产地衣素的地衣芽孢杆菌YC7代谢物与全基因组分析

来源：Metabolites and Whole-Genome Analysis of the Lichenysin-Producing Bacillus licheniformis YC7.（Foods）| 编译：DNA Lab Space

📎 相关工具：代谢通路设计

导读

地衣素是一种高性能、环境友好的生物表面活性剂，兼具抗菌活性和风味调节功能。本研究从白酒大曲和黄水中筛选到一株高产表面活性剂的地衣芽孢杆菌YC7，通过串联质谱确认其发酵产物含多种地衣素同系物，GC-MS检测到35种挥发性风味化合物，全基因组测序揭示其基因组大小为4.31 Mb，含4590个蛋白编码基因。研究证实YC7兼具产生物表面活性剂和风味物质的双重潜力。

研究背景

地衣芽孢杆菌是一种革兰氏阳性、产芽孢的兼性厌氧细菌，广泛分布于土壤、发酵体系及动植物微生态环境中。该菌具有强抗逆性和良好的生物安全性，已被美国食品药品监督管理局认定为安全菌株。地衣芽孢杆菌在发酵过程中可合成多种功能性代谢产物，如抗菌物质（细菌素、脂肽、抗生素）、工业酶类（淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶）及生物高分子材料，广泛应用于工业生产、食品酿造、生物医药和环境治理等领域。

地衣素是由地衣芽孢杆菌通过非核糖体肽合成酶途径合成的环状脂肽类生物表面活性剂。其结构特征为七肽环的N端连接一条β-羟基脂肪酸链，与表面活性素高度同源，但由于肽环第一位点谷氨酸被谷氨酰胺替代而具有独特的理化性质。在白酒固态发酵过程中，地衣素在抑制有害微生物和稳定品质方面发挥关键作用。

研究方法

2.1 芽孢杆菌的分离与培养

采集两个独立批次的大曲，每批次根据储存堆中不同位置取样。将收集的大曲粉碎并混合均匀以供后续研究。称取5 g混合大曲样品，加入45 mL无菌生理盐水，在37°C、180 r/min条件下富集30 min，然后在85°C水浴中处理15 min。取10 mL水浴处理后的液体加入100 mL LB液体培养基中，于37°C、180 r/min培养24 h获得富集液。

取20 mL黄水（白酒酿造副产物），5000 rpm离心10 min。取10 mL上清液，用无菌水稀释至50 mL，然后在85°C水浴中孵育15 min。取10 mL该液体接种至100 mL LB液体培养基（10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl，pH 7.0，121°C灭菌20 min），于37°C、180 r/min培养24 h获得富集液。

用无菌水对富集液进行梯度稀释（大曲富集液稀释度：10⁻⁵、10⁻⁶、10⁻⁷；黄水富集液稀释度：10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵），然后涂布于LB琼脂平板上，37°C静置培养24 h。挑取形态不同的单菌落进行划线纯化，重复多次直至获得纯菌株。所有纯化的单菌落通过16S rDNA测序，使用通用细菌引物对27F/1492R进行分类学鉴定。对目标菌株YC7额外进行全基因组测序以重新确认其物种分类。分离菌株编号并保存备用。

【数据】样品量：5 g大曲；富集条件：37°C、180 r/min、30 min；水浴处理：85°C、15 min；黄水用量：20 mL；离心：5000 rpm、10 min；LB培养基成分：10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl、pH 7.0、121°C灭菌20 min；稀释度：大曲10⁻⁵–10⁻⁷、黄水10⁻³–10⁻⁵；培养条件：37°C、24 h

2.2 排油圈实验

采用排油圈法检测分离菌株在液体发酵中产生生物表面活性剂的能力。首先制备液体发酵液：将待测菌株接种至100 mL LB液体培养基中，于37°C、180 r/min培养至600 nm光密度（OD600）达到0.8–1.0获得种子培养液。然后将种子培养液以3%（v/v）接种量接种至发酵培养基（20 g葡萄糖、15 g大豆胰蛋白胨、2 g KH₂PO₄、0.5 g MgSO₄·7H₂O、0.01 g FeSO₄·7H₂O溶于1 L蒸馏水，pH 7.0，121°C灭菌20 min），于37°C、200 r/min培养72 h。发酵结束后，发酵液在4°C、10,000 r/min离心40 min，收集上清液备用。

