来源：A Novel Indigoidine-like NRPS Gene from Arthrobacter antioxidans QL17 Enhances Oxidative Stress Resistance Through Radical Scavenging and Transcriptional Reprogramming.（Antioxidants (Basel)）| 编译：DNA Lab Space
导读
好氧代谢不可避免地产生活性氧（ROS），而过量ROS造成的氧化损伤与衰老、神经退行性疾病乃至食品变质密切相关。合成抗氧化剂虽应用广泛，但其安全性日益受到质疑。本研究从珠峰东绒布冰川来源的Arthrobacter antioxidans QL17菌株出发，通过重离子诱变、基因组挖掘、系统发育分析与异源表达等手段，鉴定出核心非核糖体肽合成酶基因MWM45_RS16760，证实其与蓝色素生物合成及过氧化氢耐受性正相关。该基因在E. coli中异源表达不仅重构蓝色素表型，还赋予宿主增强的自由基清除活性和抗氧化应激能力，并通过转录组重编程协调多条细胞通路。
研究背景
有氧代谢不可避免地产生活性氧，包括超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基。当ROS的产生超过细胞抗氧化防御能力时，氧化应激会使蛋白质羰基化、脂质过氧化并损伤DNA，这些过程在机制上与衰老、神经退行性疾病、心血管疾病和癌症相关。同样的化学反应也驱动食品、化妆品和药物制剂中的酸败和保质期损失，工业界长期以来使用丁基羟基茴香醚（BHA）、丁基羟基甲苯（BHT）和叔丁基对苯二酚（TBHQ）等合成酚类抗氧化剂应对。然而，越来越多的证据将这些添加剂与肝脏、肾脏和神经毒性以及潜在致癌性联系起来，多个司法管辖区已开始收紧其监管限制。因此，寻找更安全、可持续且机制明确的天然替代品已成为食品、生物医学和化妆品科学的研究重点。
微生物已成为满足这一需求的有吸引力的答案。与植物来源的抗氧化剂相比，微生物色素可通过规模化发酵生产，不受季节供应限制，并可通过遗传或工艺工程进行调控以满足特定规格。然而，具有抗氧化活性的水溶性蓝色微生物色素仍然稀少，其宿主水平保护机制也知之甚少。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
Arthrobacter antioxidans QL17，最初分离自珠穆朗玛峰东绒布冰川，保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC 1.2948T）和日本微生物菌种保藏中心（JCM 35246T）。本研究中使用的两个衍生菌株——色素过量产生突变株M157和色素缺陷突变株M186，通过下述碳离子照射从QL17产生。Escherichia coli BL21(DE3)（C2527H，New England Biolabs，Ipswich，MA，USA）用作异源表达宿主，pET41a(+)（V010975，NovoPro Bioscience，上海，中国）用作表达载体。
所有A. antioxidans菌株在R2A琼脂上维持，并在R2A肉汤中于15°C、160 rpm振荡培养。E. coli菌株在Luria–Bertani（LB）琼脂上维持，并在LB肉汤中于37°C、180 rpm振荡培养。卡那霉素以50 μg/mL添加用于筛选pET41a衍生转化子。甘油储备液在−80°C下保存于20%（v/v）甘油中。
【数据】培养基：R2A/LB；温度：15°C（节杆菌）/37°C（大肠杆菌）；转速：160 rpm/180 rpm；卡那霉素：50 μg/mL；甘油：20%（v/v）；保藏温度：−80°C
2.2 重离子照射与色素突变株筛选
A. antioxidans QL17的指数生长期细胞被收获，用无菌0.9%（w/v）NaCl洗涤两次，并重悬于0.9% NaCl至OD600 = 1.0。取1毫升细胞悬液，在中国科学院近代物理研究所兰州重离子研究装置（HIRFL）处以碳离子（12C6+，80 MeV/u）单次500 Gy剂量照射（剂量率，20 Gy/min）。500 Gy的照射剂量基于初步存活试验确定，该剂量下A. antioxidans QL17的菌落形成存活率约为20–30%，此范围被认为是在确保足够群体恢复以供筛选的同时最大化突变多样性的最优选择。同批次未照射的等分试样作为对照。
