来源：System reconstruction of Bacillus licheniformis for efficient expression of alkaline protease.（Synth Syst Biotechnol）| 编译：DNA Lab Space
导读
碱性蛋白酶（AprE）市场规模达数十亿美元，但低产量制约其广泛应用。本研究以地衣芽孢杆菌DW2为底盘，通过元件优化（密码子、启动子、信号肽）与基因组精简（删除5个大片段），结合代谢组学指导的模块化改造（氨基酸合成、能量代谢、溢流代谢、细胞膜/壁工程），最终获得高产菌株DM6E10，摇瓶酶活达34,343 U/mL，5 L生物反应器中最高达107,100 U/mL。该策略为其他蛋白表达宿主的优化提供了系统参考。
研究背景
工业酶在食品、洗涤剂及动物饲料等领域应用广泛。Grand View Research（2023）数据显示，2023年全球工业酶市场价值75.3亿美元，预计2033年达126.4亿美元。碱性蛋白酶（AprE）在低温去污生物洗涤剂、环保皮革加工及食品蛋白水解中应用普遍。高效酶表达取决于酶本身和表达宿主两个关键要素。酶工程方面，定向进化、理性设计和AI辅助蛋白进化已被证明能有效提升酶性能；宿主工程方面，删除竞争产物基因、非必需蛋白或功能未知蛋白的基因可优化宿主基因组，增强重组蛋白表达。合成生物学与代谢工程为构建高效表达系统提供了有力工具。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用菌株列于表S1，质粒和引物分别列于表S2和表S3。大肠杆菌DH5α用于质粒构建，地衣芽孢杆菌DW2cas9n为亲本菌株。基因表达、敲除和整合载体分别基于穿梭载体pHY300PLK和T2(2)-Ori构建。
地衣芽孢杆菌和大肠杆菌在Luria-Bertani（LB）培养基或添加抗生素（四环素20 μg/mL；卡那霉素20 μg/mL）的LB肉汤中培养。AprE发酵培养基含50 g/L玉米淀粉、45 g/L豆粕、6 g/L CaCO₃、5 g/L (NH₄)₂SO₄和0.35 g/L耐热淀粉酶。TB培养基含12 g/L蛋白胨、24 g/L酵母提取物、5 g/L甘油、16.42 g/L K₂HPO₄、2.31 g/L KH₂PO₄。纳豆激酶发酵培养基由20 g/L葡萄糖、10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl、10 g/L大豆蛋白胨、10 g/L玉米浆和6 g/L (NH₄)₂SO₄组成。几丁质酶发酵培养基含50 g/L玉米淀粉、45 g/L豆粕、6 g/L CaCO₃和5 g/L (NH₄)₂SO₄。除非另有说明，所有培养均在37°C进行。
【数据】培养基：LB/AprE发酵培养基/TB/纳豆激酶发酵培养基/几丁质酶发酵培养基；抗生素：四环素20 μg/mL、卡那霉素20 μg/mL；温度：37°C；碳源：50 g/L玉米淀粉或20 g/L葡萄糖
2.2 重组菌株的构建
基因表达菌株的构建参照本课题组此前报道的方法[19]。以pHY300PLK质粒构建一系列AprE表达载体。以AprE表达载体pHY-P43-aprE的构建为例：从地衣芽孢杆菌DW2扩增启动子P43、碱性蛋白酶信号肽SPAprE和来自克劳氏芽孢杆菌的aprE基因（引物见表S3），通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）融合，使用ClonExpress一步克隆试剂盒（Vazyme Biotech Co., Ltd, 南京，中国）插入pHY300PLK，得到质粒pHY-P43-aprE。双突变和多突变质粒基于pHY-P43-aprE构建。随后将这些质粒转入地衣芽孢杆菌DM1获得相应重组菌株。其他蛋白酶和GFP表达菌株采用相同方法获得。
温度敏感质粒T2(2)-Ori用于构建基因整合和启动子替换载体。以载体T2-△oxdC为例：分别扩增地衣芽孢杆菌oxdC基因的上下游同源臂，经SOE-PCR后组装到T2(2)-Ori载体中，生成T2-△oxdC（表S2）。基因缺失、整合和启动子替换菌株的构建参照此前描述的方法[20]。
CRISPR/Cas9n用于从DW2基因组删除大片段，CRISPR/dCas9用于基因干扰，相关方法参照前期文献[21]。gRNA表达质粒通过电转化导入地衣芽孢杆菌细胞，缺失基因通过DNA测序验证。
【数据】质粒：pHY300PLK、T2(2)-Ori；试剂盒：ClonExpress One Step Cloning Kit；电转化；验证：DNA测序