排油圈实验按照Lyu等人报道的方法进行。具体操作：向直径9 cm的培养皿中加入30 mL去离子水，然后加入1 mL油红溶液。体系在室温下静置5 min。油膜均匀铺展后，向中心加入2.5 μL待测菌株的发酵上清液。静置10 min待排油圈大小稳定后测量其直径。所有实验设三次重复，并设置匹配的阳性和阴性对照。经质谱确认产地衣素的菌株YC7作为生物表面活性剂产生的阳性对照，而一株来源于发酵大豆、无表面活性和排油能力的地衣副芽孢杆菌（本实验室分离保藏）作为阴性对照。

【数据】种子培养：37°C、180 r/min、OD600 0.8–1.0；接种量：3%（v/v）；发酵条件：37°C、200 r/min、72 h；离心：4°C、10,000 r/min、40 min；发酵培养基成分：20 g葡萄糖、15 g大豆胰蛋白胨、2 g KH₂PO₄、0.5 g MgSO₄·7H₂O、0.01 g FeSO₄·7H₂O、pH 7.0、121°C灭菌20 min；排油圈实验：30 mL去离子水、1 mL油红溶液、室温静置5 min、2.5 μL上清液、静置10 min

2.3 串联质谱检测

采用串联质谱方法定性鉴定菌株YC7液体发酵产物中生物表面活性剂的类型。首先对发酵液进行前处理：发酵液在4°C、8000 r/min离心20 min，收集上清液。用6 mol/L HCl溶液将上清液pH调至2.0，4°C静置过夜。沉淀在8000 r/min离心20 min后收集，用30 mL甲醇提取三次，每次提取在4°C进行4 h。收集提取液并通过0.22 μm微孔滤膜过滤。处理后的样品用于串联质谱分析，检测条件设置为DP 167 V、EP 6.9 V、CE 40 V，注射泵流速0.07 mL/min。一级质谱扫描范围为100–1100 Da，二级质谱扫描范围为100–1000 Da。

液相色谱-串联质谱分析在QTRAP 6500三重四极杆质谱仪上进行。仪器配备Turbo Spray电喷雾离子源，正离子模式下运行，匹配三重四极杆质量分析器。反相色谱分离采用二元流动相系统：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的甲醇。进样量5 μL，线性梯度洗脱，恒定流速0.3 mL/min。地衣素生物表面活性剂的化合物鉴定通过将MS/MS碎片谱与Metlin脂肽数据库和NCBI PubChem化合物谱库匹配，并结合已发表的地衣素同系物参考二级质谱图实现。质量误差低于5 ppm且片段匹配分数超过80的峰被确定为目标地衣素类似物。

【数据】前处理离心：4°C、8000 r/min、20 min；pH调节：6 mol/L HCl调至pH 2.0、4°C过夜；甲醇提取：30 mL×3次、4°C、4 h/次；过滤：0.22 μm微孔膜；质谱参数：DP 167 V、EP 6.9 V、CE 40 V、流速0.07 mL/min；一级扫描：100–1100 Da；二级扫描：100–1000 Da；进样量：5 μL；流速：0.3 mL/min；鉴定标准：质量误差<5 ppm、匹配分数>80

2.4 GC-MS挥发性代谢物分析

将菌株YC7接种至LB液体培养基中，在摇床上37°C、120 r/min培养1天制备种子培养液。然后将种子培养液以10%（v/w，种子液/小麦基质）的接种量接种至小麦固态发酵培养基中，静置培养5天。培养温度每24 h逐步升高，依次为35°C、40°C、45°C、50°C和55°C。对照组加入等体积无菌空白LB液体培养基，不接种菌株，其余发酵条件完全相同。

准确称取15.0 g发酵固体样品，转移至50 mL顶空瓶中。样品在60°C水浴中加热15 min，然后顶空吸附30 min后进行GC-MS分析。整体检测程序按照Zhang等人报道的方法进行，选择2-乙基丁酸作为内标，用于挥发性化合物的半定量计算。

