来源：Mutagenesis and Analysis for Enhancing (2R,3R)-2,3-Butanediol Tolerance and Production in Corynebacterium glutamicum.（Molecules）| 编译：DNA Lab Space
导读
2,3-丁二醇是重要的平台化学品，微生物发酵生产面临高浓度产物抑制的瓶颈。本研究以代谢工程菌株CGK4为对象，采用常压室温等离子体（ARTP）诱变结合基因组重测序与反向代谢工程，筛选出耐受性与产量协同提升的优良突变株。通过解析19个SNV/InDel突变的功能，鉴定出2个耐受性相关和7个产量相关有益突变，并经组合优化构建了高产菌株K4-cobT-ctaE，摇瓶补料发酵产量达84.35 g/L，较亲本菌株提高38.3%。
研究背景
2,3-丁二醇（2,3-BD）存在三种立体异构体：(2R,3R)-、(2S,3S)-和内消旋型。作为一种大宗化学品，它是多种化合物的关键合成中间体，广泛用作燃料添加剂、防冻剂和植物生长调节剂，应用前景广阔。传统2,3-BD生产依赖石油基化学合成，能耗高、成本高且污染环境，可持续的微生物发酵生产因此受到日益关注。目前已在克雷伯氏菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、酿酒酵母和大肠杆菌等宿主中实现了2,3-BD的生物合成。
谷氨酸棒杆菌作为公认安全（GRAS）微生物，相比其他底盘菌株具有更好的生物安全性、稳健性和更广的碳源利用范围。前期研究通过异源途径整合和系统代谢工程构建了工程菌株CGK4，实现了(2R,3R)-2,3-BD在谷氨酸棒杆菌中的生物合成。然而，与多数现有研究一致，高浓度2,3-BD发酵受产物抑制限制，阻碍了产量的进一步提高。因此，提升产物耐受性是突破产量瓶颈的关键策略。
研究方法
4.1 菌株与培养基
本研究所用菌株和质粒列于补充表S1。E. coli DH5α用于质粒构建，在LB培养基中培养。BHI和CGIII培养基分别用于谷氨酸棒杆菌的预培养和种子培养。固体平板培养基为添加2%（w/v）琼脂的BHI。CGXIIP培养基用于摇瓶2,3-BD耐受性测试和孔板耐受性筛选。补料分批发酵在LBRC-205培养基中进行，该培养基由LBRC培养基改良而来——玉米浆干粉从5%降至2%，酵母提取物从1%降至0.5%（均为w/v）。根据需要添加葡萄糖作为初始或补充碳源。抗生素按文献[54]方法添加。考虑到2,3-BD立体异构体的细胞毒性差异，本研究仅使用(2R,3R)-2,3-BD，后文所述2,3-BD耐受性或筛选均指该异构体。
【数据】培养基：LB、BHI、CGIII、CGXIIP、LBRC-205；琼脂：2%（w/v）；玉米浆干粉：2%；酵母提取物：0.5%；2,3-BD异构体：(2R,3R)-型
4.2 质粒与菌株构建
本研究所用引物列于补充表S2。谷氨酸棒杆菌中的所有染色体重组（包括碱基替换和基因缺失）均使用自杀质粒pD-sacB构建。
向内源基因atpG引入突变时，按如下步骤构建质粒pD-sacB-atpG：以谷氨酸棒杆菌L1基因组DNA为模板，使用引物对atpG-F和atpG-R通过PCR扩增atpG位点突变两侧的同源臂（该突变涉及第749位核苷酸T至C的替换）。使用引物pD-F和pD-R通过PCR将pD-sacB质粒线性化。利用无缝组装将含有等位替换位点的DNA片段与线性化质粒片段连接，构建pD-sacB-atpG。其他核苷酸突变质粒的构建方法与此类似。
【数据】突变类型：atpG第749位核苷酸T→C；组装方法：无缝组装；载体：pD-sacB
4.3 ARTP诱变与筛选