2.3 碱性蛋白酶发酵与酶活检测
地衣芽孢杆菌重组菌株在LB琼脂平板上培养12–14 h，挑取单菌落先转接至5 mL LB培养基，再扩大至20 mL获得种子液（OD600 ≈ 4.0）。种子培养物以5%接种量接种至含20 mL AprE发酵培养基的250 mL锥形瓶中，培养48 h至发酵终点（以pH 8.3为标志）。随后在4°C、12,000 rpm离心10 min获得上清液，并系列稀释。AprE酶活采用福林-酚试剂按照中国国家标准GB/T 23547-2009检测。1个AprE酶活单位（U）定义为在指定条件（40°C，pH 10.5）下通过酪蛋白水解每分钟产生1 μg酪氨酸的酶量。变性重组蛋白的分子量通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定，使用蛋白Marker（Vazyme，中国）。
【数据】接种量：5%；发酵时间：48h；终点pH：8.3；离心：12,000 rpm、10 min、4°C；酶活检测：福林-酚法、40°C、pH 10.5；SDS-PAGE
2.4 代谢组学分析方法
每个AprE发酵瓶用液氮快速冷却至9 ± 2°C以淬灭细胞。加入冷0.85% NaCl（v/v）将发酵液稀释2倍。1500 rpm、4°C离心15 min后取上清。离心后，细胞用冷0.85% NaCl和2.5% (NH₄)₂CO₃在4°C、10,000 rpm高速离心5 min洗涤。提取程序按Yuan等[22]的方法进行。随后取5个OD600单位的细胞用于代谢物提取和GC-MS分析。GC-MS数据先用Reifycs Abf Converter（Analysis Base File）转换为abf格式，转换后的数据用MSDIAL软件与Fiehn Bin Base代谢组数据库匹配，生成名为“Height file”的输出文件。每个代谢物的峰面积用内标（糖脂浓缩混合物，脂肪酸甲酯，C8–C30）归一化。胞内有机羧酸含量根据GC-MS结果分析。随后将处理后的数据进行主成分分析（PCA）。使用SIMCA 14.1（Umetrics，瑞典）进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。每次比较中VIP值>1、p值<0.05且倍数变化>2或<0.5的代谢物被选为差异代谢物。使用MetaboAnalyst软件（http://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/）分析差异代谢物对京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路的贡献。最后使用HemI（Heatmap Illustrator，http://hemi.biocuckoo.org/）生成热图。
【数据】淬灭温度：9 ± 2°C；洗涤：0.85% NaCl、2.5% (NH₄)₂CO₃；离心1：1500 rpm、15 min、4°C；离心2：10,000 rpm、5 min、4°C；样品量：5 OD600单位；分析：GC-MS、PCA、OPLS-DA；筛选阈值：VIP>1、p<0.05、FC>2或<0.5
2.5 限制密码子分析方法
首先，从地衣芽孢杆菌的同义密码子使用中推导出理想密码子比例（Ideal Prop.，‰；表S6）。计算外源aprE基因中每个密码子的实际比例（Codon Usage，‰）。限制密码子定义为同时满足以下两个预设阈值标准的密码子：（1）理想比例低于5‰，（2）实际比例超过该理想比例的2倍。
【数据】限制密码子标准：理想比例<5‰且实际比例>2×理想比例
2.6 实时荧光定量PCR
RNA提取和转录水平分析方法基于此前描述的方案[23]进行优化。收获中对数期细胞用于mRNA分离，使用细菌总RNA提取试剂盒（APEXBIO，中国）提取RNA。使用HiScript®II Q RT SuperMix试剂盒（Vazyme，中国）合成cDNA。使用CFX96实时PCR系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）对目标基因进行表达分析，所有检测设3个生物学重复和3个技术重复。以16S rRNA基因为内参基因，采用2^−ΔΔCT方法计算倍数变化[24]。
【数据】仪器：CFX96 Real-Time PCR System；内参：16S rRNA；计算方法：2^−ΔΔCT；重复：3个生物学重复×3个技术重复
2.7 分析方法