照射后，细胞被稀释并涂布在R2A琼脂平板上，随后在15°C下孵育7天。共挑取1056个菌落至含R2A肉汤的96深孔板中，并在15°C、160 rpm下培养3天。使用SpectraMax 190酶标仪（Molecular Devices，San Jose，CA，USA）测量各发酵液在590 nm处的吸光度，选择A590值最高和最低的突变株分别作为M157和M186。通过五次连续传代验证所选突变株的遗传稳定性。
【数据】碳离子：12C6+，80 MeV/u；照射剂量：500 Gy；剂量率：20 Gy/min；存活率：20–30%；筛选菌落数：1056；培养温度：15°C；培养时间：7天（平板）/3天（深孔板）；转速：160 rpm；检测波长：590 nm
2.3 UV-Vis光谱法色素定量
野生型、M157和M186菌株在R2A肉汤中于15°C、160 rpm培养3天。培养物以5000 rpm离心5分钟，澄清上清液用于光谱分析。取等分试样（200 μL）转移至透明96孔板中，使用SpectraMax 190酶标仪记录350至750 nm的吸收光谱。平行处理的无菌R2A培养基作为空白对照。进行三次独立生物学重复。
【数据】离心：5000 rpm，5 min；检测波长范围：350–750 nm；样品量：200 μL；生物学重复：3次
2.4 H₂O₂耐受性测定
#### 2.4.1 A. antioxidans QL17的H₂O₂耐受性测定
野生型、M157和M186菌株在R2A肉汤中于15°C、160 rpm培养至OD600 = 1.0。收获细胞，用无菌0.9% NaCl洗涤两次，并重悬于0.9% NaCl至原始OD600。将等分悬液与新鲜配制的H₂O₂在终浓度50、100、200、300、400、500和600 mM下于15°C挑战120分钟。未处理悬液接受等体积无菌0.9% NaCl。处理后，样品立即在0.9% NaCl中系列稀释，涂布于R2A琼脂，并在15°C下孵育7天。计数菌落形成单位（CFU），存活率计算为：存活率（%）= CFU处理/CFU未处理 × 100%。进行三次独立生物学重复。
【数据】H₂O₂浓度梯度：50–600 mM；处理温度：15°C；处理时间：120 min；孵育时间：7天；生物学重复：3次
#### 2.4.2 重组E. coli的H₂O₂耐受性测定
携带pET41a（空载体）或pET41a-RS16760的E. coli BL21(DE3)在LB-卡那霉素中于37°C、180 rpm过夜培养，以1:100（v/v）转接至新鲜培养基，培养至OD600 = 0.6。用200 μM IPTG在18°C诱导20小时。收获诱导细胞，用无菌0.9% NaCl洗涤两次，重悬至OD600 = 1.0。细胞悬液用终浓度0、5、10、20、30、40和50 mM的H₂O₂在18°C处理120分钟。存活细胞通过在LB-卡那霉素琼脂上于37°C孵育16小时后CFU计数定量。存活率计算如上所述。进行三次独立生物学重复。
总体H₂O₂耐受性通过在GraphPad Prism中计算存活曲线下面积（AUC）来量化。将存活率（%）对H₂O₂浓度（0–600 mM）作图，使用梯形法以Y = 0为基线计算AUC。三次生物学重复的AUC值通过单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey检验比较。
【数据】IPTG浓度：200 μM；诱导温度：18°C；诱导时间：20 h；H₂O₂浓度梯度：0–50 mM（E. coli）；处理温度：18°C；处理时间：120 min；孵育：37°C，16 h
2.5 基因组挖掘与NRPS样基因簇分析