预培养至OD600为8–10后，取10 μL经PBS十倍稀释的CGK4细胞悬液（10⁷–10⁸个/mL）置于诱变载台上。ARTP诱变系统（Tmaxtree，无锡，中国）的射频功率为120 W。工作气体为氦气（纯度≥99.9%），流量为10标准升/分钟（SLM）。致死率测定时，诱变时间设为0、30、60、90、120和150 s。处理后的样品转移至990 μL PBS中，稀释10³倍后涂布于BHI固体培养基，30°C培养48 h以计算致死率。
突变文库构建时，诱变时间为120 s。ARTP诱变后，处理样品涂布于含8%（w/v）2,3-BD的BHI固体平板。培养7天后，随机挑选大单菌落接种至含5 mL CGXIIP培养基（含2%（w/v）葡萄糖和6%（w/v）2,3-BD）的24深孔板中。500 rpm培养48 h后测定OD600和2,3-BD浓度。产量排名前25%的突变株用相同流程复筛，每株设置三个重复。所有培养均在30°C下进行。
【数据】ARTP功率：120 W；氦气流量：10 SLM；诱变时间：0–150 s（致死率）/ 120 s（建库）；筛选压力：8% 2,3-BD平板 + 6% 2,3-BD液体；培养条件：30°C、500 rpm、48 h；细胞浓度：10⁷–10⁸个/mL
4.4 基因组DNA测序
亲本菌株CGK4及突变株L1、L5、L9的基因组由GENEWIZ（苏州，中国）分别采用Illumina HiseqXten/Novaseq/MGI2000系统进行重测序。SNV/InDel检测使用Sentieon BWA软件，以NCBI数据库中谷氨酸棒杆菌ATCC 13032参考基因组（RefSeq: GCF_000011325.1）为参照。其他基因测序由Azenta（天津，中国）完成。
【数据】测序平台：Illumina HiseqXten/Novaseq/MGI2000；参考基因组：ATCC 13032（GCF_000011325.1）；比对软件：Sentieon BWA
4.5 培养条件
谷氨酸棒杆菌的复苏、预培养和种子培养按文献[54]方法进行。
平板耐受性测试：预培养细胞稀释10⁶倍，取100 μL涂布于含梯度浓度2,3-BD（0、20、40、60、80、100 g/L）的平板上，培养1至10天。
摇瓶耐受性测试：种子液以初始OD600为1接种于含25 mL CGXIIP培养基（含4%（w/v）葡萄糖和特定浓度2,3-BD）的100 mL摇瓶中，180 rpm培养24 h。统一采用24 h时的OD600值作为菌株2,3-BD耐受性指标。
补料分批发酵：种子液以初始OD600为1接种于含50 mL LBRC-205培养基（含12%（w/v）葡萄糖）的250 mL摇瓶中，180 rpm培养120 h。补加100%葡萄糖储液以维持葡萄糖浓度在1%–5%之间。
遗传稳定性验证：突变株在含2%（w/v）葡萄糖的CGIII培养基中220 rpm培养，每12 h转移1 mL培养物至新鲜培养基。该过程重复十次，每代菌株均保存并随后进行补料分批发酵。摇瓶实验均设三个重复。所有培养均在30°C下进行。
【数据】平板耐受测试：稀释10⁶倍、涂布100 μL、2,3-BD梯度0–100 g/L、培养1–10天；摇瓶耐受测试：初始OD600=1、25 mL/100 mL瓶、4%葡萄糖、180 rpm、24 h；补料发酵：初始OD600=1、50 mL/250 mL瓶、12%葡萄糖、180 rpm、120 h、葡萄糖维持1%–5%；稳定性传代：220 rpm、每12 h传代、共10代；温度：30°C
4.6 凋亡与活力测定
将1 mL预培养的种子液转移至含25 mL CGXIIP培养基（含0.5%（w/v）葡萄糖和60 g/L 2,3-BD）的100 mL摇瓶中，180 rpm、30°C培养。对数期细胞（OD600为1.6–1.8）经12,000 rpm、4°C离心10 min收集，PBS洗涤后重悬。避光条件下，取500 μL稀释样品与500 μL 20 μg/mL PI或10 μM FDA混合，37°C孵育30 min。洗涤后用Infinite E Plex酶标仪（Tecan，Grödig，奥地利）测定荧光和吸光度。其他细节参照PI（源叶，上海，中国）和FDA（翊圣，上海，中国）试剂盒说明书。