详细仪器参数按照Liu等人报道的方法设置。采用DB-WAX毛细管柱（60 m × 250 µm，0.25 µm）；进样口温度230°C，程序升温从40°C至230°C。MS扫描范围20–500 u，电子能量70 eV，离子源和传输线温度均为230°C。定性鉴定和半定量分析：所有挥发性风味化合物通过将其质谱图与NIST标准质谱库匹配进行鉴定。光谱相似度评分高于80%的化合物被认为是可靠的目标物质。半定量分析基于各目标化合物与内标（2-乙基丁酸）的峰面积比，计算各挥发性组分的绝对含量。

【数据】种子培养：37°C、120 r/min、1天；接种量：10%（v/w）；发酵时间：5天；温度程序：35°C→40°C→45°C→50°C→55°C，每24 h升温；样品量：15.0 g；水浴：60°C、15 min；顶空吸附：30 min；色谱柱：DB-WAX 60 m × 250 µm × 0.25 µm；进样口温度：230°C；MS扫描：20–500 u、70 eV；离子源/传输线温度：230°C；内标：2-乙基丁酸；鉴定标准：相似度>80%

2.5 全基因组测序与组装

将培养至对数期的菌株YC7在4°C、10,000 rpm离心10 min收集菌体。加入适量1×PBS缓冲液洗涤菌体，随后进行全基因组测序。测序完成后，对原始数据进行质量控制和组装，获得菌株YC7的完整基因组序列。

【数据】离心：4°C、10,000 rpm、10 min；洗涤缓冲液：1×PBS

2.6 生物信息学分析

对菌株YC7的基因组进行基因预测和功能注释。将预测的蛋白编码基因序列与多个公共数据库进行比对注释，包括GO、KEGG、COG、CAZy、NR、Rebase、VFDB和CARD数据库。使用antiSMASH预测次级代谢产物合成基因簇，并通过基因组与代谢组联合分析，解析地衣素合成和风味代谢相关的关键基因与代谢通路。

【数据】注释数据库：GO、KEGG、COG、CAZy、NR、Rebase、VFDB、CARD；基因簇预测工具：antiSMASH

研究结果

3.1 产生物表面活性剂菌株的筛选

地衣芽孢杆菌是产生地衣素的主要微生物资源。本研究从白酒酿造过程中的核心糖化发酵剂大曲和副产物黄水中分离到4株芽孢杆菌，编号分别为：D1（来源于大曲）、H4、H6和H7（来源于黄水），菌落形态如图1A所示。通过排油圈实验初步测定了上述菌株（包括本实验室已保藏的地衣芽孢杆菌YC7菌株）产生物表面活性剂的能力。结果显示，4株菌具有排油活性，其中两株（YC7和H6）的排油圈直径大于30 mm（图1B）。菌株YC7的排油圈直径最大，达到42 mm，显著大于其他菌株，表明菌株YC7具有较强的产生物表面活性剂能力。因此，选择YC7作为后续实验的目标菌株。

【数据】分离菌株数：4株（D1、H4、H6、H7）；排油圈直径>30 mm的菌株：2株（YC7、H6）；YC7排油圈直径：42 mm

3.2 串联质谱分析

为鉴定具有强排油能力的菌株YC7产生的生物表面活性剂类型，对其液体发酵产物进行串联质谱分析。菌株YC7的全扫描质谱图显示，在m/z 1007.4、1021.5、1035.5和1049.5处出现推定的地衣素同系物质子化峰（图2）。对应的[M+Na]⁺和[M-H+2Na]⁺离子分别出现在m/z 1029.4、1043.5、1057.6、1071.5和1051.4、1065.6、1079.5、1083.5处。m/z 1015.4的离子峰是993.4对应的[M+Na]⁺峰。这些初步质谱信号提示菌株YC7的发酵液中可能存在推定的地衣素类似物。因此，对m/z 1007.4、1021.5、1035.5和1049.5的离子进行MS/MS分析以表征主要组分的结构。

