来源：Identification and In Vitro Functional Characterization of the CCR Gene Family Reveals Their Regulatory Roles in Lignin Biosynthesis of Pinus yunnanensis.（Plants (Basel)）| 编译：DNA Lab Space
导读
肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）是木质素单体合成途径的第一个限速酶，在植物木质素生物合成中发挥关键作用。本研究从云南松转录组数据中鉴定出12个CCR家族成员，通过原核表达获得9个可溶性重组蛋白，体外酶活实验证实PyCCR1、PyCCR2、PyCCR5和PyCCR6可催化三种肉桂酰辅酶A底物转化为相应醛类产物。分子对接揭示R(X)5K基序对底物结合至关重要，RT-qPCR显示12个基因在不同组织中呈现差异化表达模式。
研究背景
木质素是地球上第二丰富的天然生物聚合物，全球年合成量约2000亿吨。这种生物聚合物主要沉积在植物次生细胞壁中，赋予植物机械强度、维持维管完整性，并增强对生物和非生物胁迫的抵抗力。木质素聚合物由三种主要单体醇氧化偶联而成：对香豆醇（H单元）、松柏醇（G单元）和芥子醇（S单元）。蕨类植物和裸子植物主要积累含G单元的木质素，而被子植物木质素则以G和S单元为主。
木质素生物合成途经三个相互关联的代谢途径：莽草酸途径合成苯丙氨酸等芳香族氨基酸；苯丙烷代谢途径将苯丙氨酸转化为肉桂酰辅酶A酯；木质素特异途径则将肉桂酰辅酶A酯还原为相应的醛类。CCR正是这一木质素特异途径中的第一个限速酶，其催化肉桂酰辅酶A酯还原为肉桂醛。然而，云南松中CCR基因尚未被表征，其底物特异性不明，限制了对木质素调控机制的深入理解，也制约了木材性质优化策略的制定。
研究方法
2.1 植物材料与试剂
云南松样品于2023年3月1日采集自西南林业大学林学院苗圃（N 25°04′00″，E 102°45′41″，海拔1945 m）。样品为一株生长良好、无病虫害的一年生云南松幼苗。此外，为获得全面的组织表达谱，从同一地理区域生长的成熟云南松树上独立采集了发育中的球果（本研究中称为果实）。FastPure® Universal Plant Total RNA Isolation Kit、HiScript® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）和Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。M-MLV 4 First Strand cDNA Synthesis Kit购自上海Biomed公司。
【数据】采样地点：西南林业大学林学院苗圃；坐标：N 25°04′00″，E 102°45′41″；海拔：1945 m；采样时间：2023年3月1日；样品类型：一年生云南松幼苗、成熟树球果
2.2 云南松CCR基因和蛋白的鉴定与表征
本研究使用的云南松转录组数据集来源于9个RNA-seq样本，包括从一年生云南松幼苗采集的嫩茎、芽和针叶（每种组织三个生物学重复）。为消除组装过程中由可变剪接和测序伪迹造成的冗余，转录本经聚类处理后，仅提取每个簇中最长的代表性转录本，构建非冗余Unigene库。鉴定程序仅在这些unigene上进行。PyCCR基因家族成员的鉴定和筛选基于本课题组先前发表研究中的转录组数据集。以“cinnamoyl-CoA reductase”和“CCR”为查询词搜索Swiss-Prot数据库，保留注释有这些功能的序列ID。同时，使用HMMER构建肉桂酰辅酶A还原酶的隐马尔可夫模型（HMM），对云南松转录组蛋白序列进行BLASTp分析（E值阈值0.001），鉴定云南松候选CCR序列。利用候选CCR基因的登录号从云南松转录组数据中提取相应CDS序列。随后，通过NCBI保守结构域数据库对上述两种方法获得的候选基因进行验证，确认保守结构域，并去除冗余序列。整合筛选结果，获得代表PyCCRs基因的标准化基因片段。使用ExPASy工具测定PyCCRs的理化性质，包括相对分子质量、等电点（pI）以及Arg+Lys和Asp+Glu残基的总和。
