来源：Production of Thermostable Xylanase by Myceliophthora heterothallica in Solid-State Culture Using Agro-Industrial Residues.（J Fungi (Basel)）| 编译：DNA Lab Space
导读
木聚糖酶是降解半纤维素主要成分木聚糖的关键酶，在食品、饲料、造纸及生物燃料等领域应用广泛。本研究利用甘蔗渣、甘蔗秸秆和麦麸等农工废弃物，通过固态发酵培养嗜热真菌 Myceliophthora heterothallica，系统优化了产酶条件，获得了一种在宽pH范围和高湿条件下具有优异稳定性的耐热木聚糖酶。该酶最适温度达65°C，在60°C以下保温1小时酶活完全稳定，展现出良好的工业应用潜力。
研究背景
农工废弃物和可再生生物质的利用是构建生物经济多个部门的基础，食品、生物燃料、健康和环境领域的创新均依赖于此。全球范围内，残余生物质的开发日益受到重视，生物技术工艺的发展使这些材料能够被赋予新的价值。固态培养在多种生物工艺中展现出前景，包括生物修复、有毒化合物生物降解、农工残留物解毒，以及作物残留物的生物转化以获得高附加值产品，如次生代谢物（抗生素、生物碱、植物生长因子等）、有机酸、生物农药、生物燃料、芳香化合物和酶。
木聚糖酶（EC3.2.1.8）是水解酶，可切割木聚糖多糖的β-1,4键——木聚糖是半纤维素的主要成分，也是植物细胞壁的主要构成之一。与纤维素酶和果胶酶一起，木聚糖酶约占全球酶市场的20%，因其具有多样化的工业应用，包括食品、药物、甜味剂、溶剂、燃料的生产，甚至纸浆的漂白。开发和改进面向木聚糖酶生产的技术，对于满足这些工业需求至关重要。
研究方法
2.1 微生物
研究对象为嗜热真菌 Myceliophthora heterothallica，来源于UNESP圣若泽杜里奥普雷图校区生物化学与应用微生物学实验室。为进行周期性传代和纯培养保存，使用含氨苄青霉素的Sabouraud营养培养基。纯培养物保存于冷冻管中，置于20%甘油溶液内，在−80°C冰箱中保存。
2.2 固态培养产酶
每次固态培养前，在250 mL锥形瓶中制备含100 mL Sabouraud琼脂的预接种体。通过划线法将真菌接种于该培养基表面，于45°C培养至完全生长（菌丝体或孢子形成）。
培养在250 mL锥形瓶中进行，使用5 g以下底物：甘蔗渣（BC）、甘蔗秸秆（PC）、麦麸（FT）及这三种材料的混合物（1:1:1 w/w，称为MIX）。甘蔗渣和甘蔗秸秆购自Frutal/MG市的糖厂，麦麸购自当地商业渠道。底物经洗涤、60°C干燥箱中干燥并过10目筛。
接种物标准化：每瓶含5 g底物，加入4个菌丝盘（1个菌丝盘=0.5 cm²）。初始用于底物补充的营养液由NH₄NO₃、MgSO₄·7H₂O和(NH₄)₂SO₄（各0.1%）组成，pH 5.0，使底物初始含水量为75%。真菌于45°C培养。每24小时取样一次，直至240小时（10天）。
本研究所用农工残留物具有有利于真菌生长和木聚糖酶产生的理化特性（表1）。甘蔗渣含约32–45%纤维素、20–32%半纤维素和17–32%木质素；甘蔗秸秆含约33–40%纤维素、25–28%半纤维素和约21%木质素。麦麸尤其富含半纤维素化合物，含41–60%非淀粉多糖，此外还有蛋白质、矿物质和其他支持微生物生长和酶合成的营养素。这些材料的高半纤维素含量使其适合作为固态发酵条件下木聚糖酶生产的底物。
对每个取样样品，加入80 mL蒸馏水，手动混匀后置于摇床振荡（100 rpm）20分钟。随后用尼龙组织圆片过滤材料，于5000×g、5°C离心15分钟，上清液用于测定酶活性。
培养参数
为评估底物补充（在上一阶段选定）对产酶的影响，在底物旁使用以下营养液：1—0.1% NH₄NO₃；2—0.1% (NH₄)₂SO₄；3—NH₄NO₃、MgSO₄·7H₂O、(NH₄)₂SO₄（各0.1%）；4—0.1%酵母提取物；5—水（对照），使初始含水量为75%。溶液pH调至5.0。