生物量通过分光光度计（UV-160A；Shimadzu，日本）测定600 nm处吸光度（OD600）评估。残留葡萄糖使用生物传感器分析仪（SBA 40C，山东省科学院，中国）配合固定化酶膜检测。游离氨基酸浓度测定：样品先在4000 rpm、4°C离心5 min去除培养基中固体沉淀，然后上清液在12,000 rpm、4°C离心10 min获得菌体沉淀。上清液按Zhan等描述的方法衍生化后经气相色谱分析[25]。乙偶姻、2,3-丁二醇和乙酸盐浓度按Wang等的方法用气相色谱测定[26]。胞内ATP浓度用ATP检测试剂盒（Beyotime Biotechnology，中国）按其说明书测定。
【数据】生物量：OD600；葡萄糖：生物传感器SBA 40C；氨基酸：GC；有机酸：GC；ATP：ATP assay Kit
研究结果
3.1 通过元件工程优化表达盒
#### 3.1.1 基于比较分析的aprE密码子优化
为优化aprE基因密码子，我们计算了每个密码子的实际比例，考虑了系统发育相近微生物地衣芽孢杆菌与克劳氏芽孢杆菌之间密码子使用偏好的差异（表S4–S6）。本研究鉴定出可能限制aprE在地衣芽孢杆菌中表达的密码子，包括脯氨酸密码子CCA、亮氨酸密码子CUA和丝氨酸密码子AGU。随后将这些密码子替换为偏好的同义密码子，构建了18个突变体并在菌株DM1（DW2cas9n△M44）中表达（图1a）。
酶活测定结果显示，突变体P97CCG、P116CCG、S234TCG和S241TCG相比对照菌株DM1/aprE（CK）酶活分别提高22.02%、18.08%、17.87%和13.71%（图1a）。相反，突变体S21TCG、P162CCG和P306CCG的酶活分别显著降低18.59%、18.91%和58.14%。其余位点的酶活变化无统计学显著性。
随后将有利突变位点P97CCG、P116CCG、S234TCG和S241TCG进行组合。在构建的6个双突变体中，P97CCG-P116CCG活性最高，比对照菌株DM1/aprE（CK）提高28.40%（图1b）。三突变体P97CCG-S241TCG-P116CCG也表现出增强的活性，比CK提高32.11%。RT-qPCR分析显示，随着优化密码子的连续组合，aprE基因转录水平逐渐下降，三突变体菌株相比对照显著降低28.50%（图1c）。我们推测优化密码子可能通过引入二级结构或触发其他生理活动影响基因转录水平。然而，限制密码子的替换也可能减少了核糖体在mRNA上的滞留，提高了翻译效率，具体机制仍需进一步研究。
【数据】单点突变提高：P97CCG +22.02%、P116CCG +18.08%、S234TCG +17.87%、S241TCG +13.71%；单点突变降低：S21TCG −18.59%、P162CCG −18.91%、P306CCG −58.14%；双突变最佳：P97CCG-P116CCG +28.40%；三突变：P97CCG-S241TCG-P116CCG +32.11%；转录水平：三突变体 −28.50%
#### 3.1.2 aprE基因启动子工程
为进一步优化表达盒，我们评估了本实验室此前构建的4个启动子（P43、PykzAPrbs6、PR55和PR39）驱动aprE表达的效果[29]。AprE酶活结果表明，PykzAPrbs6表现最佳，其驱动的AprE酶活比P43提高16.06%，达到7595 ± 309 U/mL（图1d）。RT-qPCR分析显示，PykzAPrbs6介导的aprE转录水平比P43高79.51%（图1e）。有趣的是，虽然PR55等更强启动子进一步提高了转录水平，但重组蛋白表达却出现中等程度下降，提示翻译、蛋白折叠或分泌过程可能存在瓶颈。
【数据】最佳启动子：PykzAPrbs6；酶活：7595 ± 309 U/mL；比P43提高：+16.06%；转录水平：比P43高79.51%
#### 3.1.3 通过优化信号肽三部分结构增强分泌
为提高AprE分泌效率，我们分析了天然Sec型信号肽SPAprE的三部分结构特征（N区、H区、C区）。基于表达盒PykzAPrbs6-SPAprE-aprE，构建了7个SPAprE突变体。突变体P4K的AprE酶活比原始信号肽菌株（DM1/PykzAPrbs6-SPAprE-aprE）提高22.16%，优势突变体P4K-A13L进一步提升了性能，酶活达10,471 ± 444 U/mL，提高37.86%（图1f）。