使用antiSMASH 7.0以宽松检测严格度和默认参数预测A. antioxidans QL17基因组（GenBank登录号CP095501）中的次级代谢产物生物合成基因簇。在预测的基因簇中，选择了一个含单一核心生物合成基因MWM45_RS16760（RefSeq蛋白登录号WP_247827427.1）的NRPS样基因簇进行进一步分析。使用集成的NRPSPredictor2模块预测结构域组织和腺苷酸化结构域底物偏好。基因簇组织基于antiSMASH输出可视化并在Adobe Illustrator中精修。
【数据】基因组登录号：CP095501；蛋白登录号：WP_247827427.1；分析工具：antiSMASH 7.0、NRPSPredictor2
2.6 蛋白结构建模、结构比较与分子对接
#### 2.6.1 结构预测与结构叠加
由MWM45_RS16760编码的全长蛋白序列（1150 aa）提交至AlphaFold Server，使用默认设置进行结构预测。选择排名最高的模型用于下游分析。来自Streptomyces lavendulae的参考靛蓝素合酶BpsA（UniProt登录号Q1MWN4）的氨基酸序列使用相同流程建模。RS16760与BpsA之间的结构叠加在PyMOL中进行，结构相似性使用TM-align评估。
【数据】蛋白长度：1150 aa；BpsA来源：Streptomyces lavendulae；UniProt：Q1MWN4；建模工具：AlphaFold Server；叠加工具：PyMOL、TM-align
#### 2.6.2 与L-谷氨酰胺的分子对接
为研究A结构域对L-谷氨酰胺（L-Gln）的预测底物特异性，使用AutoDock Vina v1.2进行分子对接。MWM45_RS16760的全长AlphaFold2模型作为受体；使用BioPython（v1.83）去除蛋白质原子，使用Open Babel（v3.1）分配极性氢和Gasteiger部分电荷。L-Gln的三维结构从PubChem（CID 5961）获取并以相同方式处理。使用RDKit中的ETKDGv3算法生成构象并进行MMFF94优化。
对接搜索空间定义为25 × 25 × 25 Å的立方网格盒，中心位于坐标(−31.89, −11.42, −2.05) Å，对应于PARAS分析鉴定的底物结合口袋（残基195–315）。对接以16的穷尽度进行，每次运行生成10个独立结合姿势。为评估可重复性，使用不同随机种子（42、123和2024）独立重复对接三次。为评估底物选择性，在相同条件下对接五种额外氨基酸（L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-赖氨酸、L-丙氨酸和L-苯丙氨酸）。L-Gln与活性位点残基之间的氢键在PyMOL（v2.6）中可视化。
【数据】对接工具：AutoDock Vina v1.2；网格盒：25×25×25 Å；中心坐标：(−31.89, −11.42, −2.05) Å；穷尽度：16；随机种子：42、123、2024；额外底物：5种氨基酸
2.7 NRPS腺苷酸化结构域的系统发育分析
以RS16760蛋白为查询序列，通过BLASTp搜索NCBI非冗余蛋白数据库获取同源NRPS蛋白。使用CD-HIT去除冗余序列。使用HMMER针对Pfam AMP-binding profile（PF00501）提取保守腺苷酸化结构域。
【数据】数据库：NCBI nr；去冗余工具：CD-HIT；结构域提取：HMMER/PF00501
研究结果
3.1 蓝色素产生与*A. antioxidans* QL17的氧化应激耐受性正相关
为研究A. antioxidans QL17的蓝色素产生是否与氧化应激抗性相关，通过重离子照射（碳离子，12C6+，80 MeV/u）获得两个色素改变突变株，并从1056个突变菌落中基于590 nm吸光度筛选。突变株M157表现出显著增强的蓝色素沉着，而突变株M186在R2A琼脂上完全丧失蓝色表型（图1A），为后续功能比较提供了色素表型对比鲜明的菌株组合。
发酵液的UV-Vis吸收光谱（350–750 nm）进一步证实了这些差异。野生型和M157均在590 nm处表现出明确的吸收最大值，与靛蓝素型蓝色素的特征吸收峰一致。M157在590 nm处的吸光度约为野生型的1.5倍。相比之下，M186在整个可见光范围内保持在基线附近，在590 nm处未检测到明显吸收峰（图1B）。590 nm的筛选波长对应靛蓝素型蓝色素在水溶液中的特征吸收最大值，这是多种细菌产生者中一致报道的诊断特征。野生型和M157间光谱轮廓的一致性（λmax = 590 nm），通过全UV-Vis扫描确认，表明基于A590的筛选反映的是色素浓度的差异而非发色团身份的改变。