每种溶液的pH值从4.0至6.0（每0.5递增）进行评估，采用5×5因子设计。
为评估底物初始含水量的影响，向接种物中加入不同体积的营养液，使初始含水量分别为60%、65%、70%、75%和80%。评估的发酵温度为40°C、45°C、50°C和55°C，采用5×4因子设计。
2.3 木聚糖酶的生化表征
#### 2.3.1 pH和温度对酶活性的影响
为确定最适pH，将0.1 mL酶液与0.9 mL 1% Beechwood木聚糖悬浮液（Sigma®，日本神奈川—Merk Brazil，巴西圣保罗—Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）在不同pH值下、60°C孵育10分钟。使用的缓冲液（0.1 M）如下：柠檬酸钠（pH 3.0）、乙酸钠（pH 3.5–5.5）、MES（pH 6.0–6.5）、HEPES（pH 7.0–7.5）、甘氨酸-NaOH（pH 8.0–9.5）和CAPS（pH 10.0–10.5）。
温度对酶活性的影响通过将温度在40至80°C之间变化（每5°C递增）来评估。活性测定在酶的最适pH下进行。方法改编自文献[19]。
#### 2.3.2 pH和温度对酶稳定性的影响
为测定酶稳定性，将1.0 mL酶提取液在25°C孵育24小时。孵育结束后，在最适温度和pH下测定酶活性。
热稳定性通过将酶在10至80°C温度下孵育1小时来评估，随后根据最适pH和温度条件测定残余活性。方法改编自文献[19]。
2.4 木聚糖酶活性测定
木聚糖酶活性在含0.1 mL酶液和0.9 mL Beechwood木聚糖底物溶液（Sigma®，日本神奈川）（10.0 g·L⁻¹，溶于0.10 M乙酸缓冲液，pH 5.0）的反应混合物中测定。反应混合物于60°C孵育10分钟，然后加入1.0 mL DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸）终止反应。木聚糖水解过程中释放的还原糖根据Miller（1959）[24]提出的方法，使用木糖标准校准曲线进行定量。
一个木聚糖酶活性单位（U）定义为在上述测定条件下每分钟释放1.0 μmol还原糖所需的酶量。木聚糖酶活性以每克干底物的单位数（U·g⁻¹干底物）表示，即粗提取物中回收的总酶活性除以固态发酵中使用的底物初始干重（5 g）。
木聚糖酶活性按公式（1）计算：
活性（U·g⁻¹）=（C × V）/（t × m） (1)
其中C为释放的糖量（μmol），V为粗酶提取物总体积（mL），t为反应时间（min），m为底物初始干重（g）。
2.5 数据统计分析
对不同处理获得的数据进行方差分析（ANOVA），然后采用Scott–Knott检验（5%概率水平）比较均值。
【数据】菌株：Myceliophthora heterothallica；培养基：Sabouraud琼脂+氨苄青霉素；保存：20%甘油，−80°C；预培养温度：45°C；底物量：5g；接种量：4个菌丝盘（1盘=0.5cm²）；营养液：NH₄NO₃、MgSO₄·7H₂O、(NH₄)₂SO₄各0.1%；初始pH：5.0；初始含水量：75%；培养温度：45°C；取样间隔：24h；总培养时间：240h；提取：80mL蒸馏水，100rpm振荡20min，5000×g离心15min（5°C）；营养液处理：5种（0.1% NH₄NO₃；0.1% (NH₄)₂SO₄；三者各0.1%；0.1%酵母提取物；水对照）；pH范围：4.0–6.0（0.5递增）；含水量梯度：60%、65%、70%、75%、80%；发酵温度：40、45、50、55°C；最适pH测定：0.1mL酶液+0.9mL 1%木聚糖，60°C，10min；缓冲液：0.1M柠檬酸钠(pH3.0)、乙酸钠(pH3.5–5.5)、MES(pH6.0–6.5)、HEPES(pH7.0–7.5)、甘氨酸-NaOH(pH8.0–9.5)、CAPS(pH10.0–10.5)；最适温度范围：40–80°C（5°C递增）；pH稳定性：25°C孵育24h；热稳定性：10–80°C孵育1h；活性测定底物：10.0g·L⁻¹ Beechwood木聚糖（0.10M乙酸缓冲液pH5.0），60°C，10min；DNS法；统计：ANOVA+Scott–Knott检验（5%）