MS/MS谱图显示m/z 1007.4、1021.5和1035.5具有强烈的b和y系列离子（图3）。一些片段对相差18 Da，对应脂肽开环过程中的脱水，例如m/z 323和341.3处的b₂离子，m/z 667.3和685.3处的y₆离子。m/z 685.3/685.1处最具特征的峰代表丢失脂肪酸链和第一个氨基酸残基并加上一个H₂O分子后的线性化肽部分。

在图3A中，m/z 323处的离子被归属为[C13-OH-Gln+H⁺−H₂O]。基于b₂–b₇和y₃–y₇离子，该脂肽被鉴定为具有C13脂肪酸链和氨基酸序列C13-Gln-Leu/Ile-Leu-Val-Asp-Leu-Leu/Ile的地衣素，与地衣素A、B或C亚型的结构特征一致。类似地，在图3B中，基于y₃–₇和b₂–₇的离子峰特征，以及m/z 337.3和685.1处突出的特征峰，可以推断其属于地衣素A、B或C的同系物，结构为C14-Gln-Leu/Ile-Leu-Val-Asp-Leu-Leu/Ile。此外，还有一组特征碎片离子a₂–₇和m/z 671.1的x₆。x₆的产生是由于第7位Val发生双氢转移裂解，生成特征碎片离子。因此，初步推断该峰可能对应携带C15脂肪酸链的推定地衣素D/G同系物，推测的肽序列为C15-Gln-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Val。图3C显示m/z 685.1处的特征碎片离子。该片段与m/z 1021.4处的离子具有共同的结构特征，被归属为第7位氨基酸为Leu或Ile的推定地衣素同系物。推测其可能序列为C15-Gln-Leu/Ile-Leu-Val-Asp-Leu-Leu/Ile，可归类为推定的地衣素A/B/C亚型。m/z 1049.5离子的MS/MS谱图如图3D所示。其主要碎片峰m/z 699.1匹配带一个水加合物的甲基化y₆离子，表明C端残基最可能是Leu或Ile，与推定地衣素A/B/C变体的特征一致。根据a₅、a₆和a₇片段，其候选序列可推定为C15-Gln-Leu/Ile-Leu-Val-mAsp-Leu-Leu/Ile。然而，a型碎片离子的覆盖范围有限，降低了该结构归属的置信度。

【数据】一级质谱峰：m/z 1007.4、1021.5、1035.5、1049.5；[M+Na]⁺峰：m/z 1029.4、1043.5、1057.6、1071.5；[M-H+2Na]⁺峰：m/z 1051.4、1065.6、1079.5、1083.5；特征峰：m/z 685.3/685.1、m/z 323、m/z 337.3、m/z 671.1、m/z 699.1；脂肪酸链长度：C13–C15

3.3 菌株YC7挥发性代谢物检测

为探究菌株YC7通过固态发酵产生挥发性物质的潜力，将菌株YC7接种至小麦固态培养基中发酵，并使用GC-MS分析其发酵产物中挥发性物质的种类和含量。菌株YC7产生的挥发性代谢物代表性总离子流图见图S1。菌株YC7固态发酵产物中挥发性化合物的种类和产量见表1。

含量最丰富的是含氮化合物，总含量为35.72 ng/g，包括2,5-二甲基吡嗪（16.72 ± 1.57 ng/g）、2,3,5,6-四甲基吡嗪（10.67 ± 1.06 ng/g）和2,3,5-三甲基吡嗪（8.33 ± 1.05 ng/g）。其次，醇类物质含量相对较高，总含量为19.3 ng/g，其中2,3-丁二醇含量最高，达到11.13 ± 0.89 ng/g。此外，酮类化合物含量也相对较高，总计17.17 ng/g，含量最高的酮类是3-羟基-2-丁酮（即乙偶姻），含量为11.79 ± 0.95 ng/g。酸性化合物也占一定比例，总含量16.29 ng/g，其中异丁酸含量相对丰富（15.05 ± 1.27 ng/g）。在酚类香气物质中，愈创木酚含量为5.33 ± 0.64 ng/g，4-叔丁基苯酚含量为3.54 ± 0.46 ng/g。菌株YC7的固态发酵产物中还含有羧酸、酯类和硅烷类等多种挥发性香气物质。

