来源：Identification and Functional Characterization of the GPAT Gene Family in Regulating Oil Biosynthesis in Olive.（Plants (Basel)）| 编译：DNA Lab Space
导读
油橄榄是世界四大木本食用油料作物之一，其油脂品质与GPAT（甘油-3-磷酸酰基转移酶）基因家族密切相关。本研究在全基因组水平上系统鉴定了12个油橄榄OeGPAT基因，通过系统发育、染色体定位、启动子元件分析及异源表达等手段，筛选出7个核心候选基因。在烟草、拟南芥及油橄榄果实中的过表达与沉默实验一致表明，OeGPATs可显著提升总油脂含量，为油料作物代谢工程改良提供了理想靶点。
研究背景
油橄榄（Olea europaea L.）是木犀科木犀榄属常绿乔木，为二倍体物种（2n=2x=46），位列世界四大木本食用油料作物。经过60余年引种栽培，油橄榄已在中国形成成熟产业。据《中国油橄榄产业发展蓝皮书（2024）》，全国油橄榄种植面积从2018年的135万亩增至2024年底的218万亩，六年增长约60.6%。2024年鲜果产量达10.8万吨，橄榄油产量超过1.2万吨，国产橄榄油市场份额显著上升。然而，与世界主要油橄榄生产国相比，中国油橄榄产业在规模与经济效益上仍有明显差距。
橄榄油富含不饱和脂肪酸、维生素和多酚等生物活性成分，具有很高的营养与药用价值。GPAT作为催化三酰甘油合成途径中第一个限速步骤的关键酶，在油料作物油脂合成中发挥重要作用。前期研究通过转录组与代谢组联合分析，已将GPAT4鉴定为油橄榄果实油脂生物合成的关键调控基因，但GPAT基因家族在油橄榄中的整体功能仍不清楚。
研究方法
4.1 植物材料与培养条件
本研究以四川省金堂县果园的主栽油橄榄品种‘Arbequina’为研究对象。本氏烟草（Nicotiana benthamiana）用于瞬时与稳定遗传转化，拟南芥（Arabidopsis thaliana）用于稳定转化。转基因植株在温室中培养，长日照条件（16小时光照/8小时黑暗），温度22°C。基因表达分析取材自4周龄T3代拟南芥过表达株系的叶片。实验材料（本氏烟草、拟南芥和油橄榄果实）由四川省林业科学研究院经济林研究所提供。参照国际油橄榄理事会（IOC）建议并结合‘Arbequina’品种成熟特性，果实成熟阶段划分如下：阶段II以黄绿色果皮为特征；阶段III以部分紫色或浅红色果皮为特征；阶段IV以大部分紫色或深红色果皮为特征。
【数据】物种：油橄榄‘Arbequina’、本氏烟草、拟南芥；光照：16h/8h；温度：22°C；取样：4周龄T3代拟南芥
4.2 OeGPAT基因家族成员的鉴定与理化性质分析
油橄榄、芝麻和黄豆的基因组序列与注释文件从NCBI数据库获取，拟南芥相应数据从TAIR数据库获取。以已知拟南芥GPAT蛋白序列为参照，利用隐马尔可夫模型（HMM）对油橄榄基因组进行搜索以鉴定推定OeGPAT基因。候选基因通过Batch CD-Search工具验证保守OeGPAT结构域。经确认的油橄榄GPAT蛋白理化性质（等电点pI、分子量MW、亲水性平均值GRAVY、不稳定指数）使用ExPASy蛋白质组学服务器预测。
【数据】数据库：NCBI、TAIR；工具：HMM搜索、Batch CD-Search、ExPASy；访问时间：2026年7月20日
4.3 OeGPAT基因家族系统发育分析
从TAIR数据库获取拟南芥PAT家族成员蛋白序列及保守结构域信息。使用MUSCLE v5.1软件对油橄榄与拟南芥GPAT蛋白保守结构域进行多序列比对。基于比对结果，采用IQ-TREE 3.1.3软件中的最大似然法构建系统发育树，分支支持率通过1000次bootstrap重复评估。树形使用iTOL在线平台可视化和注释。
【数据】软件：MUSCLE v5.1、IQ-TREE 3.1.3；bootstrap：1000次；可视化：iTOL v6
4.4 染色体定位、基因结构与启动子顺式作用元件分析