研究结果
3.1 *M. heterothallica* 在不同底物和培养条件下的木聚糖酶生产
最高木聚糖酶活性出现在含甘蔗渣、甘蔗秸秆和麦麸混合物（MIX）的培养基中，培养4天后达到495.2 U·g⁻¹，该条件与其他数值相比具有统计学差异。当真菌在其他单一培养基中接种时，木聚糖酶活性值显著较低（图1），提示这些底物的组分相互补充，有利于真菌产木聚糖酶。
使用麦麸、甘蔗渣和甘蔗秸秆组合作为底物时记录到最高酶活性，可能是由于这些材料理化特性的互补性。麦麸广泛用于木聚糖酶生产，主要因其半纤维素含量高，尤其是阿拉伯木聚糖，此外还具有良好的保水能力——这是固态培养过程中微生物生长的决定因素[25,26]。
另一方面，甘蔗渣虽然因其复杂的木质纤维素基质而具有较高的抗降解性，但显著改善了培养基的物理性质。其纤维结构有利于通气，促进更好的气体交换和微生物培养过程中产生热量的散发[27]。因此，这些残留物的联合使用为真菌发育和木聚糖酶表达提供了适宜条件。甘蔗秸秆也通过提供额外的半纤维素组分并改善保湿性和底物孔隙率来促进酶的生产。秸秆的存在可能增加了培养基质的结构异质性，有利于氧扩散和真菌在整个底物中的定殖。
该混合物在养分可用性（如麦麸中的木聚糖）和理想的物理特性（如甘蔗渣赋予的孔隙率）之间提供了平衡，从而产生更高的酶活性[28]。先前的研究表明，与使用单一材料相比，联合使用底物通常可获得更高的酶产量，原因在于碳源和氮源的互补性、微量元素的存在以及生长培养基的物理结构[29]。
Knob等[30]报道麦麸是固态发酵中真菌产木聚糖酶最常用的底物之一。其高含量的半纤维素化合物，特别是阿拉伯木聚糖，为木聚糖酶合成提供了重要的诱导物，同时也支持真菌生长。此外，作者强调固态发酵是将农工残留物（包括甘蔗渣）增值的有吸引力的策略，既促进酶生产又有助于废物管理。
在评估不同pH值下底物的不同营养液补充时，观察到最高木聚糖酶活性（533.3 U·g⁻¹）出现在仅用蒸馏水补充底物、pH 5.0的条件下，与其他条件相比具有统计学显著差异，如图2所示。
仅用蒸馏水补充底物就足以维持木聚糖酶的生产，其中pH 5.0表现最佳，酶活性最高。这一结果表明，麦麸、甘蔗渣和甘蔗秸秆的组合为微生物发育提供了充足的营养和物理支持，即使在缺乏复杂营养液的情况下也是如此。
麦麸含有蛋白质、矿物质和维生素，此外还有高半纤维素含量，这使其成为生产半纤维素酶的高效底物[25,26]。甘蔗渣虽然木质化程度更高，但有助于培养基的通气，有利于发酵过程的稳定性。添加营养液未带来显著增加可能与微生物营养需求已饱和有关[31]。
关于底物的初始pH，一些研究报道真菌在产木聚糖酶时偏好微酸性的初始pH底物，如黑曲霉[32]和白腐真菌[16]所产的酶。
在获得的最佳条件下，进行了评估底物初始含水量和真菌培养温度影响的实验。观察到最高木聚糖酶活性出现在真菌于40°C培养、底物初始含水量为80%的条件下（图3）。
80%含水量条件下观察到的更高酶活性表明，所用底物具有高保水能力，同时有利于所评估真菌的生长，显示其适应更潮湿环境的能力。这一特征在固态培养中使用的嗜热真菌中常有报道[31]。此外，麦麸、甘蔗渣和甘蔗秸秆的组合可能有助于在高湿度下维持培养基的适当物理结构，避免底物压实并允许充分通气——这是固态培养中真菌代谢的基本因素。
40°C下观察到的最佳性能与嗜热微生物的生理特征以及先前描述的产木聚糖酶结果一致。只要在微生物耐受范围内，高温往往有利于酶活性和胞外酶的基因表达[33]。另一方面，高于最适温度的温度可能损害所产酶的稳定性或抑制细胞生长，这解释了在较高温度范围内观察到的酶活性降低。
