来源：Decolorization of Bromophenol Blue by Free and Immobilized Crude Extracellular Laccase Preparation from Bjerkandera adusta TMF1 Produced on Agro-Industrial Residues.（J Fungi (Basel)）| 编译：DNA Lab Space
导读
合成染料因持久性和毒性成为环境治理难题。本研究首次将白腐真菌 Bjerkandera adusta TMF1 在小麦/大麦麸皮混合物上固态发酵产生的粗漆酶制剂，固定于戊二醛活化的海藻酸盐珠上，用于无介体溴酚蓝脱色。固定化效率达 98.84%，残余活性 88.39%，固定化制剂在 1 小时内实现 78.12% 脱色率，且可重复使用。该研究为低成本酶制剂应用于染料废水处理提供了可行方案。
研究背景
工业废水排放的合成染料因持久性、毒性及对常规处理工艺的耐受性而成为环境问题。三苯甲烷类染料因其复杂芳香结构和潜在生物毒性尤为棘手。吸附、混凝、膜过滤和化学氧化等传统处理方法常伴随高成本、污染物去除不彻底及二次污染等问题。酶法生物降解因此作为染料去除的替代方案受到关注。在氧化酶中，真菌漆酶因底物特异性广、能氧化多种芳香化合物和难降解污染物而备受关注。
白腐真菌被认为是胞外木质素降解酶的高效生产者。固态发酵利用木质纤维素农业工业残余物被认为是经济高效的真菌产酶策略。与液体深层发酵相比，固态发酵具有利用低成本可再生底物等优势。本研究探讨了 B. adusta TMF1 在农业工业残余物上产漆酶，并评估其游离与固定化形式对溴酚蓝的脱色效果。
研究方法
2.1 化学试剂
ABTS、海藻酸钠、戊二醛、氯化钙和牛血清白蛋白购自 Sigma-Aldrich。溴酚蓝作为脱色实验的模式染料。麦芽提取物肉汤、MRS 肉汤、TSB 肉汤、琼脂和酵母提取物购自 Torlak。小麦麸皮和大麦麸皮购自贝尔格莱德零售店。
【数据】试剂来源：Sigma-Aldrich；Torlak；染料：溴酚蓝；麸皮：市售
2.2 微生物与植物材料
白腐真菌 B. adusta TMF1（MW327505）用于漆酶生产。抗菌试验所用 Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469、Candida albicans ATCC 10259 及废弃啤酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 来自贝尔格莱德大学工艺冶金学院生化工程与生物技术系菌种保藏中心。植物毒性试验所用小麦种子（Triticum aestivum）购自贝尔格莱德市场。
【数据】菌株：B. adusta TMF1 (MW327505)；L. rhamnosus ATCC 7469；C. albicans ATCC 10259；S. cerevisiae
2.3 接种物制备
B. adusta TMF1 保存在麦芽琼脂平板（麦芽提取物肉汤 20 g/L，琼脂 15 g/L）上，30°C 培养。真菌接种物制备按先前研究方法进行。L. rhamnosus ATCC 7469 在 MRS 肉汤中 37°C 培养，C. albicans ATCC 10259 在含 0.6% 酵母提取物的 TSB 中 37°C 培养。废弃啤酒酵母 S. cerevisiae 在麦芽提取物肉汤中 30°C 培养。
【数据】培养基：麦芽琼脂（20 g/L 麦芽提取物，15 g/L 琼脂）；MRS 肉汤；TSB+0.6% 酵母提取物；温度：30°C 或 37°C
2.4 固态发酵产漆酶
以 WB/BB 混合物（1:1，w/w）为底物进行固态发酵产漆酶。谷物混合物调至 70% 含水量，在 300 mL 锥形瓶中 121°C 灭菌 20 min，接种 8 个 B. adusta TMF1 菌丝块（1 × 1 cm）。发酵在 30°C 黑暗条件下进行 9 天。粗漆酶提取包括硫酸铵沉淀（70% 饱和度）和膜浓缩，按先前研究方法进行。所得酶制剂在下文中称为粗胞外漆酶制剂。