【数据】含氮化合物总量：35.72 ng/g；2,5-二甲基吡嗪：16.72 ± 1.57 ng/g；2,3,5,6-四甲基吡嗪：10.67 ± 1.06 ng/g；2,3,5-三甲基吡嗪：8.33 ± 1.05 ng/g；醇类总量：19.3 ng/g；2,3-丁二醇：11.13 ± 0.89 ng/g；酮类总量：17.17 ng/g；乙偶姻：11.79 ± 0.95 ng/g；酸类总量：16.29 ng/g；异丁酸：15.05 ± 1.27 ng/g；愈创木酚：5.33 ± 0.64 ng/g；4-叔丁基苯酚：3.54 ± 0.46 ng/g

3.4 菌株YC7基因组组成

为阐明菌株YC7地衣素生物合成和风味代谢的分子调控机制，进行了全基因组测序。测序和组装后，获得了菌株YC7的完整基因组序列（图4）。菌株YC7的全长基因组为4,305,115 bp，含4590个蛋白编码基因，GC含量为45.93%。共鉴定到212个非编码RNA，包括8个5S rRNA、8个16S rRNA、8个23S rRNA、83个tRNA和105个ncRNA。

【数据】基因组大小：4,305,115 bp；蛋白编码基因：4590个；GC含量：45.93%；非编码RNA：212个（8个5S rRNA、8个16S rRNA、8个23S rRNA、83个tRNA、105个ncRNA）

3.5 菌株YC7基因功能注释

为揭示菌株YC7的代谢特征、环境适应机制和潜在生理功能，本研究将所有预测的蛋白编码基因序列与多个公共数据库进行比对注释。结果显示，分别在GO、KEGG、COG、CAZy、NR、Rebase、VFDB和CARD数据库中注释到6866、4223、4100、172、4564、182、36和54个基因。

【数据】GO注释：6866个基因；KEGG注释：4223个基因；COG注释：4100个基因；CAZy注释：172个基因；NR注释：4564个基因；Rebase注释：182个基因；VFDB注释：36个基因；CARD注释：54个基因

#### 3.5.1 GO注释

GO注释从生物学过程、细胞组分和分子功能三个维度分析菌株YC7的相关功能基因。结果显示，菌株YC7共有6866个基因在GO数据库中被注释，其中生物学过程、分子功能和细胞组分分别注释到3536、2334和996个功能基因（图5）。在生物学过程中，有43个基因与高潜力挥发性风味/次级代谢物的合成相关，包括18个挥发性化合物合成核心酶、9个转氨酶活性基因和4个支链氨基酸生物合成基因。此外，34个基因与非核糖体肽合成和修饰相关，92个基因与转运和分泌相关，155个基因与水解相关。

【数据】GO注释总数：6866个；生物学过程：3536个；分子功能：2334个；细胞组分：996个；风味/次级代谢物合成相关基因：43个（18个核心酶、9个转氨酶、4个支链氨基酸生物合成）；非核糖体肽合成相关基因：34个；转运分泌相关基因：92个；水解相关基因：155个

#### 3.5.2 KEGG注释

KEGG数据库注释结果如图6所示，菌株YC7的基因组在KEGG数据库中共注释到4223个基因，这些基因参与了多种代谢通路，包括碳水化合物代谢、氨基酸代谢、脂质代谢以及次级代谢产物的生物合成等。其中与地衣素合成前体供应相关的氨基酸代谢通路基因和与风味化合物合成相关的代谢通路基因均得到了注释。

【数据】KEGG注释基因数：4223个；涉及通路：碳水化合物代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、次级代谢产物生物合成

#### 3.5.3 COG和CAZy注释

COG数据库注释结果如图7A所示，菌株YC7的基因组在COG数据库中共注释到4100个基因，其中与氨基酸和碳水化合物代谢相关的基因丰度较高。CAZy数据库注释结果如图7B所示，共注释到172个基因，包括糖苷水解酶、糖基转移酶、多糖裂解酶和碳水化合物酯酶等各类碳水化合物活性酶。