随后在50–600 mM范围内评估三株菌的H₂O₂耐受性。在50–250 mM时，三株菌均保持约55%以上的存活率，但随着氧化剂浓度升高，菌株依赖性差异变得越来越明显。M186在300 mM时表现出显著的活力丧失，在≥400 mM时无检测到的存活；而野生型在400 mM时保持可观的活力，但在500–600 mM时无检测到的存活。相比之下，M157在500 mM时维持60%存活率，在600 mM（测试的最高浓度）时维持15–17%存活率（图1C）。为量化每株菌的总体氧化应激耐受性，通过对完整H₂O₂浓度范围（0–600 mM）的存活率积分计算存活曲线下面积（AUC，%·mM）。单因素方差分析后进行Tukey事后检验显示，三株菌的AUC值差异显著（所有配对比较p < 0.001），排序为M157 > 野生型 > M186（图1D）。此排序与色素产量排序完全一致，为A. antioxidans QL17中蓝色素产生与氧化应激耐受性之间的正关联提供了定量统计支持。这些发现促使我们研究色素生物合成的遗传基础。
【数据】筛选菌落数：1056；A590比值：M157约为野生型1.5倍；H₂O₂浓度范围：50–600 mM；M157存活率：500 mM时60%，600 mM时15–17%；M186存活：≥400 mM无检测；野生型存活：400 mM可检测，500–600 mM无检测；AUC统计：所有配对p < 0.001（one-way ANOVA + Tukey）
3.2 基因组挖掘与结构分析支持MWM45_RS16760为*A. antioxidans* QL17中的候选靛蓝素样NRPS
为探索蓝色素生物合成的遗传基础，使用antiSMASH 7.0分析A. antioxidans QL17的全基因组序列。鉴定出一个非核糖体肽合成酶（NRPS）样生物合成基因簇，命名为Cluster 7，其中MWM45_RS16760是唯一被注释为核心生物合成酶的基因（图2A）。集成NRPSPredictor2模块的结构域架构预测揭示了经典的A-PCP-TE模块化组织，其中腺苷酸化（A）结构域（跨越aa 14-412）被预测识别L-谷氨酰胺（L-Gln）为最可能底物（图2B），与靛蓝素合酶报道的底物偏好一致。
随后进行RT-qPCR分析，检查MWM45_RS16760的转录水平是否与三株菌的色素表型相关。相对于野生型，M157中MWM45_RS16760转录本丰度显著升高（p < 0.05），而M186中未检测到转录本（图2C），与RS16760基因座处或上游的基因失活突变一致；该基因组改变的确切性质（如启动子破坏、基因缺失或结构重排）有待对突变株进行全基因组重测序表征。该表达模式与图1中观察到的色素产量模式一致，提供了将MWM45_RS16760与蓝色素产生联系起来的独立转录证据。
为进一步评估MWM45_RS16760作为靛蓝素样NRPS的结构合理性，使用AlphaFold2（pTM = 0.62）预测其三维结构，产生了包含A、PCP和TE结构域的合理多结构域架构（图2D）。与来自Streptomyces lavendulae的参考靛蓝素合酶BpsA的结构叠加揭示了保守的NRPS催化核心（TM-score = 0.659，RMSD = 5.536 Å），而MWM45_RS16760包含BpsA中不存在的额外插入区域，提示结构分化（图2E）。L-Gln对接入A结构域口袋，通过三次独立重复运行验证（ΔG = −5.858 ± 0.014 kcal/mol，n = 3；补充表S2），获得最优结合自由能ΔG = −5.866 kcal/mol，底物与Thr198、Gln245和Gly272之间形成四个极性接触（图2F）。五种额外氨基酸的比较对接证实，L-Gln实现了最高数量的口袋特异性接触，且结合亲和力显著优于其最接近的结构类似物L-谷氨酸（ΔG = −5.720 ± 0.020 kcal/mol；Welch's t检验，p = 0.001；补充表S2），与A结构域预测的L-Gln偏好一致。综合来看，这些结果支持MWM45_RS16760是与A. antioxidans QL17中蓝色素生物合成相关的强候选靛蓝素样NRPS，并证明其直接功能验证的合理性。