油橄榄GPAT家族蛋白保守结构域的多序列比对使用DNAMAN 10.3和Jalview 2.11软件完成。基因结构通过GSDS数据库预测分析，基因结构信息从基因组注释文件中提取并使用TBtools-II软件可视化。保守基序和结构域使用MEME在线工具和InterPro数据库分析，基序数量设置为10。从油橄榄基因组中提取每个GPAT家族基因起始密码子上游2000 bp序列作为启动子，提交至PlantCARE网站预测顺式作用元件，结果用TBtools-II可视化。
【数据】启动子区域：2000bp；基序数量：10；软件：DNAMAN 10.3、Jalview 2.11、TBtools-II、MEME、PlantCARE
4.5 染色体定位与共线性分析
OeGPAT基因家族成员的染色体定位信息和各染色体长度通过筛选油橄榄基因组注释文件获得。使用MG2C在线工具进行可视化，调整相关参数优化布局。共线性分析使用TBtools软件中的MCScanX工具，鉴定共线性基因对和串联重复基因对，结果用TBtools可视化。
【数据】工具：MG2C、MCScanX、TBtools
4.6 基因克隆与重组载体构建
基于7个NtGPAT和OeGPAT基因的编码区（CDS）序列设计特异性引物，以烟草叶片和油橄榄果实cDNA为模板。PCR扩增使用2×TransStart® FastPfu Fly PCR SuperMix（AS231，北京全式金生物）。扩增的CDS片段分别连接到组成型植物表达载体PLGN中。重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，阳性克隆经PCR和测序鉴定，确认的重组质粒随后导入农杆菌GV3101用于拟南芥和烟草遗传转化。
基于在线SGN VIGS工具选择烟草叶片和油橄榄果实GPATs的最佳基因沉默序列，使用Primer Premier 5软件设计上下游引物。TRV2载体质粒先用EcoRI和BamHI限制性内切酶线性化，目标基因片段通过一步克隆法连接到线性化载体中，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂板培养后挑取单菌落接种液体培养基扩繁。
【数据】PCR酶：2×TransStart® FastPfu Fly PCR SuperMix；宿主菌：E.coli DH5α、农杆菌GV3101；限制酶：EcoRI、BamHI；载体：PLGN、TRV2
4.7 本氏烟草与拟南芥稳定转化
重组质粒通过农杆菌介导法导入无菌本氏烟草叶盘。转化芽在含潮霉素B（5 mg L⁻¹）或草铵膦（PPT，1 mg L⁻¹）的培养基上筛选。拟南芥采用花序浸蘸法将双元载体导入EV植株（Col-0）。T0种子在蓝光下根据绿色荧光蛋白荧光筛选阳性转化体，阳性株系通过PCR基因分型确认。转基因植株在基因组和转录水平经PCR验证。最后，生根的阳性纯合烟草植株和确认的拟南芥植株移栽至育苗基质中继续培养，用于后续总油脂含量分析。
【数据】潮霉素B：5 mg L⁻¹；草铵膦：1 mg L⁻¹；转化方法：叶盘法、花序浸蘸法；筛选：蓝光下GFP荧光
4.8 本氏烟草与油橄榄果实瞬时转化
TRV2载体、TRV2-GPATs构建体和TRV1载体分别导入农杆菌EHA105。含表达载体的农杆菌在添加50 μg/mL卡那霉素、50 μg/mL利福平和50 μg/mL链霉素的LB培养基上培养，28°C、200 rpm振荡约16小时至OD600达2.0。菌体5000 rpm离心10分钟收集，弃上清，沉淀用新鲜配制的MMA缓冲液（10 mM MgCl₂、10 mM MES/KOH pH 5.6、150 μM乙酰丁香酮）重悬，稀释至OD600为0.4。
选取具有四片真叶的烟草幼苗，将混合农杆菌悬浮液（TRV2+TRV1，或TRV2-GPATs+TRV1）注入烟草叶片。油橄榄果实的瞬时转化采用真空渗透法，将成熟阶段II、III和IV的油橄榄果实浸入农杆菌悬浮液中，真空渗透处理。
【数据】抗生素：50 μg/mL卡那霉素、50 μg/mL利福平、50 μg/mL链霉素；培养：28°C、200rpm、16h；OD600：2.0→0.4；离心：5000rpm、10min；MMA缓冲液：10mM MgCl₂、10mM MES/KOH pH5.6、150μM乙酰丁香酮
研究结果
2.1 OeGPAT4：调控油橄榄油脂代谢与品质的关键基因