生物物理表征显示，优化信号肽P4K-A13L净正电荷增加（pH 7.0时从+3.0增至+4.0），GRAVY值（总平均亲水性）升高（从1.03增至1.19），信号肽疏水性增强（图1g）。发酵曲线证实，最优突变体P4K-A13L的AprE酶活和胞外蛋白含量在整个发酵过程中均显著高于对照（图1h–i）。通过密码子优化和元件工程，我们获得了优良表达盒PykzAPrbs6-SPAprE-P4K-A13L-aprEP97-S241-P116。
【数据】P4K提高：+22.16%；P4K-A13L酶活：10,471 ± 444 U/mL、+37.86%；净电荷：+3.0→+4.0（pH 7.0）；GRAVY值：1.03→1.19
3.2 通过基因组精简构建地衣芽孢杆菌DW2酶表达底盘
#### 3.2.1 大片段缺失对AprE表达的影响
过度的基因组冗余会损害基因表达和产物合成[30]。本研究基于DW2基因组测序结果，选取5个大基因片段，筛选冗余基因并研究其对AprE表达的影响（表S6）。从DM0（DW2casn9）中删除M44、M19、M28、M15和M58片段有利于AprE表达，且这些缺失对细胞生长无明显影响（图2a–b）。具体而言，M44、M15和M58分别编码参与竞争性代谢物——杆菌肽、地衣素和聚γ-谷氨酸（γ-PGA）合成的蛋白质。M19对应一个前噬菌体区域基因岛，而M28区域位于350,347–370,441位点，包含一组复杂基因（表S7）。值得注意的是，M28缺失对AprE活性的提升最为显著（图2b）。
将M44、M19、M28、M15和M58片段叠加缺失，生成衍生菌株DM1、DM2、DM3、DM4和DM5，然后将优化表达载体pHY-PykzAPrbs6-SPAprE-P4K-A13L-aprEP97-S241-P116（记为E）电转入这些菌株（图2c）。随着多个片段依次缺失，AprE活性逐渐增加，菌株DM5/E酶活达到22,295 ± 1580 U/mL，比DM0/E提高1.99倍（图2c），比DM0/E提高5.77倍。此外，DM5/E表现出更高的生物量，在TB培养基发酵24 h后，其生物量（6.49 ± 0.14）比DM0/E*（6.05 ± 0.08）高7.27%（图2c）。
随后，优选表达元件和基因组精简宿主DM5在产生碱性蛋白酶、来自枯草芽孢杆菌的纳豆激酶（NK）和来自嗜热解纤维素菌的几丁质酶（ChiT）方面表现出优异性能。首先将原始元件（启动子和信号肽）替换为优选元件组合PykzAPrbs6-SPAprE-P4K-A13L，然后所得质粒……
【数据】DM5/E酶活：22,295 ± 1580 U/mL；比DM0/E提高：1.99倍；比DM0/E提高：5.77倍；生物量：DM5/E 6.49 ± 0.14 vs DM0/E 6.05 ± 0.08（+7.27%）；发酵时间：24h（TB培养基）
讨论与解读
工业酶全球市场规模2023年估计达74.2亿美元，预计未来数年将持续增长，尤其在绿色制造、生物制药和食品行业。构建高效酶表达平台已成为关键策略[36]。当前优化方法包括密码子优化[37]、增加基因拷贝数[18]、增强表达元件[5]和分泌信号蛋白[38]等。地衣芽孢杆菌作为优良蛋白表达宿主，有望发展为可持续且稳健的细胞工厂。
本研究以AprE为报告蛋白，通过优化表达元件和细胞功能模块，在地衣芽孢杆菌DW2中系统构建了多种分泌蛋白的高效表达平台。系统发育相近微生物间密码子偏好的细微差异常被忽视[39]。本研究设计了一套鉴定限制密码子的评估方案，应用于aprE基因优化后其mRNA表达水平显著提高（图1b–c）。由于该方法尚未在其他蛋白上验证，后续研究……
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于将"元件优化—基因组精简—代谢组学指导的模块改造"串联成完整闭环。先通过密码子、启动子、信号肽三层次元件工程提升单拷贝表达效率，再用基因组精简消除竞争性代谢负担，最后以代谢组学数据精准定位氨基酸供给不足与溢流代谢两大瓶颈，逐一改造。这种"数据驱动"的宿主改造策略，比盲目叠加基因编辑更具普适性。局限在于：限制密码子影响转录的机制尚未阐明；DM6E10在5 L罐的放大表现虽亮眼，但工业级发酵的长期稳定性与成本效益仍需验证。对合成生物学而言，该工作展示了"组学数据指导的多模块协同优化"在工业酶生产中的巨大潜力。
参考来源
Zhang Q, Zhang M, Zhu Z, Ma H, Mo F. System reconstruction of Bacillus licheniformis for efficient expression of alkaline protease. Synth Syst Biotechnol. PMID: 42572607.
PMID: 42572607