【数据】pTM = 0.62；TM-score = 0.659；RMSD = 5.536 Å；L-Gln结合自由能：ΔG = −5.866 kcal/mol（三次重复均值−5.858 ± 0.014 kcal/mol）；L-谷氨酸：ΔG = −5.720 ± 0.020 kcal/mol；Welch's t检验p = 0.001；极性接触残基：Thr198、Gln245、Gly272；M157转录水平：p < 0.05
3.3 腺苷酸化结构域系统发育将MWM45_RS16760置于独特的放线菌相关靛蓝素样谱系中
为将MWM45_RS16760置于进化背景下，使用MWM45_RS16760的腺苷酸化（A）结构域序列、从NCBI非冗余蛋白数据库获取的370个细菌同源物以及两个充分表征的参考靛蓝素合酶——来自Streptomyces lavendulae的BpsA和来自Dickeya fangzhongdai的IndC——重建了最大似然系统发育树（图3）。完整树见补充图S1。
系统发育恢复了几个与分类学归属大致一致的充分支持的分支。BpsA归入Streptomyces主导的分支（放线菌门），而IndC归入Dickeya主导的分支（假单胞菌门），与其已知的分类学来源一致。MWM45_RS16760的A结构域与来自Pseudarthrobacter spp.（菌株TMN-17和NKDBFgelt）的同源物聚集在一个强支持的放线菌相关分支中（UFBoot = 100），该分支与含BpsA的Streptomyces分支和含IndC的Dickeya分支明显分离。
该分支进一步嵌套在以Nocardia spp.和放线菌门其他成员为主的更广泛类群中，表明MWM45_RS16760及其最近同源物形成一个与BpsA和IndC谱系相关但分离的独特放线菌相关谱系。据我们所知，尚未有实验表征的靛蓝素合酶从该Pseudarthrobacter/Arthrobacter相关分支中报道，表明该谱系在功能上仍未充分探索。
综合来看，这些结果将MWM45_RS16760的A结构域置于一个独特的放线菌相关靛蓝素样谱系中，为其后续功能表征提供了进化框架。
【数据】同源物数量：370；参考合酶：BpsA（S. lavendulae）、IndC（D. fangzhongdai）；UFBoot = 100；最近同源物：Pseudarthrobacter spp. TMN-17、NKDBFgelt
3.4 异源表达重构蓝色素生物合成并赋予增强的H₂O₂耐受性和自由基清除活性
为直接验证MWM45_RS16760在蓝色素生物合成中的功能，将该基因克隆至pET41a(+)载体，构建重组质粒pET41a-RS16760（8815 bp），并在E. coli BL21(DE3)中异源表达（图4A）。空载体对照E. coli pET41a作为平行对照。经200 μM IPTG在18°C诱导20小时后，E. coli pET41a-RS16760的细胞沉淀和培养上清液均呈现明显蓝色，而空载体对照未观察到色素产生（图4A），表明MWM45_RS16760单独足以在异源宿主中重构蓝色素生物合成。
随后评估了重组菌株的H₂O₂耐受性。在0–50 mM H₂O₂浓度范围内，E. coli pET41a-RS16760在多个浓度点表现出显著高于空载体对照的存活率（图4B），表明异源表达MWM45_RS16760赋予E. coli增强的氧化应激耐受性。
进一步测定了培养上清液的自由基清除活性。在DPPH和ABTS两种测定中，E. coli pET41a-RS16760的培养上清液均表现出显著高于空载体对照的自由基清除活性（图4C、D），表明异源表达产生的蓝色素具有胞外自由基清除能力。所有测定均进行三次独立生物学重复，统计显著性通过Student's t检验评估（** p < 0.01）。