前期未发表研究中，对5个油橄榄品种不同成熟阶段进行了广泛的靶向代谢组学和Illumina RNA-seq分析，以探究油脂合成与相关基因表达的关系。结果表明，‘Arbequina’品种在成熟阶段III的总油脂积累量显著高于其他品种及其他成熟阶段。
整合转录组与脂质组分析显示，OeGPAT4在两个比较组间差异表达，与油橄榄油脂代谢密切相关，尤其是甘油磷脂合成。该基因的表达模式具有阶段特异性：与阶段II相比在阶段III上调，与阶段III相比在阶段IV下调，提示其在成熟过程中介导油脂代谢差异的潜在作用。OeGPAT4调控磷脂酰胆碱（PC）合成，从而影响膜脂组成和脂质前体供应，为甘油三酯组装提供不饱和酰基，是连接膜脂代谢与储藏油脂生物合成的关键节点。OeGPAT4的差异表达可能是成熟阶段III与其他阶段油脂品质差异的重要分子机制。因此，OeGPAT4是调控油橄榄油脂代谢或品种改良的候选基因，研究进一步对其基因家族进行了全面分析。
【数据】品种：‘Arbequina’；阶段III总油脂积累量显著高于其他品种和阶段；OeGPAT4在阶段III上调、阶段IV下调
2.2 油橄榄GPAT基因家族分析
基于上述发现，进一步对油橄榄GPAT基因家族进行了全基因组鉴定和系统分析。使用DNAMAN 10.3软件对12个OeGPAT氨基酸序列进行多序列比对。结果显示，12个OeGPAT蛋白均含有GPAT结构域，该结构域占据蛋白序列的大部分（247–288位氨基酸），包含多个高度保守的氨基酸残基，如甘氨酸（G）、丝氨酸（S）和脯氨酸（P）（图1A）。使用MCScanX对油橄榄、拟南芥、枇杷和大豆间的OeGPAT基因家族进行进化同源性分析。灰色区域表示油橄榄与其他物种间不同染色体上的共线性区域，红色区域突出显示OeGPAT基因家族成员特异性的共线性关系。分析鉴定出油橄榄与拟南芥之间1个直系同源基因对，油橄榄与枇杷之间11个直系同源对，油橄榄与大豆之间13个直系同源对（图1B）。
基于拟南芥和油橄榄的GPAT蛋白序列比对，使用MEGA 12.1、trimAl v1.5.1和IQ-tree 3.1.3软件中的最大似然法构建系统发育树。根据拟南芥GPAT基因的既定亚家族分类，12个油橄榄GPAT蛋白被分为四个分支：Class I包含4个OeGPAT蛋白，Class II包含4个成员，Class III包含2个成员，Class IV包含2个成员。LOC111388219被鉴定为OeGPAT4，它催化甘油酯合成途径的第一步，是甘油三酯生物合成途径中的关键酶（图2A）。使用TBtools对油橄榄GPAT基因家族进行染色体定位可视化。基于基因组注释文件（GFF3）分析，8个OeGPAT基因分布在8条染色体上，其余4个OeGPAT基因（包括OeGPAT4，LOC111388219）位于未锚定的scaffold上（图2B）。
保守基序分析显示，12个OeGPAT基因在大多数基序上高度保守。大多数OeGPAT基因包含motif1、motif2、motif3和motif4。某些OeGPAT基因中特定基序的缺失可能源于油橄榄基因组进化过程中的部分丢失。LOC111388219包含大多数OeGPAT基因中存在的四个基序，但缺少motif6和motif8，提示其可能具有独特的生物学功能，可能通过基因复制等遗传事件独立进化，导致基序组成发生变化。结构域分析显示，OeGPAT结构域在大多数基因中的分布相对一致，占据蛋白序列的大部分。基因结构分析表明，OeGPAT基因的外显子数目为1至5个，内含子数目为0至4个。LOC111400001包含一个异常大的内含子，可能在基因结构中发挥重要作用，可能通过增加剪接多样性或含有调控元件来影响基因表达。成员间内含子和外显子数目及分布的差异提示OeGPAT基因家族内部存在分化（图3A）。对位于染色体上的8个OeGPAT基因进行顺式作用元件分析，除基本元件（CAAT-box和TATA-box）外，鉴定出四类主要元件：激素响应元件、光响应元件、胁迫响应元件和生理响应元件。在8个OeGPAT基因中发现了大量光响应元件，其次是厌氧诱导元件，表明这些基因参与光响应调控并受厌氧胁迫影响（图3B）。
【数据】OeGPAT蛋白：12个；GPAT结构域：247–288aa；保守残基：G、S、P；直系同源对：油橄榄-拟南芥1个、油橄榄-枇杷11个、油橄榄-大豆13个；亚家族：4个（Class I-IV各含4/4/2/2个成员）；染色体分布：8条染色体+4个scaffold；外显子数：1–5个；内含子数：0–4个