优化培养条件下获得的最大木聚糖酶活性（533.3 U·g⁻¹干底物）证明了 Myceliophthora heterothallica 利用农工残留物进行固态发酵产酶的潜力。该活性显著高于报道的 Penicillium sp. FSDE15 在麦麸上培养的产量（优化条件下达102.34 U·g⁻¹）[15]。然而，也有报道更高的活性，如 Aspergillus austwickii B6（752 U·g⁻¹干物质）、Trichoderma harzianum M7（1724 U·g⁻¹干物质）[17]和 Bacillus sp. TC-DT13（2943 U·g⁻¹，麦麸培养）[13]。研究间的差异是预期的，因为木聚糖酶生产受微生物菌株、底物组成、培养条件和提取程序的影响很大。
在本研究中，由甘蔗渣、甘蔗秸秆和麦麸组成的底物混合物可能通过将结构性木质纤维素组分与营养丰富材料相结合，促进了协同效应。甘蔗残留物提供能诱导木聚糖酶合成的纤维素和半纤维素组分，而麦麸则提供支持真菌生长和代谢的蛋白质、维生素、矿物质和易利用碳水化合物。此外，M. heterothallica 的嗜热特性及其木聚糖酶已知的热稳定性是工业应用的重要优势，增强了该微生物的生物技术潜力。
除底物组成外，M. heterothallica 的生理特征也可能对观察到的酶生产有所贡献。该真菌被归类为嗜热菌，已被认为是具有工业相关性的木质纤维素酶的有前景来源。嗜热真菌通常在较高温度下生长，其酶在高温下具有更高的稳定性，这在涉及高温的工业过程中具有优势。
【数据】最高酶活（MIX底物，4天）：495.2 U·g⁻¹；最佳营养液：蒸馏水（pH 5.0），酶活533.3 U·g⁻¹；最佳温度：40°C；最佳含水量：80%；最适pH范围：5.0–6.5；pH峰值：5.0；pH稳定性：3.5–9.5范围保持>90%；最适温度：65°C；热稳定性：60°C以下1h保持100%；对比菌株：Penicillium sp. FSDE15（102.34 U·g⁻¹）、A. austwickii B6（752 U·g⁻¹）、T. harzianum M7（1724 U·g⁻¹）、Bacillus sp. TC-DT13（2943 U·g⁻¹）
讨论与解读
本研究表明，Myceliophthora heterothallica 通过固态发酵农工残留物混合物（麦麸、甘蔗渣和甘蔗秸秆，1:1:1 w/w）可高效生产耐热木聚糖酶。最佳产酶条件为仅用水（pH 5.0）补充底物、初始含水量80%、培养温度40°C、培养4天，最高酶活达533.3 U·g⁻¹干底物。该酶的最适pH为5.0，在pH 3.5–9.5宽范围内保持超过90%的稳定性；最适温度为65°C，在60°C以下保温1小时酶活完全稳定。这些特性使该酶在工业应用中具有显著优势——许多工业过程涉及高温和宽pH波动，酶的稳定性是经济可行性的关键。
底物混合物的协同效应值得关注：麦麸提供丰富的半纤维素和营养物，甘蔗渣改善通气性，甘蔗秸秆增加结构异质性。这种"营养+结构"的互补策略为农工废弃物的增值利用提供了有效路径。与报道的其他菌株相比，该酶的产量处于中等水平，但其突出的pH和温度稳定性构成了差异化优势。
编译者解读：从合成生物学应用角度看，本研究的方法选择体现了"废物资源化"与"极端酶挖掘"的结合——利用嗜热真菌天然产酶能力，无需基因工程改造即可获得工业级稳定性酶制剂。固态发酵的低成本优势明显，但产量与Trichoderma等工程菌株仍有差距。后续若结合启动子工程或信号肽优化，有望进一步提升产量。该酶在60°C以下完全稳定、65°C最适的特性，使其尤其适合饲料制粒和纸浆漂白等中高温工艺场景。
参考来源
Martins EDS, Poço DMLA, Martins HL. Production of Thermostable Xylanase by Myceliophthora heterothallica in Solid-State Culture Using Agro-Industrial Residues. J Fungi (Basel). PMID: 42506223.
PMID: 42506223