【数据】质粒大小：8815 bp；IPTG：200 μM；诱导：18°C，20 h；H₂O₂范围：0–50 mM；统计：Student's t检验，** p < 0.01
3.5 比较转录组学揭示*E. coli*异源表达MWM45_RS16760后的四管齐下转录重编程
为阐明MWM45_RS16760异源表达增强氧化应激耐受性的分子机制，对E. coli pET41a-RS16760和空载体对照E. coli pET41a进行了比较转录组学分析（图5A）。差异表达基因（DEGs）的鉴定阈值为|log₂倍数变化| ≥ 1且调整后p值 ≤ 0.05。火山图显示，异源表达导致大量基因表达变化，涉及多个功能类别。
热图展示了27个代表性DEGs，分为五个功能模块：氧化应激反应（绿色）、热休克/蛋白质稳态（蓝色）、Gln代谢（紫色）、Trp生物合成（橙色）和鞭毛组装（红色）（图5B）。每列代表E. coli pET41a（对照，左）和E. coli pET41a-RS16760（RS16760，右）的三个独立生物学重复。
基因本体论（GO）富集分析分别对上调（图5C）和下调（图5D）DEGs进行，涵盖生物学过程、分子功能和细胞组分本体论。KEGG通路富集分析仅对下调DEGs产生显著结果；上调DEGs在这些标准下未产生统计学显著的KEGG通路富集，因此未显示（图5E）。基因根据其主要注释功能分配到功能模块；部分基因（如dnaK，同时参与蛋白质折叠和应激耐受）参与多种细胞过程，其模块分配反映本研究中讨论的主要功能背景。
【数据】DEG阈值：|log₂FC| ≥ 1，调整后p ≤ 0.05；代表性DEGs：27个；功能模块：5个；生物学重复：3次
讨论与解读
具有已证实抗氧化活性的水溶性蓝色微生物色素仍是相对匮乏的类别，大多数色素介导保护机制的研究集中在无细胞自由基清除化学而非宿主水平转录反应上。本研究结合重离子诱变、比较基因组学、系统发育定位、异源重构和比较转录组学，将MWM45_RS16760鉴定为冰川来源菌株A. antioxidans QL17中的候选靛蓝素样NRPS。数据显示，在野生型和两个色素改变衍生株中，蓝色素产量与H₂O₂耐受性相关联；将该基因转移至E. coli后，该基因单独足以重构色素表型，并与异源宿主中增强的氧化应激耐受性相关。这些观察与双重层级保护模式一致，该模式可能结合了直接的胞外自由基清除与宿主协调的转录重编程。
已表征靛蓝素合成酶的经典架构包含单个A-Ox-PCP-TE模块，其中Ox结构域安装定义发色团的共轭双键。Pang等人通过体外重构和定点突变表明，BpsA的Ox结构域使用Tyr665作为通用碱基去质子化PCP连接的L-谷氨酰胺中间体，并提出了两条平行成熟途径。本研究中鉴定的MWM45_RS16760缺乏Ox结构域，但其异源表达仍能重构蓝色素产生，提示可能存在替代的氧化成熟机制或宿主内源氧化酶的参与，这一结构-功能差异值得进一步探究。
编译者解读
本研究的一个突出亮点是将"基因型-表型-机制"三层证据链完整打通：从重离子诱变筛选出色素差异菌株，到基因组挖掘锁定单一候选基因，再到异源表达验证功能并辅以转录组解析宿主响应，逻辑链条严谨。值得关注的是，该NRPS缺乏经典靛蓝素合酶中的Ox结构域却仍能产生蓝色素，这提示自然界中可能存在更简化的靛蓝素生物合成范式，对合成生物学中"最小功能模块"设计具有启发意义。不过，M186中该基因失活的确切基因组改变尚未阐明，且该基因在天然宿主中调控网络及异源宿主中转录重编程的上游信号仍需进一步研究。从应用角度看，该基因可作为构建抗氧化蓝色素微生物细胞工厂的功能元件，其异源表达赋予宿主多重保护效应的特性也为工业菌株的抗逆改造提供了新思路。
参考来源
Yu X, Wu Y, Zhang W, Zhang G, Wu S. A Novel Indigoidine-like NRPS Gene from Arthrobacter antioxidans QL17 Enhances Oxidative Stress Resistance Through Radical Scavenging and Transcriptional Reprogramming. Antioxidants (Basel). PMID: 42510577.
PMID: 42510577