋白的底物催化活性口袋C3，其中包含与T1Cu配位的活性位点H455。漆酶与六种底物的分子对接结果如图1所示，对接和位点分析的完整数据见补充材料S1：表S4。分子对接分析显示，RBBR与漆酶形成五个氢键，分别与氨基酸N264、G391、H455、A163和W454相互作用。靛蓝与漆酶在A163处形成一个氢键，而酸性红通过一个氢键与漆酶在H455处结合。结合能研究显示，漆酶Lac2蛋白与RBBR、靛蓝和酸性红的相互作用能分别为-8.4 kcal/mol、-8.3 kcal/mol和-7.1 kcal/mol。黄曲霉毒素B1通过A163和H455与Lac2蛋白相互作用。玉米赤霉烯酮通过W454和H455与Lac2相互作用。呕吐毒素与漆酶2蛋白D206、A163和G391形成四个氢键，但表现出最低的结合能。在真菌毒素降解方面，漆酶Lac2蛋白与玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1和呕吐毒素的Vina得分分别为-7.4 kcal/mol、-7.7 kcal/mol和-5.8 kcal/mol。
【数据】同源序列：9条（相似度>60%）；pLDDT：>97；结合能：RBBR -8.4 kcal/mol、靛蓝 -8.3 kcal/mol、酸性红 -7.1 kcal/mol；Vina得分：ZEN -7.4 kcal/mol、AFB1 -7.7 kcal/mol、呕吐毒素 -5.8 kcal/mol；氢键数量：RBBR 5个、靛蓝 1个、酸性红 1个、呕吐毒素 4个
表达Lac2和Lac2-OPT的重组黑曲霉的构建与筛选
如图2a所示，Lac2和Lac2-OPT被克隆并插入表达载体pANEXP。线性化后，通过原生质体转化转入黑曲霉VT-2。从200个单菌落中，选择酶活性最高的20个转化子进行摇瓶发酵。图2b显示，20株AN-Lac2-OPT菌株的平均酶活性显著超过AN-Lac2-WT菌株。分别选择酶活性最高的菌株进行发酵验证。AN-Lac2-WT和AN-Lac2-OPT的最高酶活性分别为9.8 U/mL和13.6 U/mL，分别由WT-18和OPT-3菌株实现（图2b）。值得注意的是，OPT-3相比WT-18酶活性提升了38.8%。
【数据】筛选数量：200个单菌落；最高酶活性：AN-Lac2-WT（WT-18）9.8 U/mL、AN-Lac2-OPT（OPT-3）13.6 U/mL；提升幅度：38.8%
共表达OPT-3与分子伴侣的重组黑曲霉的构建与筛选
为研究分子伴侣在增强Lac2-OPT于黑曲霉中表达的作用，克隆了四种分子伴侣基因——HacA、ERO1、BIP和PDI（图3a），并整合到pANpki载体中，获得重组质粒（pANpki-HacA、pANpki-ERO1、pANpki-BIP和pANpki-PDI）。线性化后转化入OPT-3菌株。如图3b所示，转化子HacA表现出最高的酶活性，达到20.8 U/mL，其次是BIP，活性为15.5 U/mL。ERO1和PDI均未显示出对Lac2表达的增强作用。基于这些结果，选择OPT-3-HacA进行进一步研究。
【数据】最高酶活性：HacA共表达株 20.8 U/mL；BIP共表达株 15.5 U/mL；ERO1/PDI：无增强效果；筛选菌株：OPT-3-HacA
ARTP诱变及阳性突变菌株筛选
为进一步提高黑曲霉中漆酶的酶活性，采用ARTP诱变系统对OPT-3-HacA的原生质体进行诱变。图4c显示了黑曲霉OPT-3-HacA的致死率曲线和正突变率。ARTP诱变处理时间不仅影响致死率，还显著影响突变效率。为获得理想的突变率，处理时间对ARTP诱变至关重要。由于筛选优势突变菌株需要大量突变，引入了一种高通量筛选高产漆酶突变菌株的快速筛选方法。该方法包括以下模块：ARTP突变系统、愈创木酚显色平板筛选和24深孔板高通量筛选。经过五轮ARTP诱变筛选，初筛了约10,000株菌株。图4a和b展示了诱变后在PDA平板上培养的菌株以及转移到含0.1%愈创木酚的PDA培养基上菌株的显色区域。ARTP诱变后，通过愈创木酚比色筛选法分离出近200株酶活性增强的突变体。这些突变体随后被转移到24孔深孔板进行微量发酵，相对酶活性如图4d所示。根据酶活性选择的前20株突变体进行摇瓶发酵，结果如图4e所示。OPT-HacA-M10为最优菌株，漆酶酶活性最高达35.4 U/mL；与初始菌株OPT-HacA相比提高了68.6%。通过多代培养突变体并测定各代漆酶酶活性来评估OPT-HacA-M10的遗传稳定性。图4f显示，漆酶酶活性稳定维持在约35 U/mL，后续传代培养中的波动可忽略不计。