【数据】培养体系：25 mL CGXIIP + 0.5%葡萄糖 + 60 g/L 2,3-BD；收集条件：12,000 rpm、4°C、10 min；PI浓度：20 μg/mL；FDA浓度：10 μM；染色条件：37°C、30 min；细胞OD600：1.6–1.8
4.7 分析方法
菌体生长通过TU-1901紫外可见分光光度计（普析通用，北京，中国）测定600 nm处光密度（OD600）确定。发酵液样品12,000×g离心10 min收集上清。葡萄糖浓度用SBA生物分析仪（山东省科学院，济南，中国）测定。代谢物浓度由LC-20AR XR高效液相色谱系统（岛津，京都，日本）配HPX-87H有机酸分析柱（Bio-Rad，上海，中国）测定。色谱分离条件：5 mM H₂SO₄等度洗脱，流速0.5 mL/min，柱温60°C，进样量10 μL。
【数据】离心：12,000×g、10 min；HPLC条件：5 mM H₂SO₄、0.5 mL/min、60°C、进样10 μL
4.8 统计分析
所有实验均独立进行三次重复。数据以平均值±标准差（SD）表示。标准差使用STDEV函数计算。统计学显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Tukey事后检验确定。显著性水平标注为（p < 0.05）、（p < 0.01）和（p < 0.001）。字母标记法中，不共享同一字母的平均值间差异显著（p < 0.05）。
【数据】重复次数：3；统计方法：one-way ANOVA + Tukey事后检验；显著性阈值：p < 0.05、p < 0.01、p < 0.001
研究结果
2.1 高浓度2,3-丁二醇对谷氨酸棒杆菌的胁迫效应
为评估2,3-BD对谷氨酸棒杆菌的胁迫作用并确定ARTP诱变的筛选条件，在平板和摇瓶两种体系中测定了亲本菌株CGK4的2,3-BD耐受性。不同2,3-BD浓度平板上的生长情况见补充图S1。随着2,3-BD浓度升高，细胞生长受到逐步抑制，表现为菌落数量减少和生长速率下降。在80 g/L 2,3-BD条件下，菌落仅在7天后出现，且数量极少。在100 g/L时完全无生长。上述结果表明，80 g/L接近亲本菌株的耐受极限，即为最小抑制浓度。因此，该浓度被选为ARTP诱变后平板筛选的严格筛选压力，用以分离具有增强耐受性的稀有突变株。
在2,3-BD浓度递增的摇瓶培养中，CGK4的生长和葡萄糖消耗均受到渐进性抑制（图2A,B）。在60 g/L 2,3-BD下，代谢活性受到显著抑制，2,3-BD积累量逐渐下降（图2C）。在40 g/L时，菌株开始消耗2,3-BD，推测这是一种保护机制——通过将2,3-BD转化为乙偶姻来缓解毒性。这一推测得到了乙偶姻积累量逐渐增加的支持（图2D）。在80 g/L时，菌株生长受到严重抑制，葡萄糖利用和代谢物转化均基本停滞。60 g/L时，2,3-BD抑制了生长和产物合成但未完全阻断生理活性，表明这一亚致死浓度保留了区分优良突变株的筛选窗口。因此，60 g/L被选为液体培养中突变株耐受性筛选的合适浓度。
【数据】2,3-BD浓度梯度：0、20、40、60、80、100 g/L；最小抑制浓度：80 g/L（平板）/ 60 g/L（液体筛选）；100 g/L时无生长；40 g/L时开始消耗2,3-BD并积累乙偶姻
2.2 菌株CGK4的ARTP诱变与筛选
强化产物耐受性以提升细胞工厂的生产性能是一种实用且有效的策略。ARTP诱变中约90%的致死率与最大突变多样性和最佳正突变获取率相关。CGK4经ARTP处理，暴露时间分别为0、30、60、90、120和150 s，并测定相应致死率。当暴露时间达到120 s时，致死率为92.4%（补充图S2）。据此，CGK4在120 W、10 SLM、120 s的优化条件下进行ARTP诱变，以获得富含2,3-BD耐受性和产量改良的突变文库。
