来源：Filamentous multiscale characterization of the cultivation of Actinomadura namibiensis pellets for model-based prediction of labyrinthopeptin A1 biosynthesis.（Microb Cell Fact）| 编译：DNA Lab Space
导读
丝状放线菌纳米比亚游动放线菌（Actinomadura namibiensis）是已知唯一能天然产生碳环羊毛硫抗生素拉比林肽A1（labyrinthopeptin A1）的微生物，该产物具有广谱抗病毒活性。本研究通过摇瓶培养离线分析与菌球内部氧微剖面测量相结合的多尺度实验，构建了扩散-反应方程形式的预测模型，定量描述了底物摄取、氧扩散限制与菌球生长之间的耦合关系。模型经实验数据校准后，可准确预测菌球生长、底物消耗与产物合成，为丝状微生物培养过程的理性优化提供了定量工具。
研究背景
丝状微生物是多种有价值化合物的重要天然生产者，包括大宗化学品、酶和药用成分。其微观与宏观形态高度复杂，且强烈依赖于菌株和产物特性。丝状细菌是次级代谢产物（如青霉素、美伐他汀、烟曲霉素）的丰富来源，这些代谢物是新型抗菌和抗病毒药物的候选分子，尤其是在抗生素耐药性日益严重的背景下。
拉比林肽A1是由纳米比亚游动放线菌产生的羊毛硫抗生素，对HIV、HSV、寨卡和登革病毒具有广谱抗病毒活性。该菌曾在摇瓶和10 L搅拌釜生物反应器中培养，摇瓶中最高产物滴度达325 mg/L。拉比林肽A1属于次级代谢产物，其合成仅在从生长期向生产期转变后启动——通常发生在培养约三天后，伴随葡萄糖耗尽和甘油消耗的开始。在菌球水平建立微生物生长与产物形成模型，需要深入理解培养条件、底物可用性与氧限制之间的相互作用机制。
研究方法
培养与离线分析
所有实验均使用纳米比亚游动放线菌菌株（DSM 44197）。培养程序与条件、培养基组成及冷冻培养物的制备方法参见Kozanecka等人[20]的文献。与前述程序不同之处在于，第一次预培养在与第二次预培养相同的条件下进行匀浆处理。
实验室规模与菌球规模实验研究的流程如图1所示。
图1 多尺度实验流程图：a 实验室规模下DOT在线测量及底物与产物浓度离线分析，b 菌球规模下的细胞计数、形态分析与氧剖面测量。缩写：SFR：摇瓶反应器，Ḡ：甘油浓度，S̄：葡萄糖浓度，labA1̄：拉比林肽A1浓度，BC 1/2：氧体积浓度为100%/50%的边界条件，AESD：面积等效球直径，γV：相对体积比
葡萄糖和甘油浓度以及拉比林肽A1滴度采用高效液相色谱法在相应测量条件下进行分析。细胞干重浓度分析按照近期方案[20]执行。溶解氧张力（DOT）通过集成在摇瓶中的光学氧传感器（SP-PSt3-NAU和Shake Flask Reader，PreSens Precision Sensing GmbH，德国）进行在线监测。
【数据】菌株：A. namibiensis DSM 44197；分析仪器：HPLC、光学氧传感器（SP-PSt3-NAU + Shake Flask Reader，PreSens）；培养条件：参见Kozanecka等[20]文献
氧微剖面测量
用于跨纳米比亚游动放线菌菌球半径进行氧微剖面测量的实验装置详见Kozanecka等人[20]的文献。本研究对该装置进行了扩展，增加了两个手动可调气体流量控制器（GCA-C9SA-FA25 red-y，Voegtlin Instruments GmbH，Bad Koetzting，德国），用于调节空气-氮气混合气体。这一改动使得菌球周围的边界条件可调，即氧体积浓度为50%和100%。
测量前，在数字显微镜（EVOS xL AMG，Bothell，美国）下选取菌球。将固定后的菌球置于充满培养液的流动池中后，在启动自动剖面测量前设置10分钟的等待/准备时间（Δtprep = 10 min）。测量参数如下：步长10 μm，时间增量Δtexp = 15 s（包含每次测量前5秒等待时间和10秒测量持续时间）。流动设置为雷诺数Re = 127 ± 11。此外，在测量过程中使用工业相机（RS-OV7949-1818，Conrad Electronics SE，Hirschau，德国）跟踪并目视估计菌球边缘。
氧剖面数据用于确定菌球边界和中心的位置。菌球边缘被识别为剖面中负斜率最陡峭的点。该位置随后与测量期间记录的可视观察结果进行比较，以确保一致性。利用显微图像分析获得的面积等效球直径（AESD），由确定的半径计算菌球中心。验证该点的氧浓度，确保其对应剖面中的最低值。若不符合，则根据剖面斜率确定的菌球边界位置进行手动调整，以获得物理上一致的剖面形状。