2.3 选定GPATs的功能调控改变烟草石油醚提取物重量
为初步评估油橄榄OeGPAT基因在异源系统中的功能趋势，以本氏烟草作为瞬时表达平台，调控其内源同源基因NtGPAT的活性。构建了这些基因的组成型过表达载体（图4A）和病毒诱导基因沉默（VIGS）载体（图4B）。随后量化了稳定过表达（图4C）和瞬时沉默（图4D）烟草叶片中NtGPAT1、NtGPAT1-like、NtGPAT4、NtGPAT5、NtGPAT6、NtGPAT7和NtGPAT8的相对表达水平。RT-qPCR结果显示，与空载体（EV）相比，过表达株系中GPATs的表达水平显著升高（图4E–K），而瞬时沉默植株中表达水平显著降低（图4L–R）。这些结果表明，NtGPAT1、NtGPAT1-like、NtGPAT4、NtGPAT5、NtGPAT6、NtGPAT7和NtGPAT8在转化烟草中的表达被有效上调或下调，确认其适用于后续功能验证。
收集过表达或瞬时沉默NtGPAT基因的烟草叶片，分析石油醚提取物重量。结果表明，与EV对照相比，过表达NtGPAT1、NtGPAT1-like、NtGPAT4、NtGPAT7和NtGPAT8的植株叶片中石油醚提取物重量显著升高，增幅约为27.78%–47.06%（图5A–E）。相反，瞬时沉默烟草叶片中石油醚提取物重量显著降低，降幅约为11.35%–22.22%（图5F–J）。然而，烟草中NtGPAT5和NtGPAT6基因的过表达或沉默未导致石油醚提取物重量的显著变化。基于本氏烟草中的筛选结果，其油橄榄直系同源基因——具体为OeGPAT1.1、OeGPAT1.2、OeGPAT2、OeGPAT3、OeGPAT4、OeGPAT7和OeGPAT8——被确定为后续油橄榄功能验证的核心候选基因。
【数据】过表达增幅：约27.78%–47.06%；沉默降幅：约11.35%–22.22%；显著变化基因：NtGPAT1、NtGPAT1-like、NtGPAT4、NtGPAT7、NtGPAT8；无显著变化基因：NtGPAT5、NtGPAT6
2.4 油橄榄GPATs表达特征分析
进一步研究了OeGPAT1.1、OeGPAT1.2、OeGPAT2、OeGPAT3、OeGPAT4、OeGPAT7和OeGPAT8在油橄榄不同组织中的表达模式。结果显示，大多数OeGPAT基因在果实中的表达水平相对较高，表明这些基因可能参与油橄榄果实的油脂合成。在不同成熟阶段的果实中，这些基因的表达呈现动态变化，与油脂积累趋势存在一定相关性（图6A–N）。
【数据】组织表达：果实中相对较高；成熟阶段：动态变化，与油脂积累相关
2.5 OeGPATs在拟南芥中的异源过表达与表达验证
为进一步验证OeGPAT基因的功能，在拟南芥中进行了异源过表达实验。构建了过表达载体（图7A），通过花序浸蘸法转化拟南芥Col-0植株，获得过表达OeGPATs的转基因拟南芥植株（图7B）。RT-qPCR验证了各过表达株系中OeGPATs的相对表达水平（图7C–I），与空载体对照相比，各基因在过表达株系中的表达均显著上调。
【数据】转化方法：花序浸蘸法；受体：拟南芥Col-0；验证方法：RT-qPCR
2.6 OeGPATs过表达增加拟南芥油脂积累
对过表达OeGPATs的拟南芥株系叶片和种子进行油脂含量分析。结果表明，与EV对照相比，过表达OeGPAT1.1、OeGPAT1.2、OeGPAT2、OeGPAT3、OeGPAT4、OeGPAT7和OeGPAT8的拟南芥株系叶片中石油醚提取物重量显著增加（图8A–G），种子总油脂含量也显著提高（图8H–N）。
【数据】叶片石油醚提取物：过表达显著增加；种子总油脂含量：过表达显著提高
2.7 油橄榄果实成熟阶段II瞬时转化后总油脂定量分析
在油橄榄果实成熟阶段II进行瞬时转化实验。图9A展示了EV、TRV-OeGPATs和PLGN-OeGPATs果实的代表性果穗表型。RT-qPCR验证了过表达和瞬时沉默果实中GPATs的相对表达水平（图9B）。总油脂含量定量分析显示（图9C），与EV对照相比，过表达OeGPATs的油橄榄果实总油脂含量显著升高，而瞬时沉默OeGPATs的果实总油脂含量显著降低。