ARTP诱变后，所得菌株在高2,3-BD胁迫下的生长和产量表现出显著差异，有利于高性能突变株的筛选。从ARTP诱变文库中，利用含80 g/L 2,3-BD的平板初筛获得240个单菌落。随后将单菌落接种至含60 g/L 2,3-BD的24深孔板中，发酵结束后测定OD600和2,3-BD滴度（补充图S3A）。选择2,3-BD积累量最高的前60个突变株进行深孔板二轮筛选，每株三个平行重复（补充图S3B）。其中2,3-BD滴度最高的10个突变株被选为最终测试的候选菌株。
【数据】致死率：120 s时92.4%；诱变条件：120 W、10 SLM、120 s；初筛菌落数：240个；初筛压力：80 g/L 2,3-BD平板；复筛压力：60 g/L 2,3-BD液体；二筛株数：60株；候选株数：10株
2.3 突变株的发酵评价
10个突变株命名为L1至L10，在摇瓶中系统评价了其耐受性、产量和稳定性。所有10株突变株在胁迫下的OD600较亲本增加了15%以上，葡萄糖消耗速率呈现类似趋势（图3A）。结果表明，ARTP诱变成功提高了菌株在高2,3-BD条件下的耐受性和代谢活性。值得注意的是，L7和L10在胁迫下的OD600分别比CGK4高95.6%和91.5%，且两株的葡萄糖消耗速率均提高了170%以上。
此外，持续时间更长的补料分批发酵可获得更高的2,3-BD滴度，更适合评价菌株在持续发酵中的综合性能（补充图S4）。6株突变株的2,3-BD产量较CGK4提高超过10%（图3B）。其中L1、L5和L9分别产2,3-BD 72.96 ± 3.38、72.10 ± 1.04和69.86 ± 2.72 g/L，分别提高了21.4%、20.0%和16.2%。综合来看，L1、L5和L9的耐受性增强了25%至40%，验证了提高产物耐受性可有效促进产物合成。相比之下，虽然L7和L10表现出最显著的耐受性增强，但其产量水平反而下降。已有研究表明，酵母耐受性的过度增强可能导致发酵性能下降。因此推测，在一定范围内2,3-BD产量与耐受性呈正相关，但超过某一阈值后，过度耐受反而损害产量。适度增强耐受性可能更有利于2,3-BD合成。
L1、L5和L9的遗传和产量稳定性通过连续传代和重复发酵进行了验证。传代10代后，2,3-BD产量与原始菌株保持相近（补充图S4D），未检测到回复突变，表明这些菌株在连续传代条件下具有良好的产量稳定性。
【数据】耐受性提升范围：OD600增加15%以上（全部10株）；L7 OD600较CGK4高95.6%；L10 OD600较CGK4高91.5%；L7/L10葡萄糖消耗速率提高>170%；L1产量：72.96 ± 3.38 g/L（+21.4%）；L5产量：72.10 ± 1.04 g/L（+20.0%）；L9产量：69.86 ± 2.72 g/L（+16.2%）；耐受性增强幅度：25%–40%；传代次数：10代
2.4 反向工程验证与突变分析
利用基因组学获取突变株的遗传变异信息，对于扩展菌株的基因组知识并将其应用于不同菌株至关重要。对三株产量最高的突变株L1、L5和L9进行了基因组重测序。与亲本菌株CGK4的比较基因组分析显示，三株突变株基因组中共有19个SNV/InDel突变（表1）。ARTP诱变倾向于产生多样化的SNV和小型InDel，从而有效改善菌株性状。根据细胞功能对突变进行功能注释和分类后发现，这些突变主要富集于能量代谢、氨基酸代谢、辅因子代谢、膜蛋白以及核酸代谢与修复相关基因中（图4A）。结果表明，这些基因类别的突变可能在增强2,3-BD产量或耐受性方面发挥关键作用。