【数据】ARTP诱变轮数：5轮；初筛菌株数：约10,000株；筛选获得突变体：约200株；最高酶活性：OPT-HacA-M10 35.4 U/mL；提升幅度：68.6%；遗传稳定性：约35 U/mL（多代稳定）
50 L发酵罐中的放大生产
为进一步提高漆酶的表达量，对漆酶活性最高的OPT-HacA-M10在50 L发酵罐中进行了高密度发酵。如图5所示，在213小时的发酵过程中，漆酶产量持续增加，酶活性增长曲线近似S形曲线。在发酵罐中，黑曲霉细胞快速生长，在第93小时达到峰值湿重426 g/L。发酵96小时后，菌丝体断裂，导致溶解氧回升。漆酶在68小时至140小时间隔内表现出最快的生长速率。湿重法适用于高菌浓度样品，是测量丝状真菌生长的常用方法。细胞湿重与细胞数量之间存在线性关系。发酵结束时，湿细胞重达到峰值439 g/L，漆酶活性达到416.8 U/mL的高水平。
【数据】发酵罐体积：50 L；发酵时间：213 h；峰值湿重：426 g/L（93 h）；最终湿重：439 g/L；最高漆酶活性：416.8 U/mL；快速增长期：68-140 h
重组漆酶rLac2的SDS-PAGE和Native-PAGE分析
SDS-PAGE分析显示，重组漆酶rLac2的分子量约为58–60 kDa（图6a），与其理论分子量56 kDa接近。使用Native-PAGE检测OPT-HacA-M10漆酶Lac2的表达，蛋白样品在凝胶上样前未经加热或SDS处理。随后通过观察ABTS（图6b）和愈创木酚（图6c）的颜色变化进行原位漆酶活性检测。Native电泳进一步以ABTS和愈创木酚为底物确认了漆酶活性。基于SDS-PAGE和Native-PAGE分析结果，推测漆酶编码基因已成功在黑曲霉中表达，且表达产物分泌到发酵液中。
【数据】分子量：58-60 kDa（SDS-PAGE）；理论分子量：56 kDa；检测底物：ABTS、愈创木酚
重组漆酶rLac2的生化特性表征
以ABTS和愈创木酚为底物，测定了温度和pH对rLac2活性的影响。如图7a和b所示，对于底物ABTS和愈创木酚，rLac2表现出显著不同的最适反应温度和pH值。
【数据】底物：ABTS、愈创木酚；最适温度/最适pH：见图7a和b（原文未在节选部分详述具体数值）
讨论与解读
漆酶是具有显著生物技术潜力的环保催化剂。目前，单色革盖菌来源的漆酶已被应用于生物降解、生物修复、脱木质素和脱色等多个领域。漆酶的重组表达仍是一个重要的研究领域，受到广泛学术关注。虽然酵母是漆酶表达的常见真核宿主，但其产量低和过度糖基化限制了其工业应用。目前单色革盖菌漆酶的异构表达水平相对较低。值得注意的是，Macellaro报道平菇漆酶在黑曲霉中的表达量是酿酒酵母的175倍。因此，黑曲霉是一个有吸引力的选择，尤其是考虑到其蛋白质生产能力以及被普遍认为是安全的（GRAS）地位。本研究系统探索了Lac2在黑曲霉中的异构表达。最初选择黑曲霉强启动子PglaA驱动Lac2表达，并使用其天然信号肽引导漆酶分泌。该方法在摇瓶培养上清液中获得9.8 U/mL的漆酶酶活性，比毕赤酵母产漆酶高39倍。
编译者解读：本研究展示了"组合策略"在丝状真菌蛋白表达中的强大威力——单靠密码子优化仅获得38.8%的提升，引入分子伴侣HacA后进一步提升，而ARTP诱变最终将产量推至416.8 U/mL的工业级水平。这种"理性设计+随机诱变"的递进式策略值得借鉴。值得注意的是，分子伴侣筛选揭示了HacA（未折叠蛋白反应转录因子）而非氧化折叠相关的ERO1/PDI对漆酶分泌的促进作用最为显著，提示分泌通量而非折叠效率可能是限速步骤。牛仔布漂白和霉菌毒素降解（>94%）的双重应用验证，使该菌株在纺织和食品工业中具有直接转化价值。局限在于50 L罐放大与工业生产规模仍有距离，且霉菌毒素降解产物毒性未评估。
参考来源
Jiang Huang. Improved expression of Cerrena unicolor Laccase in Aspergillus niger via combined strategies and its applications. Biochemical Engineering Journal, 2024. DOI: 10.1016/j.bej.2024.109371
DOI: 10.1016/j.bej.2024.109371