【数据】转录组样本数：9个RNA-seq样本；组织类型：嫩茎、芽、针叶；生物学重复：3个；BLASTp E值阈值：0.001；数据库：Swiss-Prot、NCBI Conserved Domain Database
2.3 总RNA提取、RNA反转录和cDNA克隆
使用FastPure® Universal Plant Total RNA Isolation Kit从一年生云南松幼苗中提取总RNA，操作按制造商推荐方案进行。RNA质量通过Nano-500微量分光光度计（杭州奥盛仪器有限公司）测定吸光度及琼脂糖凝胶电泳评估。使用M-MLV 4 First Strand cDNA Synthesis Kit（上海Biomed公司）从RNA合成cDNA，保存于−20°C备用。反转录反应组成见表S1。反应在Touch热循环仪（上海Heal Force公司）中37°C孵育30 min，然后85°C终止10 min。
【数据】反转录温度：37°C；时间：30 min；终止温度：85°C；时间：10 min；cDNA保存温度：−20°C
2.4 云南松CCR多序列比对与系统发育分析
通过BLASTP比对PyCCRs氨基酸序列与NCBI非冗余蛋白数据库，鉴定同源肉桂酰辅酶A还原酶序列。使用DNAMAN 8.0进行多序列比对，随后在MEGA 11.0中采用最大似然算法（LG+G模型，1000次bootstrap重复）构建系统发育树。除模式被子植物（拟南芥、美洲山杨等）中已功能鉴定的CCR和CCR-like序列外，还从NCBI数据库检索了多种裸子植物的代表性CCR候选序列，包括针叶树（火炬松和马尾松）和银杏。系统发育树使用Circle Tree在线工具可视化。
【数据】系统发育树构建方法：最大似然算法；模型：LG+G；bootstrap重复：1000次；比对软件：DNAMAN 8.0；建树软件：MEGA 11.0
2.5 云南松CCR候选基因的克隆与同源重组
使用NCBI ORF Finder分析12个推定肉桂酰辅酶A还原酶基因（PyCCR1~PyCCR12）的编码序列（CDS），鉴定完整开放阅读框（ORF），获得云南松所有CCR家族成员的全长ORF序列。使用SnapGene 6.0针对pET30a（+）多克隆位点（MCS）序列设计含BamHI（GGATCC）和SalI（GTCGAC）酶切位点的引物，用于扩增PyCCR1~PyCCR12基因（表S2）。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司商业合成。
克隆采用CloneExpress II One-Step Cloning Kit（南京诺唯赞公司）按制造商方案进行。RT-PCR扩增使用2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus；南京诺唯赞公司）按制造商方案进行（图S1）。反应体系组成和热循环条件分别见表S3和表S4。pET30a（+）质粒用相应限制性内切酶按表S5指定反应体系酶切。酶切产物纯化后用于后续克隆。同源重组反应按表S5组装。37°C孵育30 min后，反应混合物直接用于转化。
DH5α感受态细胞（Takara，东京，日本）冰上解冻，于−80°C超低温冰箱保存。pET30a（+）质粒与感受态细胞按1:10比例轻轻吹打混匀，冰上孵育30 min。金属浴中42°C热激45 s，随后立即冰浴2–3 min。细胞重悬于400 μL无抗生素LB培养基中，37°C、180 rpm振荡培养1 h。高速离心机5000×g离心5 min。无菌条件下弃上清，将细胞重悬于剩余50 μL培养基中，涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板，用无菌涂布器涂布均匀，parafilm封口，37°C培养12–16 h。阳性克隆经PCR验证（图S2），每个基因三次重复扩增。Sanger测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。