考虑到并非所有突变都有效，采用反向代谢工程在CGK4中逐一重建每个突变，构建了19个单突变菌株以探究基因型与表型之间的关系。ctaD位点的移码突变严重阻碍了正常蛋白表达，因此直接敲除ctaD基因以验证该突变的效果。在初始含60 g/L 2,3-BD的摇瓶发酵中测试了每个单突变对耐受性的影响。结果显示，atpGL250P和ΔctaD突变显著提高了单突变菌株的2,3-BD耐受性，胁迫下OD600分别比CGK4高58.9%和52.2%（图4B）。其他突变对耐受性的影响较小或为负面影响。
随后，将所有单突变菌株进行摇瓶补料分批发酵，评价各单突变对2,3-BD合成的影响。共鉴定出7个显著提高2,3-BD产量的有益突变，包括atpGL250P、cobTV192V、Cgl0464R14Q、ctaEL79P、Cgl0735L506L、Cgl1912M152I和ΔctaD（图4C）。其中atpGL250P、cobTV192V和ctaEL79P的效果最为显著。携带这些突变的单突变菌株分别产2,3-BD 74.95、72.73和73.53 g/L，分别比CGK4提高18.0%、14.5%和15.0%。
【数据】突变总数：19个SNV/InDel（L1、L5、L9）；有益突变：耐受性2个（atpGL250P：OD600+58.9%；ΔctaD：OD600+52.2%）；产量7个（atpGL250P：74.95 g/L，+18.0%；cobTV192V：72.73 g/L，+14.5%；ctaEL79P：73.53 g/L，+15.0%）；ctaD处理方式：直接敲除
讨论与解读
工业发酵中，高水平的2,3-BD生产面临产物毒性的挑战。由于基因编辑工具的限制和对微生物基因组认识的不足，传统的理性代谢工程方法往往效果有限，难以全面改善细胞工厂性能。本研究通过ARTP诱变、基因组分析和反向工程相结合的策略，在谷氨酸棒杆菌中提升了产物耐受性，并构建了高产2,3-BD菌株K4-cobT-ctaE，同时鉴定出多个高效的抗逆和产量相关突变靶点。菌株K4-cobT-ctaE在120 h摇瓶补料分批发酵中产(2R,3R)-2,3-BD达84.35 ± 3.04 g/L，达到理论产率的89.4%（表2）。
通过评价亲本菌株CGK4的耐受性，证实了高浓度2,3-BD显著抑制细胞生长和代谢活性。随着2,3-BD浓度升高，生长和葡萄糖消耗速率逐渐减缓。此外，当浓度超过某一阈值（40 g/L）时，菌株开始消耗2,3-BD并将其转化为乙偶姻（图2C,D）。推测这是一种菌株为缓解毒性而采取的保护机制。Okonkwo曾报道，2,3-BD向乙偶姻的逆转是Paenibacillus polymyxa的一种主动解毒响应。这种行为可能有助于减轻2,3-BD胁迫，或者胁迫可能改变了胞内代谢通量。
【数据】K4-cobT-ctaE产量：84.35 ± 3.04 g/L（120 h）；理论产率：89.4%；产量提升：较亲本提高38.3%；2,3-BD转化乙偶姻阈值：40 g/L
编译者解读：本研究展示了"非理性诱变+组学解析+反向工程"策略在解决发酵生产中产物抑制问题上的强大效力。ARTP诱变产生的高通量突变库结合严格的产物耐受性筛选，有效突破了理性设计难以预见的复杂表型改良瓶颈。值得注意的是，研究揭示的"耐受性与产量非线性相关"现象对菌株工程具有警示意义——过度追求单一性状可能适得其反。该方法论为其他面临产物毒性问题的生物制造体系提供了可借鉴的通用范式，但ARTP诱变的随机性意味着后续仍需大量筛选工作，且部分有益突变的作用机制尚待深入解析，这为未来将突变靶点与代谢调控网络关联研究留下了空间。
参考来源
Liu Z, Cui H, Jiang Y, Wang Z, Chen T. Mutagenesis and Analysis for Enhancing (2R,3R)-2,3-Butanediol Tolerance and Production in Corynebacterium glutamicum. Molecules. PMID: 42588560.
PMID: 42588560