【数据】底物：WB/BB（1:1，w/w）；含水量：70%；灭菌：121°C，20 min；接种量：8 个菌丝块（1×1 cm）；温度：30°C；时间：9 天；硫酸铵饱和度：70%
2.5 漆酶在海藻酸盐珠上的固定化
海藻酸盐珠用 5%（w/v）海藻酸钠溶于醋酸缓冲液（0.1 M，10 mL，pH 5）制备。海藻酸钠溶液搅拌 1 h 后逐滴加入 0.1 M CaCl₂ 溶液中成珠，并在同一溶液中稳定 2 h。
海藻酸盐珠的活化参照 Hu 等人的方法并稍作修改。将珠子与不同浓度 GA（2–10%，v/v）以珠:GA 溶液比 1:10 孵育 30、60、90 和 120 min，以确定最佳活化条件。活化过程在 25°C、轨道摇动（150 rpm）下进行。活化后，珠子用醋酸缓冲液（0.1 M，15 mL，pH 5）洗涤三次。
漆酶固定化时，GA 活化的海藻酸盐珠与 B. adusta TMF1 粗胞外漆酶制剂在不同时间间隔（30、60、90 和 120 min）、25°C、轨道摇动（150 rpm）下孵育。每次实验将 5 mL 粗胞外漆酶制剂（pH 5）与 3 个 GA 活化海藻酸盐珠混合。固定化后，珠子用醋酸缓冲液（0.1 M，15 mL，pH 5）洗涤三次，用于漆酶活性测定。固定化流程如图 2 所示。
【数据】海藻酸钠浓度：5%（w/v）；缓冲液：0.1 M 醋酸缓冲液 pH 5；CaCl₂ 浓度：0.1 M；GA 浓度：2–10%（v/v）；珠:GA 比：1:10；活化时间：30–120 min；温度：25°C；转速：150 rpm；酶液用量：5 mL；珠子数量：3 个
2.6 漆酶活性测定
漆酶活性通过监测 ABTS 在 420 nm 处的氧化进行分光光度法测定。反应混合物含 0.2 mL 1 mM ABTS、0.6 mL 0.1 M 醋酸钠缓冲液（pH 5）和 0.4 mL 粗胞外漆酶制剂。酶活性以 IU/mL 表示。
漆酶活性按公式（1）计算：
IU/mL = ((Asample/t) × 1.2 × df)/(3.6 × Venzyme)
其中 Asample 为样品吸光度，t 为反应时间（1 min），1.2 为反应混合物总体积（mL），df 为稀释因子，3.6 为 ABTS 的消光系数，Venzyme 为反应混合物中粗胞外漆酶制剂的体积（mL）。
固定化粗胞外漆酶制剂在相同条件下使用 3 个海藻酸盐珠测定。所有实验设三次重复，标准偏差小于 ±3%，所有结果代表三次测量的平均值。
为进一步表征用于固定化的粗胞外漆酶制剂，额外测定了 MnP 和 LiP 活性。SDS-PAGE 分析评估粗胞外酶制剂的蛋白质谱。SDS-PAGE 使用 10% 聚丙烯酰胺分离胶和 4% 聚丙烯酰胺浓缩胶，采用小型垂直电泳系统。蛋白样品制备：100 μL 粗胞外漆酶制剂与 50 μL 上样缓冲液（0.5 M Tris-HCl 缓冲液、99% 甘油、10% SDS、溴酚蓝，使用前加入 β-巯基乙醇）混合，沸水浴（95°C）加热 5 min 后上样。样品与预染蛋白 marker（10–250 kDa）一同上样。电泳缓冲液为 3 g Tris、14.4 g 甘氨酸和 10 mL 10% SDS 定容至 1 L。电泳在 80 V 下进行至样品进入分离胶，随后电压升至 150 V 保持至完成（约 90 min）。蛋白用考马斯亮蓝 R250 染色液（0.1% CBB、10% 醋酸、50% 甲醇）染色，随后用 5% 甲醇和 7% 醋酸溶液脱色过夜。
【数据】ABTS 浓度：1 mM；醋酸钠缓冲液：0.1 M pH 5；检测波长：420 nm；反应时间：1 min；消光系数：3.6；SDS-PAGE：10% 分离胶/4% 浓缩胶；变性：95°C，5 min；电泳：80 V 后 150 V，约 90 min
2.7 固定化效率与残余活性测定
蛋白浓度用 Bradford 法测定，BSA 为标准品，吸光度在 595 nm 处测量。固定化粗胞外漆酶制剂的情况下，蛋白浓度在洗涤海藻酸盐珠后收集的上清液中测定。所有实验设三次重复，结果以平均值 ± 标准差表示。
固定化效率按公式（2）计算：
固定化效率（%）= ((ci − cs)/ci) × 100
其中 ci 为粗胞外漆酶制剂的蛋白浓度（mg/mL），cs 为洗涤后上清液的蛋白浓度（mg/mL）。
残余活性按公式（3）计算：
A（%）=（固定化制剂漆酶活性/游离制剂漆酶活性）× 100
其中活性指游离和固定化粗胞外漆酶制剂测得的漆酶活性。
【数据】蛋白测定：Bradford 法，BSA 标准品，595 nm；重复：三次
2.8 动力学参数 Km 和 Vmax 的测定
游离和固定化粗胞外漆酶制剂的米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）使用不同 ABTS 浓度（1–5 mM）测定。动力学参数根据米氏-门滕模型用 Lineweaver-Burk 图计算。所有实验设三次重复，结果以平均值 ± 标准差表示。
【数据】ABTS 浓度：1–5 mM；模型：Michaelis-Menten；作图：Lineweaver-Burk
研究结果
3.1 漆酶生产
本研究首次证明 WB 和 BB 的混合物是 B. adusta TMF1 产漆酶的有效底物。在所用固态发酵条件下（WB:BB 比 1:1，含水量 70%，30°C），该菌株在培养 9 天后产生最大漆酶活性 51.51 IU/mL（128.77 IU/g）。为进一步表征所得粗胞外漆酶制剂，额外测定了 MnP 和 LiP 活性。在所用培养和酶制剂制备条件下未检测到 MnP 或 LiP 活性。粗胞外漆酶制剂的蛋白质谱经 SDS-PAGE 分析。如补充图 S1 所示，观察到多条蛋白条带，证实粗胞外漆酶制剂为异质组成。在约 50 kDa 分子量区域检测到一条明显蛋白条带，与许多真菌漆酶的报道分子量一致。
【数据】漆酶活性：51.51 IU/mL（128.77 IU/g）；培养时间：9 天；WB:BB：1:1；含水量：70%；温度：30°C；MnP/LiP：未检出；蛋白条带：约 50 kDa
3.2 粗胞外漆酶制剂在海藻酸盐珠上的固定化
粗胞外漆酶制剂固定化于经 GA 预活化的 Ca-海藻酸盐珠上。评估了 GA 活化时间、GA 浓度和固定化时间对固定化效率和残余漆酶活性的影响。
使用 6%（v/v）GA 考察不同活化时间（30、60、90 和 120 min）。活化 30 min 后获得最高 IE（98.84%）和残余活性（88.39%）（图 3a）。延长活化时间导致残余漆酶活性逐渐下降，而 IE 在所有测试条件下保持 98% 以上。
GA 浓度的影响在 2–10%（v/v）范围内、活化时间 30 min 条件下考察（图 3b）。6%（v/v）GA 获得最高残余活性和 IE。较低和较高 GA 浓度均导致残余活性降低，而 IE 保持持续高值。
固定化时间的影响使用 30、60、90 和 120 min 的孵育期评估（图 3c）。固定化 30 min 后获得最高残余活性（88.39%）。进一步延长固定化时间导致酶活性降低，而 IE 在所有测试条件下保持 98% 以上。
【数据】最佳活化时间：30 min；最佳 GA 浓度：6%（v/v）；最佳固定化时间：30 min；最高 IE：98.84%；最高残余活性：88.39%
3.3 动力学参数 Km 和 Vmax
使用不同 ABTS 浓度（1–5 mM）测定游离和固定化粗胞外漆酶制剂的动力学参数。基于测得的漆酶活性，游离制剂的 Km 值为 86 µM，固定化后增至 376 µM。相应地，Vmax 从 549 µM/min 降至固定化后的 153 µM/min（表 1）。
【数据】游离 Km：86 µM；固定化 Km：376 µM；游离 Vmax：549 µM/min；固定化 Vmax：153 µM/min
3.4 固定化粗胞外漆酶制剂的可重复使用性
通过反复的 ABTS 氧化循环评估 B. adusta TMF1 海藻酸盐固定化粗胞外漆酶制剂的操作稳定性，因为可重复使用性是潜在工业应用的重要参数。
固定化生物催化剂在连续 11 个循环中保持可检测的漆酶活性（图 4）。
最高残余活性出现在第一循环（88.39%），第二和第三循环后分别为 79.13% 和 61.11%。固定化生物催化剂在第四循环保持约 46.1% 活性，第五和第六循环残余活性保持在 30% 以上（分别为 37.56% 和 31.00%）。后续循环中，残余漆酶活性逐渐降至 20% 以下。
【数据】循环次数：11 次；第 1 循环：88.39%；第 2 循环：79.13%；第 3 循环：61.11%；第 4 循环：约 46.1%；第 5 循环：37.56%；第 6 循环：31.00%
3.5 固定化粗胞外漆酶制剂的表面形态
通过 SEM 分析 Ca-海藻酸盐珠在粗胞外漆酶制剂固定化前后的表面形态。SEM 显微照片显示酶固定化后发生形态改变。固定化前，珠子主要呈球形，直径约 1.5 mm。固定化后，观察到珠结构向椭球形轻微变形。
不含固定化粗胞外漆酶制剂的对海藻酸盐珠（图 5a、c、e）显示相对致密的表面结构，而含固定化粗胞外漆酶制剂的珠子（图 5b、d、f）呈现更大且更不规则的表面孔隙。此外，固定化珠表面观察到晶体结构，可能与漆酶沉淀时使用的残余硫酸铵有关。
【数据】珠直径：约 1.5 mm；形态：球形→椭球形；表面：孔隙增大、出现晶体结构
3.6 FT-IR 分析
FTIR 光谱用于研究粗胞外漆酶制剂固定化到 GA 活化海藻酸盐珠后的结构变化。游离粗胞外漆酶制剂、海藻酸盐珠和含固定化粗胞外漆酶制剂的海藻酸盐珠的 FTIR 光谱如图 6 所示。
游离粗胞外漆酶制剂的光谱中，在 3200–3400 cm⁻¹ 范围内观察到宽峰。海藻酸盐珠在 3301 cm⁻¹ 处检测到特征峰。固定化后，该峰不再观察到，而在 3026 cm⁻¹ 处出现新峰。
固定化后还记录到其他光谱变化。1265 cm⁻¹ 和 1169 cm⁻¹ 处的峰在固定化样品中消失。此外，939 cm⁻¹ 和 884 cm⁻¹ 处的峰分别移至 959 cm⁻¹ 和 890 cm⁻¹。固定化制剂中出现 606 cm⁻¹ 处的新条带。
【数据】FTIR 特征峰：游离酶 3200–3400 cm⁻¹；海藻酸盐珠 3301 cm⁻¹；固定化后新峰 3026 cm⁻¹ 和 606 cm⁻¹；峰位移：939→959 cm⁻¹，884→890 cm⁻¹；消失峰：1265、1169 cm⁻¹
3.7 溴酚蓝脱色
考察了染料浓度、pH 和温度对 B. adusta TMF1 粗胞外漆酶制剂脱色 BPB 的影响。
不同 BPB 浓度（25–100 mg/L）用游离粗胞外漆酶制剂（51.51 IU/mL）在 pH 5、30°C 下处理 60 min。如图 7a 所示，25 mg/L BPB 时获得最高脱色效率（75.21%），而相同条件下 50 mg/L 时脱色率为 73.02%。进一步增加染料浓度导致脱色效率下降，100 mg/L BPB 时降至 24.32%。
进一步在恒定 BPB 浓度 50 mg/L 下，用游离和海藻酸盐固定化粗胞外漆酶制剂评估 pH（3–7）和温度（30–50°C）对 BPB 脱色的影响。游离和固定化制剂均在 pH 5 和 30°C 下表现出最高脱色效率（图 7b–e）。
在最佳条件下，游离粗胞外漆酶制剂在 60 min 后实现 73.02% 的 BPB 脱色率，而固定化制剂在相同条件下达到 78.12%（图 8a）。固定化制剂在初始反应阶段也表现出更快的脱色速度，15 min 和 30 min 时分别达到 48.42% 和 59.51%，而游离漆酶分别为 22.65% 和 50.88%。
固定化粗胞外漆酶制剂在连续四个 BPB 脱色循环中保持活性，第二、第三和第四循环的效率分别为 61.1%、50.21% 和 29.21%（图 8b）。
【数据】最佳 BPB 浓度：25 mg/L（75.21%）和 50 mg/L（73.02%）；100 mg/L 时：24.32%；最佳 pH：5；最佳温度：30°C；游离制剂 60 min：73.02%；固定化制剂 60 min：78.12%；15 min：游离 22.65%、固定化 48.42%；30 min：游离 50.88%、固定化 59.51%；循环脱色：第 2 次 61.1%、第 3 次 50.21%、第 4 次 29.21%
3.8 HPLC 分析
用等度洗脱 HPLC 分析 B. adusta TMF1 粗胞外漆酶制剂酶处理后 BPB 色谱图的变化。UV 检测在 592 nm 和 254 nm 下进行。如补充图 S2a、b 所示，未处理和处理的样品在 254 nm 处色谱图有明显差异，而 592 nm 处观察到相似峰。处理样品中，254 nm 处出现两个额外的小峰，提示酶处理过程中形成了转化产物。
【数据】HPLC 检测波长：592 nm 和 254 nm；254 nm 处新增 2 个小峰
3.9 植物毒性
小麦种子（T. aestivum）作为模式植物用于植物毒性评估。
【数据】模式植物：小麦（T. aestivum）
讨论与解读
尽管白腐真菌的木质素降解潜力已获公认，但 Bjerkandera 属真菌产漆酶的信息仍然缺乏。多项研究报告不同 B. adusta 菌株的漆酶活性低或不一致，部分菌株甚至无法产生可检测水平的漆酶。B. adusta TMF1 产生的最大漆酶活性（51.51 IU/mL；128.77 IU/g）优于多种其他 B. adusta 菌株。例如，Tripathi 等在富营养培养基中培养 10 天获得最大漆酶活性 5.5 IU/L；Kang 等报道水稻秸秆上培养的 B. adusta SM46 漆酶活性为 0.21 IU/mL。虽然因培养条件、底物和活性测定方法不同而难以直接比较，但 B. adusta TMF1 相对较高的漆酶活性表明其具有良好的生物催化潜力。本研究还证明小麦麸皮和大麦麸皮等低成本农业工业残余物可作为该菌株产酶的有效底物。
固定化后 Km 值从 86 µM 增至 376 µM，Vmax 从 549 µM/min 降至 153 µM/min，这与固定化导致的底物可及性降低和构象变化一致。固定化制剂在 ABTS 氧化中可维持 11 个循环，在 BPB 脱色中可维持 4 个循环，显示出良好的操作稳定性。FTIR 和 SEM 分析证实了酶的成功固定化及海藻酸盐基质的结构变化。HPLC 分析显示酶处理后 BPB 色谱图变化，植物毒性和抗菌试验提示处理样品对测试生物的毒性降低。
编译者解读
本研究巧妙地将"农业废弃物资源化"与"染料废水生物处理"两个目标结合——用麸皮固态发酵产酶，再固定化用于染料脱色，形成闭环。固定化效率接近 99% 且无需介体即可实现 78% 脱色率，这在合成生物学应用层面具有实际吸引力。但应注意，动力学参数显示固定化后底物亲和力显著下降（Km 增 4 倍以上），且连续使用后活性衰减较快，距离工业规模化仍有距离。未来若能在固定化载体改性和酶稳定性增强方面进一步优化，该策略有望成为低成本染料废水处理的有效选项。
参考来源
Ilić N, Lađarević J, Vasić K, Leitgeb M, Knez Ž. Decolorization of Bromophenol Blue by Free and Immobilized Crude Extracellular Laccase Preparation from Bjerkandera adusta TMF1 Produced on Agro-Industrial Residues. J Fungi (Basel). PMID: 42506292.
PMID: 42506292