【数据】成熟阶段：II；过表达：总油脂含量显著升高；沉默：总油脂含量显著降低；统计：mean±SD，n≥3，p<0.05
2.8 油橄榄果实成熟阶段III瞬时转化后总油脂定量分析
在油橄榄果实成熟阶段III进行瞬时转化实验。图10A展示了EV、TRV-OeGPATs和PLGN-OeGPATs果实的代表性果穗表型。RT-qPCR验证了过表达和瞬时沉默果实中OeGPATs的相对表达水平（图10B）。总油脂含量定量分析显示（图10C），与EV对照相比，过表达OeGPATs的油橄榄果实总油脂含量显著升高，而瞬时沉默OeGPATs的果实总油脂含量显著降低。
【数据】成熟阶段：III；过表达：总油脂含量显著升高；沉默：总油脂含量显著降低；统计：mean±SD，n≥3，p<0.05
2.9 油橄榄果实成熟阶段IV瞬时转化后总油脂定量分析
在油橄榄果实成熟阶段IV进行瞬时转化实验。图11A展示了EV、TRV-OeGPATs和PLGN-OeGPATs果实的代表性果穗表型。RT-qPCR验证了过表达和瞬时沉默果实中OeGPATs的相对表达水平（图11B）。总油脂含量定量分析显示（图11C），与EV对照相比，过表达OeGPATs的油橄榄果实总油脂含量显著升高，而瞬时沉默OeGPATs的果实总油脂含量显著降低。
【数据】成熟阶段：IV；过表达：总油脂含量显著升高；沉默：总油脂含量显著降低；统计：mean±SD，n≥3，p<0.05
2.10 不同OeGPAT异构体特异性调控转基因拟南芥种子脂肪酸谱
对过表达OeGPATs的转基因拟南芥种子进行了脂肪酸组成分析。图12A–G展示了EV和过表达株系（OE-1、OE-2和OE-3）中主要脂肪酸组分的相对丰度（mol%）。结果表明，不同OeGPAT异构体对脂肪酸谱的调控具有特异性，各过表达株系中某些脂肪酸组分的相对含量发生显著变化。
【数据】脂肪酸组分：主要脂肪酸相对丰度（mol%）；统计：*p<0.05，**p≤0.01（Duncan多重比较）
讨论与解读
前期研究通过广泛的靶向代谢组学和Illumina RNA-seq分析，发现‘Arbequina’品种在成熟阶段III的总油脂积累量显著高于其他品种和阶段，并鉴定出OeGPAT4为油脂合成通路基因，其表达水平与油脂积累呈强正相关。本研究基于油橄榄基因组，鉴定并分离了OeGPAT基因家族成员，包括OeGPAT1.1、OeGPAT1.2、OeGPAT2、OeGPAT3、OeGPAT4、OeGPAT7和OeGPAT8，并在油橄榄果实中验证了其油脂合成生物学功能。
GPAT催化几乎所有植物膜磷脂和储藏甘油三酯生物合成的第一步反应，是关键的限速酶。在植物中，GPAT参与多种甘油酯类的生物合成，包括油聚合物、膜相关脂质和储藏甘油三酯。GPAT基因家族已在多种植物物种中被鉴定，本研究系统解析了油橄榄GPAT家族特征，并通过烟草异源筛选、拟南芥稳定过表达及油橄榄果实瞬时转化三重验证体系，确认了7个OeGPAT基因的正向调控油脂积累功能。过表达OeGPATs在油橄榄果实成熟阶段II、III和IV均显著提高总油脂含量，沉默则导致含量下降，表明OeGPATs可作为代谢工程中调控油料作物油脂含量的理想靶点。
编译者解读：本研究采用"异源快速筛选→模式植物稳定验证→原植物果实瞬时验证"的三级功能验证策略，逻辑清晰且层层递进，在木本油料作物基因功能研究中具有方法论参考价值。烟草瞬时沉默系统的高通量筛选有效缩小了候选基因范围，避免了直接在油橄榄果实中进行大规模操作的困难。值得注意的是，NtGPAT5和NtGPAT6在烟草中未显示出显著表型，这提示同源基因在不同物种中可能存在功能分化。后续若能在油橄榄中实现稳定的遗传转化，将有望进一步推动高油脂油橄榄品种的分子育种进程。
参考来源
Huang S, Wang L, Ye M, Wu W, Luo H. Identification and Functional Characterization of the GPAT Gene Family in Regulating Oil Biosynthesis in Olive. Plants (Basel). PMID: 42588799.
PMID: 42588799