【数据】COG注释基因数：4100个；CAZy注释基因数：172个

#### 3.5.4 Rebase数据库注释

Rebase数据库注释结果如图8所示，菌株YC7的基因组在Rebase数据库中共注释到182个基因，包括限制性修饰系统相关基因和甲基转移酶基因等。该分类统计图是根据生物信息学分析软件输出的Rebase注释数据人工绘制的。

【数据】Rebase注释基因数：182个

#### 3.5.5 次级代谢产物合成基因簇预测

通过antiSMASH预测，菌株YC7的基因组中含有10个次级代谢产物合成基因簇，其中包含完整的地衣素合成基因簇。预测发现Region 1是100%匹配的地衣素NRPS生物合成基因簇，包含licA、licB、licC和licD等关键生物合成模块，这是其稳定合成地衣素的核心遗传基础。

【数据】次级代谢产物合成基因簇：10个；地衣素合成基因簇匹配度：100%；关键基因：licA、licB、licC、licD

3.6 地衣素生物合成途径分析

基于菌株YC7的全基因组注释数据和代谢组学分析结果，结合已发表的代谢机制参考文献，绘制了地衣素生物合成途径总览图（图9）。该途径涉及非核糖体肽合成酶（NRPS）催化的多步反应，包括脂肪酸链的合成和延伸、七肽环的组装以及最终产物的释放和修饰。

【数据】地衣素生物合成途径：NRPS途径；脂肪酸链长度：C13–C15

3.7 主要挥发性化合物生物合成途径分析

根据菌株YC7的全基因组注释数据和代谢组学分析结果，结合已发表的参考文献，人工绘制了菌株YC7中主要挥发性化合物的生物合成途径示意图（图10）。该途径展示了吡嗪类化合物、乙偶姻和2,3-丁二醇等主要挥发性风味物质的合成路径，包括底物来源、关键酶催化步骤和代谢分支点。

【数据】主要挥发性化合物：吡嗪类、乙偶姻、2,3-丁二醇；合成途径来源：全基因组注释+代谢组学+参考文献

讨论与解读

地衣芽孢杆菌可通过非核糖体肽合成酶催化合成地衣素等脂肽类物质。排油圈实验显示菌株YC7比其他测试菌株表现出更好的表面活性（图1）。串联质谱进一步证实其可产生脂肪酸链长度为C13至C15的地衣素同系物A、B、C和D（图3），产物谱与已报道的地衣芽孢杆菌地衣素谱高度吻合，确认YC7是稳定的地衣素产生菌。然而，MS/MS无法区分质量相同的亮氨酸和异亮氨酸残基，限制了对地衣素亚型的确定性测序。解决这些模糊之处需要未来整合高分辨率色谱或氨基酸分析。

全基因组分析发现菌株YC7含有完整的地衣素合成基因簇，antiSMASH预测Region 1是100%匹配的地衣素NRPS生物合成基因簇，包含licA、licB、licC和licD等关键生物合成模块，这是其稳定合成地衣素的核心遗传基础。同时，COG注释显示与氨基酸和碳水化合物代谢相关的基因丰度较高，以及comA、abrB和degU等群体感应调控基因，共同构建了前体供应和表达调控网络。

编译者解读

本研究以"菌株筛选—代谢物鉴定—基因组解析"为主线，将一株白酒来源的地衣芽孢杆菌从表型到基因型做了系统刻画。方法选择上，排油圈实验与串联质谱联用实现了表面活性剂产生菌的快速筛选和产物结构确认，而全基因组测序与antiSMASH预测则为地衣素合成提供了遗传学证据。值得肯定的是，GC-MS风味分析拓展了该菌株在食品酿造中"一菌双用"的应用想象——既能产表面活性剂抑菌稳质，又能贡献吡嗪类风味物质。局限在于MS/MS对Leu/Ile同分异构体的区分能力不足，且挥发性物质半定量仅依赖单一内标，后续可引入高分辨质谱和稳定同位素示踪加以精化。

参考来源

Liu X, Tang Z, Li H, He W, Chen Y. Metabolites and Whole-Genome Analysis of the Lichenysin-Producing Bacillus licheniformis YC7. Foods. PMID: 42511294.

PMID: 42511294