【数据】酶切位点：BamHI（GGATCC）、SalI（GTCGAC）；同源重组孵育：37°C、30 min；热激：42°C、45 s；冰浴：2–3 min；振荡培养：37°C、180 rpm、1 h；离心：5000×g、5 min；平板培养：37°C、12–16 h；感受态细胞：DH5α；抗生素：卡那霉素
2.6 PyCCRs蛋白的异源表达与纯化
云南松PyCCR1~PyCCR12基因克隆和测序成功后，重组pET30a（+）-PyCCR1~PyCCR2质粒经纯化后转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。为优化蛋白诱导条件，考察了IPTG浓度、诱导温度和诱导时间。通过设置不同IPTG浓度和温度梯度，获得最佳诱导浓度和温度。重组大肠杆菌BL21（DE3）菌株在对数中期（OD600 = 0.6–0.8）以0.2 mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达。表达PyCCR1、PyCCR2、PyCCR3、PyCCR5、PyCCR6、PyCCRL7、PyCCRL9和PyCCRL12的培养物在28°C孵育10 h，而表达PyCCR4、PyCCRL8、PyCCRL10和PyCCRL11的培养物在16°C孵育10 h，均伴随振荡培养。
【数据】诱导剂：IPTG；浓度：0.2 mM；诱导时机：OD600 = 0.6–0.8；诱导温度：28°C（PyCCR1/2/3/5/6/L7/L9/L12）或16°C（PyCCR4/L8/L10/L11）；诱导时间：10 h；表达宿主：大肠杆菌BL21（DE3）
研究结果
3.1 云南松CCR基因的鉴定
为系统鉴定云南松CCR基因家族，以特征性保守NAD（P）结合基序（KNWYCYGK）为靶标，对云南松转录组数据库执行了整合关键词筛选、本地BLASTp和基于HMMER的隐马尔可夫模型（HMM）profile搜索的全转录组工作流程。结果汇总为肉桂酰辅酶A还原酶的注释一致性基因片段，在云南松中鉴定出12个CCR家族成员。根据基因ID编号命名为PyCCR1至PyCCRL12（表1）。已鉴定PyCCR基因的开放阅读框（ORF）长度为795至1074 bp，编码264至357个氨基酸残基的蛋白，平均长度为324个氨基酸。预测蛋白分子量为29.69至39.82 kDa，预测等电点（pI）为5.13至8.22（平均值：6.38）。亚细胞定位预测表明云南松CCR家族成员主要定位于细胞质、细胞核和线粒体（表S11）。
【数据】CCR家族成员数：12个；ORF长度范围：795–1074 bp；氨基酸残基数：264–357个；平均氨基酸数：324个；分子量范围：29.69–39.82 kDa；pI范围：5.13–8.22；平均pI：6.38
3.2 云南松CCR的系统发育分析
为阐明PyCCR家族的进化关系和谱系特异性分化，使用来自被子植物和裸子植物15个代表性植物类群的已验证和推定CCR及CCR-like蛋白的全长蛋白序列构建了最大似然（ML）系统发育树（图1）。此外，为解析裸子植物特异性进化轨迹，将火炬松、马尾松和银杏的推定CCR同源序列整合到数据集中。所得系统发育拓扑结构显示，12个候选成员分成两个高度稳健的单系谱系：PyCCR1–PyCCR6与功能性裸子植物直系同源物紧密聚类在真实CCR分支中，而其余成员（PyCCRL7–PyCCRL12）仅分支到CCR-like分支中。
【数据】建树物种数：15个代表性植物类群；候选成员数：12个；主要分支数：2个（CCR分支和CCR-like分支）
3.3 云南松CCR基因编码蛋白的保守结构域
为进一步解析候选成员的结构域架构和序列保守性，将PyCCR1–6和PyCCRL7–12与代表性裸子植物和针叶树直系同源物（包括辐射松、马尾松、火炬松和海南粗榧）进行多序列比对（图2）。蛋白序列分析显示，除PyCCRL8外，所有PyCCRs均具有短链脱氢酶/还原酶（SDR）超家族的标志性特征：Ser-Tyr-Lys（SYK）催化三联体和用于NAD（P）结合的Rossmann折叠结构域。此外，协同促进NAD（P）结合并稳定腺嘌呤结合口袋的核心基序G-X-X-G-X-X-A和D-X-X-D在所有候选成员中严格保守（PyCCRL8和PyCCRL9除外）。值得注意的是，NADP+特异性基序R(X)5K、R(X)6K和R(X)9K仅在真正的CCR分支（PyCCR1–6）中鉴定到，这有力地区分了真正的CCR与其他依赖NAD（H）的SDR家族成员。具体而言，PyCCR1和PyCCR5含有典型的R(X)5K基序，而PyCCR2–4和PyCCR6表现出扩展的空间变体（R(X)6K和R(X)9K），可能调节NADPH结合亲和力。与先前强调CCR特征基序（NWYCYGK）在催化功能中不可或缺作用的研究一致，本比对确认PyCCR1和PyCCR5保留完整的NWYCYGK基序。相反，PyCCR2–4和PyCCR6在第六位显示单氨基酸取代（Y→A），而CCR-like成员（PyCCRL7–12）缺少这一必需结构域。此外，高度保守的H(X)2K基序（代表CCR特异性底物结合基序，CCR-SBM）仅在PyCCR1–6中保留，这是CCR酶活性的绝对先决条件。总之，这些独特的序列特征为将PyCCR1–6归类为真正的CCR提供了令人信服的分子证据，同时将结构发散的PyCCRL7–12区分为CCR-like蛋白。
【数据】保守基序：SYK催化三联体（除PyCCRL8外）、Rossmann折叠结构域、G-X-X-G-X-X-A和D-X-X-D（除PyCCRL8和PyCCRL9外）、R(X)5K/R(X)6K/R(X)9K（仅PyCCR1–6）、NWYCYGK（PyCCR1/5完整，PyCCR2–4/6第六位Y→A）、H(X)2K（仅PyCCR1–6）
3.4 云南松CCR重组蛋白的表达
带有6×His标签的重组蛋白PyCCR1至PyCCRL12通过镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）亲和层析纯化，使用裂解缓冲液中的咪唑梯度洗脱。12个PyCCRs中有9个成功纯化出可溶性蛋白（PyCCR1、PyCCR2、PyCCR5、PyCCR6、PyCCRL7、PyCCRL8、PyCCRL9、PyCCRL10和PyCCRL12），而PyCCR3、PyCCR4和PyCCRL11未能获得可溶性形式。纯化蛋白使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）表征，其浓度见图S5和S6。
【数据】可溶性蛋白数：9个（PyCCR1/2/5/6/L7/L8/L9/L10/L12）；不可溶蛋白数：3个（PyCCR3/4/L11）；纯化方法：Ni-NTA亲和层析
3.5 云南松重组CCR蛋白的功能表征
为研究PyCCR蛋白的木质素催化能力，酶活测定聚焦于获得的9个可溶性成员。HPLC分析表明PyCCRs对阿魏酰辅酶A、芥子酰辅酶A和对香豆酰辅酶A表现出还原酶活性（图3）。HPLC分析显示一个特征峰，保留时间（Rt = 38.025 min）与松柏醛标准品（Rt = 38.572 min）一致。可比的保留时间提示该峰鉴定为松柏醛（图3A）。当芥子酰辅酶A作为底物时，PyCCRs表现出对芥子酰辅酶A转化的催化活性（图3B）。反应混合物中含有芥子醛峰（Rt = 40.421 min），而标准品在40.949 min洗脱。与标准品的色谱比较提示新峰对应芥子醛，依据为保留时间匹配。当对香豆酰辅酶A作为底物时，PyCCRs在对香豆酰辅酶A转化中表现出催化活性。反应产物的HPLC分析显示一个对香豆醛峰（Rt = 38.901 min）。对香豆醛参考标准品在39.063 min洗脱。保留时间比对表明对香豆醛成功产生（图3C）。
【数据】松柏醛产物峰Rt：38.025 min；松柏醛标准品Rt：38.572 min；芥子醛产物峰Rt：40.421 min；芥子醛标准品Rt：40.949 min；对香豆醛产物峰Rt：38.901 min；对香豆醛标准品Rt：39.063 min；底物：阿魏酰辅酶A、芥子酰辅酶A、对香豆酰辅酶A；活性成员：PyCCR1/2/5/6
3.6 云南松CCR的同源建模与分子对接
对模型进行比较结构分析（图4A），随后进行50次独立的基于遗传算法的对接模拟，以确定最佳酶-底物构象。对接结果表明，对香豆酰辅酶A、阿魏酰辅酶A和芥子酰辅酶A均位于PyCCR1~6的催化结合口袋内。底物结合口袋由多个残基界定，包括GLY-17、THR-40、ARG-42、LYS-48、GLN-47、GLU-98、SER-199和THR-205，共同构成底物进入通道。分子对接分析揭示了底物与R(X)5K（包括R(X)6K和R(X)9K变体）以及催化位点残基之间形成氢键（图4B–D）。结构分析表明，在大多数PyCCRs中，底物与ARG-42（对应R(X)5K基序中的R残基）形成多个氢键（图S6–S8），表明其在CCR催化位点中的潜在关键作用。为研究这种相互作用，对PyCCRL7与其底物阿魏酰辅酶A进行了分子对接。结果表明，PyCCRL7缺少关键的R(X)5K基序导致口袋结构域不完整，从而阻止配体与关键残基结合。这些发现证明R(X)5K结构基序对底物结合至关重要。先前研究报道了银合欢CCR同源模型与阿魏酰辅酶A之间的对接分析。ARG51被鉴定为银合欢CCR中的关键催化残基，与底物表现出多个氢键相互作用。它属于R(X)5K结构，与云南松中的ARG-42相同。因此推测云南松PyCCRL7~12可能缺少R(X)5K结构，导致无法形成完整的底物结合口袋。
【数据】对接模拟次数：50次；底物结合口袋残基：GLY-17、THR-40、ARG-42、LYS-48、GLN-47、GLU-98、SER-199、THR-205；关键残基：ARG-42（对应R(X)5K基序中的R）
3.7 云南松不同组织中PyCCRs基因的相对表达
为研究12个PyCCR家族成员的组织特异性表达模式，对芽、茎、叶、根和果实五种代表性组织进行了RT-qPCR分析（图5）。表达谱显示12个基因在不同组织中呈现差异化表达模式。数据以三个生物学重复的平均值±标准差（SD）表示，柱上不同小写字母表示不同组织间差异显著（p < 0.05）。
【数据】分析方法：RT-qPCR；组织类型：芽、茎、叶、根、果实；生物学重复：3个；显著性阈值：p < 0.05
讨论与解读
植物代谢谱具有复杂性，包含初生和次生代谢物。苯丙烷代谢途径负责合成植物三大类次生代谢物之一（酚类）的原料。通过该途径，植物直接或间接合成含苯丙烷骨架的物质，如木质素、黄酮和花青素。木质素是植物细胞壁的关键成分，对维持植物发育过程中的机械刚性、维持水分运输的维管完整性以及增强对环境胁迫（包括干旱）的防御机制至关重要。
CCR基因家族在植物类群中普遍分布，但各物种间存在显著的序列和功能多样性。系统发育分析已在多种植物中表征了CCR家族成员，包括拟南芥、多年生黑麦草、毛果杨、绒毛杨、水稻和苹果。尽管基因家族规模庞大，但只有部分CCR对木质素途径中间体表现出催化活性，大多数成员被归类为CCR-like蛋白。本研究通过系统鉴定，在云南松中获得12个CCR家族成员，其中PyCCR1–6为真正的CCR，PyCCRL7–12为CCR-like蛋白。体外酶活实验证实了4个成员（PyCCR1、PyCCR2、PyCCR5、PyCCR6）对三种底物的催化活性，而分子对接和序列分析共同揭示了完整的R(X)5K基序对维持催化活性的关键作用。RT-qPCR分析揭示了12个基因的组织特异性表达模式，暗示它们在木质素沉积调控中可能扮演差异化角色。
编译者解读
本研究以裸子植物云南松为对象，填补了CCR基因家族在松科植物中功能表征的空白。方法学上采用了"转录组挖掘→系统发育分类→原核表达→体外酶活→分子对接→组织表达"的完整链条，逻辑严密。值得注意的是，研究通过序列基序分析预测了R(X)5K结构域对催化活性的关键作用，并通过分子对接实验予以验证，体现了计算与实验相结合的策略价值。从合成生物学应用角度看，云南松作为重要用材树种，其木质素含量的精准调控具有重大经济价值——鉴定出的功能CCR基因可作为基因编辑靶点或遗传改良的分子标记。然而，体外酶活与体内实际功能之间仍存在距离，且未获得可溶性蛋白的3个成员的功能尚待解析，后续可尝试不同的表达系统或融合标签策略加以解决。
参考来源
Liu J, Wang H, Chang J, