来源：Purification of Protein Glutaminase by Cell Surface Display and Krill Protein Modification via Deamidation.（Foods）| 编译：DNA Lab Space
导读
磷虾蛋白作为磷虾油提取的副产物，营养价值高但溶解性和乳化性受限。本研究从乳酪杆菌（Chryseobacterium lactis CGMCC 33780）中获取蛋白谷氨酰胺酶基因，借助Lpp-OmpA细胞表面展示系统实现一步纯化，省去传统细胞破碎和多次超滤步骤。纯化后的成熟酶（Mature-CLPG）最适pH 5.0、最适温度50°C，在50°C孵育12 h后仍保留约75%活性。将该酶用于磷虾蛋白分离物（KPI）脱酰胺改性，当酶用量1.0 U/g时脱酰胺度达15.2%，乳化性提升至23%，为蛋白谷氨酰胺酶的制备和应用提供了简化路径。
研究背景
蛋白质工程与功能生物大分子开发是应对食品科学、生物医学和工业生物技术领域挑战的关键策略。磷虾蛋白作为磷虾油提取过程中的副产物，兼具营养价值和功能多样性，其氨基酸组成全面覆盖人体必需氨基酸，生物价超过许多传统肉类和乳蛋白。然而，这类蛋白资源目前多被废弃或用于低价值动物饲料，未得到充分利用。
蛋白谷氨酰胺酶可催化蛋白质中谷氨酰胺残基脱酰胺，将酰胺基转化为羧基，从而改变蛋白质的电荷分布和构象，改善溶解性、乳化性和起泡性等功能特性。传统蛋白谷氨酰胺酶制备依赖胞内表达，需经历细胞破碎、亲和纯化、超滤除咪唑、酶原激活、二次纯化和二次超滤等多步操作，流程冗长且损失大。本研究尝试以细胞表面展示技术简化这一流程，并将所得酶用于磷虾蛋白的功能改性。
研究方法
2.1 化学试剂、菌株与质粒
胰蛋白胨和氯化钠购自生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母提取物购自Oxoid有限公司（英国贝辛斯托克）；硫酸卡那霉素、胰蛋白酶、IPTG和咪唑由Mreda科技有限公司（北京）提供；盐酸、硫酸、磷酸盐及其他金属盐均购自国药集团化学试剂有限公司（上海）。SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自合肥白鲨生物科技有限公司；Ni-NTA亲和树脂购自常州天地人和生物科技有限公司。脂蛋白-外膜蛋白A（Lpp-OmpA）基因来源于大肠杆菌BL21(DE3)。蛋白谷氨酰胺酶基因来源于乳酪杆菌CGMCC 33780，由本实验室保存，经密码子优化后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。LPP-ompA和CLPG基因克隆至pET28a载体。PCR所用KOD聚合酶购自东洋纺株式会社（日本大阪）；ClonExpress Ultra一步克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；一步克隆引物由SnapGene设计并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
【数据】菌株：大肠杆菌BL21(DE3)、乳酪杆菌CGMCC 33780；载体：pET28a；试剂来源：生工生物、Oxoid、Mreda、国药集团等；引物合成：生工生物
2.2 CLPG生物信息学分析
采用AlphaFold3构建CLPG同源模型。蛋白质功能预测基于UniProt数据库检索，二级结构由Espript 3.0分析。CLPG结构通过Discovery Studio Visualizer和PyMOL 3.1.2进行解析。
【数据】建模工具：AlphaFold3；数据库：UniProt；结构分析软件：Discovery Studio Visualizer、PyMOL 3.1.2
2.3 大肠杆菌中的表达
将重组质粒pET28a-Lpp-ompA-CLPG转化至大肠杆菌BL21(DE3)，转化菌株命名为BL21(DE3)-pET28a-Lpp-ompA-CLPG，在含50 μg/mL卡那霉素的Luria–Bertani（LB）培养基中于37°C、180 rpm过夜培养。随后以1%（v/v）接种量转接至50 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基，37°C继续培养。当OD600达到0.6–0.8时，加入0.2 mM IPTG，于20°C、180 rpm诱导表达24 h。培养物经8000×g离心5 min收集菌体。菌体沉淀重悬于10 mL纯化缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，含20 mM咪唑和500 mM NaCl），加入胰蛋白酶溶液至终浓度0.3 mg/mL，37°C孵育1 h。随后8000×g离心5 min，收集上清液。
【数据】培养基：LB；卡那霉素浓度：50 μg/mL；接种量：1%（v/v）；诱导条件：0.2 mM IPTG、20°C、180 rpm、24 h；离心：8000×g、5 min；重悬体积：10 mL；缓冲液：50 mM Tris-HCl pH 7.4、20 mM咪唑、500 mM NaCl；胰蛋白酶终浓度：0.3 mg/mL；孵育：37°C、1 h
2.4 Ni-NTA亲和层析纯化
收集的上清液采用镍亲和层析进一步纯化，目标蛋白以咪唑梯度溶液洗脱。上样前，层析柱用超纯水冲洗并以基础纯化缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，20 mM咪唑和500 mM NaCl）平衡。随后，粗CLPG样品在重力作用下流经Ni-NTA树脂以实现充分结合。未结合的杂质用洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，50 mM咪唑和500 mM NaCl）去除，目标酶最终以高浓度咪唑洗脱液洗脱。
采用SDS-PAGE验证所收集酶样品的纯度。使用NanoDrop Lite分光光度计（Thermo Fisher Scientific，纽约，NY，美国）检测洗脱组分中的蛋白质浓度。随后，纯化酶液经超滤（10 kDa）浓缩并置换缓冲液至20 mM PBS（pH 7.4），于−80°C保存备用。
【数据】平衡缓冲液：50 mM Tris-HCl pH 7.4、20 mM咪唑、500 mM NaCl；洗涤缓冲液：50 mM Tris-HCl pH 7.4、50 mM咪唑、500 mM NaCl；超滤截留分子量：10 kDa；保存缓冲液：20 mM PBS pH 7.4；保存温度：−80°C
2.5 酶学性质测定
CLPG的脱酰胺活性按照Zhang等描述的方法测定。最适反应pH在50 mM Britton–Robinson缓冲液中于pH 2.0–11.0范围内测定。pH稳定性评估中，酶在相同缓冲体系中于pH 2.0–11.0的不同pH水平预孵育2 h。孵育后，采用标准酶活性测定方案测定残余酶活性。所有实验均进行三次独立生物学重复（n = 3），结合方差分析进行统计功效分析以评估统计学显著性。
温度依赖性催化活性在20 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.5）中于20°C至80°C范围内检测。热稳定性研究中，1 mg/mL CLPG溶液在相同缓冲液中于相应温度条件下孵育1–12 h。热处理后，按标准实验流程测定剩余酶活性。阴性对照通过先将酶溶液与三氯乙酸（TCA）混合使酶完全失活，再加入底物进行孵育反应制备。最后，混合物与其他实验样品一同测定酶活性。
不同金属离子对CLPG催化性能的影响在标准反应条件下考察。将KCl、MgCl₂、CaCl₂、FeCl₃、CuCl₂、MnCl₂、LiCl、NiCl₂、BaCl₂和CoCl₂等一系列金属氯化物分别加入反应体系至终浓度5 mM进行活性测定。
纯化CLPG的动力学常数通过已建立的酶活性检测方法表征。反应体系中加入终浓度为1–50 mM的底物Cbz-Gln-Gly及足量纯化酶。所有测定均进行三次独立重复。动力学参数Km、Vmax和Kcat通过Lineweaver–Burk双倒数作图法计算。
【数据】pH范围：2.0–11.0；pH稳定性预孵育：2 h；温度范围：20–80°C；缓冲液：20 mM磷酸钠 pH 6.5；蛋白浓度：1 mg/mL；热稳定性孵育：1–12 h；金属离子浓度：5 mM；底物浓度：1–50 mM；重复次数：n = 3
2.6 脱酰胺度（DD）和水解度（DH）测定
DD采用苯酚–次氯酸盐比色法测定。简要流程：100 μL样品溶液依次与500 μL试剂A、400 μL蒸馏水、250 μL试剂B和500 μL试剂C混合。其中，试剂A含40.06 g/L苯酚和0.15 g硝普钠；试剂B为49.94 g/L氢氧化钾溶液；试剂C由200.04 g/L碳酸钾和835 μL次氯酸钠组成。混合体系于37°C孵育30 min。阴性对照组中，100 μL样品溶液以等体积蒸馏水替代。随后记录630 nm处吸光度值，氨含量参照已建立的标准曲线定量。总氨检测中，等体积2 mol/L硫酸与1%（w/v）KPI溶液混合，混合物于100°C加热4 h后进一步测定。同时设置仅含硫酸、不含蛋白质的空白对照，在相同加热条件下进行。DD计算公式如下：
DD（%）= A1/A0 × 100
其中A1为CLPG脱酰胺后KPI的游离氨含量，A0为KPI的总氨含量。
OPA法用于测定脱酰胺KPI（DKPI）样品的水解度（DH）。
【数据】试剂A：40.06 g/L苯酚+0.15 g硝普钠；试剂B：49.94 g/L KOH；试剂C：200.04 g/L K₂CO₃+835 μL次氯酸钠；孵育：37°C、30 min；检测波长：630 nm；总氨水解：2 mol/L H₂SO₄、100°C、4 h；KPI浓度：1%（w/v）
2.7 浊度和表面疏水性测定
所有样品溶于20 mM pH 6.5磷酸盐缓冲液，充分混匀制备1%（w/v）蛋白溶液。溶液浊度通过检测……（原文此处截断，后续内容未在节选中提供）
【数据】缓冲液：20 mM pH 6.5磷酸盐；蛋白浓度：1%（w/v）
研究结果
3.1 CLPG的生物信息学与结构分析
实验室前期筛选到一株具有蛋白谷氨酰胺酶活性的菌株，经菌种鉴定为乳酪杆菌（Chryseobacterium lactis）。随后通过基因组测序获得编码该蛋白谷氨酰胺酶的基因，共包含298个氨基酸。与其他蛋白谷氨酰胺酶比对后发现，该基因的1–114位氨基酸为CLPG的前肽（pro-peptide），115–298位氨基酸为CLPG的成熟肽（mature peptide）（图1A）。前期研究已表明蛋白谷氨酰胺酶的催化三联体为CYS-HIS-ASP，因此推测CLPG的催化三联体为C156-H197-D217。利用AlphaFold3预测了CLPG的三维结构模型，其二级结构和三维模型显示共有6个α-螺旋和13个β-折叠（图1B、C）。前肽区域由2个α-螺旋和6个β-折叠组成，成熟肽区域由4个α-螺旋和7个β-折叠组成。催化三联体C156-H197-D217位于前肽和成熟肽之间。在激活为成熟PG之前，前肽遮蔽活性口袋，使PG处于非活性状态。
【数据】氨基酸总数：298；前肽：1–114位；成熟肽：115–298位；催化三联体：C156-H197-D217；二级结构：6个α-螺旋、13个β-折叠
3.2 CLPG的表达与纯化
本研究所用LPP和ompA基因均来源于BL21(DE3)。脂蛋白信号肽及后续9个氨基酸序列通过PCR扩增获得。同样，外膜蛋白A基因中编码Asn46至Asn159的基因序列也通过PCR获得。上述两个基因与CLPG基因连接后，通过一步克隆插入pET28a载体。由于Lpp和ompA基因来源于宿主自身，其表达无需额外的序列优化。
重组质粒pET28a-LPP-ompA-CLPG构建后转化至BL21(DE3)，经培养和诱导后收集菌体。经胰蛋白酶激活和纯化后，SDS-PAGE验证获得单一蛋白条带，分子量约为17 kDa。表达和纯化流程示意图如图2所示。与膜蛋白融合后，CLPG蛋白被转运至细胞膜表面。此时加入胰蛋白酶在Pro-CLPG和Mature-CLPG之间切割，从而将Mature-CLPG释放为游离酶。由于Mature-CLPG的C端带有His标签，随后可用Ni-NTA柱纯化获得高纯度的Mature-CLPG。
与传统胞内直接表达CLPG的方法相比，该方法具有一定优势。传统方法中，表达后需进行细胞裂解，随后纯化CLPG。之后必须通过超滤去除溶液中的咪唑，因其会干扰后续实验。超滤后进行酶原激活，再经过一轮纯化。最后需第二次超滤才能获得适用于实验的Mature-CLPG。相比之下，本研究方法无需细胞裂解，激活前仅需收集菌体。随后仅需一轮纯化和一次超滤即可获得可直接用于实验的Mature-CLPG。
【数据】分子量：约17 kDa；纯化步骤：1轮亲和层析+1次超滤（对比传统方法2轮纯化+2次超滤）
3.3 CLPG的操作与催化参数
CLPG的最适pH和温度条件如图3A、B所示。该酶在pH 5.0和50°C条件下表现出峰值活性。其最适反应温度与Leng等发现的新型蛋白谷氨酰胺酶PG5相同。在pH 4至6范围内，CLPG相对活性超过50%；但当pH低于4或高于6时，相对活性持续低于50%。温度方面，虽然最适反应温度为50°C，但在60°C时仅保留不到20%的活性。
pH稳定性结果如图3C所示。CLPG在pH 4至10范围内表现出相对稳定的活性。尽管CLPG在pH 4和10时的比活性不算特别高，但在这些pH条件下暴露一定时间后仍保留超过50%的残余活性。最稳定的pH值与最适反应pH一致，在此条件下残余活性可达80%。
热稳定性结果如图3D所示。本研究在30–70°C范围内、1至12 h时长内考察了CLPG的温度稳定性。结果表明，当反应温度设定为30°C时，CLPG在12 h后保留约90%的初始活性。在最适反应温度下，CLPG在12 h孵育后残余活性约为75%。Long等分离的新型蛋白谷氨酰胺酶FBPG在其最适反应温度40°C下约4 h后仅保留约40%活性。然而在60°C下，仅1 h后酶活性就只剩20%，70°C下同一时间内降至仅5%，表明活性几乎完全丧失。
金属离子对CLPG活性的影响研究表明，Mg²⁺、Ca²⁺、Li⁺、Ni²⁺和Ba²⁺表现出轻微促进作用，而Fe³⁺和Cu²⁺对CLPG活性有不同程度的抑制作用（图3E）。
以不同浓度配制底物Cbz-Gln-Gly溶液以测定CLPG的反应动力学参数。采用双倒数作图和非线性回归拟合两种方法计算Km和转换数Kcat值，如图3F所示。CLPG的Km和Vmax分别为69.3 mM和111.5 U/mg。Kcat为228.2 min⁻¹，Kcat/Km为3.3 min⁻¹·mM⁻¹。
【数据】最适pH：5.0；最适温度：50°C；pH 4–6相对活性>50%；pH 4–10稳定（残余活性>50%）；最稳定pH下残余活性达80%；30°C孵育12 h残余活性约90%；50°C孵育12 h残余活性约75%；60°C残余活性<20%；70°C 1 h残余活性5%；Km：69.3 mM；Vmax：111.5 U/mg；Kcat：228.2 min⁻¹；Kcat/Km：3.3 min⁻¹·mM⁻¹
3.4 CLPG介导的KPI改性
#### 3.4.1 DKPI的脱酰胺度和水解度
采用不同剂量的CLPG催化KPI脱酰胺以改善其性能。反应1 h后，不同酶底比（Control、0.1 U/g、0.5 U/g、1.0 U/g和3.0 U/g）处理样品的脱酰胺程度分别为0.1%、2.3%、10.6%、15.2%和21.7%（图4A），呈现剂量依赖性增加。这进一步证实所采用的温和热处理条件对酰胺基影响可忽略不计。如图4B所示，所有处理的水解度均低于0.7%，突显了CLPG对谷氨酰胺残基的高度特异性及其极低的蛋白水解活性。
【数据】脱酰胺度：0.1%（Control）、2.3%（0.1 U/g）、10.6%（0.5 U/g）、15.2%（1.0 U/g）、21.7%（3.0 U/g）；水解度：均<0.7%；反应时间：1 h
#### 3.4.2 DKPI的浊度和表面疏水性
浊度测定（图4C）显示，随着脱酰胺度增加，蛋白浑浊度显著降低，数值从2.2降至1.8。这一效应可能归因于带负电荷羧基的引入增强了蛋白质-水相互作用。
表面疏水性是蛋白质重要的结构特性。在蛋白质三维结构中，非极性氨基酸残基分布于分子表面，这些暴露的疏水结构域通过疏水相互作用影响蛋白质性质。CLPG处理KPI的表面疏水性分析如图4D所示。所有DKPI样品均表现出比天然KPI更高的溴酚蓝结合能力，结合量从初始的42.1 μg增加至最大值90.1 μg，增幅达114%。
【数据】浊度：2.2降至1.8；溴酚蓝结合量：42.1 μg增至90.1 μg（增幅114%）
#### 3.4.3 DKPI的粒径、Zeta电位和结构分析
（原文此部分内容在节选中截断，后续结果未完整提供。）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究成功建立了一种基于Lpp-OmpA细胞表面展示的蛋白谷氨酰胺酶一步纯化方法，将传统多步纯化流程简化为"收集菌体—胰蛋白酶切割—单轮亲和纯化—单次超滤"四个环节。酶学表征显示CLPG在pH 5.0和50°C下活性最高，且在50°C下12 h仍保留约75%活性，优于已报道的同类酶FBPG。应用层面，CLPG介导的脱酰胺改性有效提升了KPI的乳化性和起泡性，在酶用量1.0 U/g时乳化性达到最大值23%，表面疏水性增加114%。
研究也存在局限。原文讨论部分明确指出：结构-功能定量关联和深层机制探索未纳入当前研究范围；流变学特性、消化率和生物利用度等关键指标未考察；酶的适用性仅在纯实验室体系中验证，缺乏真实食品基质中的检验。后续研究将建立改性蛋白结构变化与功能提升间的定量关联，补充流变学分析和消化率评价，并在真实食品体系中验证工业应用潜力，同时借助分子模拟阐明酶介导蛋白改性的分子机制。
编译者解读：该研究的核心价值在于用细胞表面展示技术重构了蛋白谷氨酰胺酶的制备流程——把"破碎-纯化-激活-再纯化"的冗长链条压缩为分泌型激活的一步操作，这种思路对同类酶的产业化制备具有直接借鉴意义。脱酰胺改性提升磷虾蛋白乳化性的数据也支持"电荷排斥+疏水暴露"的协同机制。不过，Km值69.3 mM偏高，意味着该酶对底物亲和力并不算强；乳化性23%的绝对值是否足以支撑实际食品应用，仍需在真实体系中检验。从合成生物学角度看，将展示系统与酶工程结合、进一步定向进化提升催化效率，是自然的延伸方向。
参考来源
Zhang J, Zhang Y, Wang T, Li X, An X. Purification of Protein Glutaminase by Cell Surface Display and Krill Protein Modification via Deamidation. Foods. PMID: 42354075.
PMID: 42354075