【数据】等待时间：Δtprep = 10 min；步长：10 μm；时间增量：Δtexp = 15 s；雷诺数：Re = 127 ± 11；氧边界条件：50%和100%体积浓度；仪器：数字显微镜（EVOS xL AMG）、工业相机（RS-OV7949-1818）
细胞计数
培养过程中，菌球总数通过体积外推法确定。从100 mL匀浆化培养液中取1 mL等分试样，用0.9%（w/v）氯化钠溶液按稀释因子14、25或27稀释（取决于菌球浓度）。使用配备电动载物台的数字显微镜（Smartzoom 5，Zeiss，Oberkochen，德国）扫描稀释溶液的亚样品（200-400 μL，取决于菌球浓度），进行菌球计数和后续图像分析。亚样品中的物体计数结果结合所用稀释因子用于估算总菌球群体。该取样在两次独立实验中于五个不同时间点（0/24/48/120/144 h）进行。
【数据】取样体积：1 mL/100 mL培养液；稀释液：0.9%（w/v）NaCl；稀释因子：14、25或27；亚样品体积：200-400 μL；取样时间点：0/24/48/120/144 h；重复：2次独立实验；仪器：Smartzoom 5数字显微镜（Zeiss）
研究结果
纳米比亚游动放线菌的摇瓶培养
研究采用系统方法评估每次摇瓶培养的进展和稳定性，包括测量底物、产物和细胞干重（CDW）浓度、pH和DOT。所得培养数据汇总于图4。
图4 添加50 mM (NH₄)₂SO₄的纳米比亚游动放线菌摇瓶培养实验数据（30°C，180 rpm）：a 底物和产物浓度，b 细胞干重、pH和DOT。阴影区域表示标准偏差，由线连接的圆圈表示数据的平均值。所有数据来自四次独立培养的平均值
前期研究表明，葡萄糖和淀粉的代谢方式几乎完全相同[13, 20]。因此，本研究仅分析葡萄糖。在培养的最初72小时内，葡萄糖完全耗尽，此后甘油代谢持续至168小时。产物合成始于72小时后，培养最后一天拉比林肽A1滴度达到193.4 ± 4.2 mg/L。CDW持续增加至144小时，达到最大值13.3 ± 0.3 g/L。pH在约6.9左右保持稳定，144小时后在全部四次培养中升至7.5。DOT在48小时后达到约20%的低点，96小时后升至80-90%。该水平在129至168小时之间保持恒定，在培养最后三天升至100%。
【数据】葡萄糖耗尽时间：72 h；产物合成起始：72 h；拉比林肽A1滴度：193.4 ± 4.2 mg/L（培养终点）；最大CDW：13.3 ± 0.3 g/L（144 h）；pH：稳定约6.9，144 h后升至7.5；DOT最低点：约20%（48 h），升至80-90%（96 h），最后三天达100%；培养条件：30°C，180 rpm，添加50 mM (NH₄)₂SO₄；重复：4次独立培养
培养系统的参数估计与模拟
通过将摇瓶中葡萄糖、甘油、氧和拉比林肽A1的模拟曲线与相应实验测量值进行比较，评估了所提出模型的性能。比较结果如图5所示。
图5 摇瓶培养的模拟与实验结果比较，模拟数据以线条绘制，实验测量平均值以圆圈显示。阴影区域表示标准偏差
总体而言，模型与观测数据高度一致，有效捕捉了底物消耗和产物形成的主要趋势。不同形状和颜色的离散标记代表每24小时间隔测量的葡萄糖、甘油、氧和拉比林肽A1浓度。模拟结果以1小时间隔绘制，以平滑连续地呈现培养动态。在培养前48小时内，氧剖面出现轻微偏差——实验中最低氧浓度出现在培养48小时后，而模拟剖面中最低值出现在24至48小时之间。此外，在培养后期，拉比林肽A1剖面出现轻微偏差，伴随碳源甘油短缺。实验数据显示，即使甘油完全耗尽后，拉比林肽A1仍在继续积累。然而，根据本研究的假设，一旦碳源耗尽，模拟中不再有进一步产物生成。
图6显示了相应的菌球和培养液构型，提供了培养数天内培养系统中底物营养物质（包括氧、葡萄糖和甘油）的空间分布、径向活性剖面以及产物积累的详细信息。
图6 培养过程中菌球和流体构型的模拟结果：a DOT剖面，b 葡萄糖浓度剖面，c 甘油浓度剖面，d 拉比林肽A1浓度分布，e 菌球活性α剖面
可以看出，葡萄糖和甘油浓度剖面在培养过程中从初始值下移至0。相反，氧剖面的下降趋势在培养48小时后出现恢复迹象，因为氧供应超过了菌丝的消耗速率。氧和活性剖面均在菌球边界处呈现最大值，而菌球内部水平较低。活性剖面逐渐向更高值移动，最终在96小时后达到成熟状态。体积分数较低的菌丝生长最快，α的峰值始终位于菌球边界。当f_sw^α被激活后，拉比林肽A1的形成受α控制。因此，产物积累在培养开始后至少72小时才开始。
随后对菌球内部氧剖面的研究在培养第2天（48 h）和第7天（168 h）进行，氧剖面实验在两种不同边界条件下实施——菌球周围液体域中氧饱和度分别为50%和100%。
图7 菌球和流体域的氧剖面实验与模拟结果：培养48 h的菌球在a 100%和b 50%氧饱和度下的氧剖面。培养c 48 h和f 168 h的菌球活性剖面。培养168 h的菌球在d 100%和e 50%氧饱和度下的氧剖面。绿线表示剖面测量前t₀时刻的氧剖面。黑色粗曲线为模拟结果，圆圈为用于比较的实验测量值
相应结果如图7所示。总体而言，模拟与实验测量的氧浓度之间表现出良好的一致性。48小时后，在100%饱和条件下，剖面测量前后的氧浓度均低于168小时。这表明培养早期阶段氧消耗更高、氧限制更严重。这一现象在菌球中心尤为明显——48小时剖面测量后，中心氧浓度从0.82 mg/L升至4.26 mg/L。168小时后，氧浓度从6.36 mg/L轻微升至7.01 mg/L。在50%饱和条件下观察到类似趋势。菌球中心氧浓度在48小时后从0.82 mg/L升至1.47 mg/L，而168小时后从6.36 mg/L降至3.32 mg/L。这一下降归因于外部氧浓度较低，驱动氧从菌球中向外扩散。
【数据】模拟间隔：1 h；实验测量间隔：24 h；菌球中心氧浓度（100%饱和，48 h）：0.82 → 4.26 mg/L（剖面测量后）；菌球中心氧浓度（100%饱和，168 h）：6.36 → 7.01 mg/L；菌球中心氧浓度（50%饱和，48 h）：0.82 → 1.47 mg/L；菌球中心氧浓度（50%饱和，168 h）：6.36 → 3.32 mg/L；活性剖面成熟时间：96 h；产物积累起始：≥72 h
底物消耗
整个培养过程中氧、葡萄糖和甘油的累积底物消耗如图8所示。归因于菌球生长和菌球维持的消耗分别以虚线和实线曲线显示，不同底物以不同颜色区分。
图8 氧（蓝色）、葡萄糖（橙色）和甘油（红色）消耗的模拟结果（指数：con），显示菌球内部随时间的消耗量
【数据】底物种类：氧、葡萄糖、甘油；消耗分配：菌球生长（虚线）、菌球维持（实线）
讨论与解读
培养性能与可重复性
纳米比亚游动放线菌培养呈现二次生长（diauxic growth）特征。在葡萄糖代谢的初始阶段，生物量显著增加；在随后的甘油摄取阶段，增长仍在继续，但生长速率较慢。这一生长行为与前期研究结果一致[13, 20, 58]。pH在整个培养过程中保持稳定，但在最后几天，所分析的四次培养均出现轻微偏移至7.5。这一偏移可能由铵离子浓度降低（如Tesche等[13]报道）或次级代谢产物产生所致。例如，Microbispora sp.产生羊毛硫抗生素NAI-107时观察到pH升高，这与氨基酸利用及伴随的氨释放相关[59]。
拉比林肽A1最高滴度在培养第9天（216 h）达到。尽管前期研究记录了略高的浓度（如273 mg/L[20]），但本研究中四次重复实验观察到的极小标准偏差，与标准丝状培养及该放线菌的先前研究相比均十分显著。与早期研究不同，本研究采用了不同的冷冻培养物技术。如Tesche等[13]和Hanke等[58]所述，第一次预培养接种的是解冻的琼脂块。而本研究的冷冻培养物处理方式有所不同——这可能是培养可重复性提升的关键因素。
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于将多尺度实验表征与扩散-反应模型有机结合：摇瓶层面的离线数据提供了宏观动力学参数，而菌球尺度的氧微剖面则直接揭示了颗粒内部的传质限制。这种方法对丝状微生物发酵的过程理解与优化具有通用价值——尤其是氧微剖面结合双边界条件（50%/100%氧饱和）的设计，巧妙地区分了外部传质与内部扩散的贡献。模型对甘油耗尽后产物仍持续积累这一现象未能完全捕捉，提示次级代谢产物的合成调控可能涉及更复杂的碳源切换机制，值得在后续模型中引入底物储存或延迟响应项。此外，培养可重复性的提升（极小标准偏差）暗示冷冻培养物处理方式对丝状菌培养稳定性有显著影响，这一工程细节对工业放大具有实际参考意义。
参考来源
Liu Q, Kozanecka ZJ, Liu J, Dohnt K, Krull R. Filamentous multiscale characterization of the cultivation of Actinomadura namibiensis pellets for model-based prediction of labyrinthopeptin A1 biosynthesis. Microb Cell Fact. PMID: 42576228.
PMID: 42576228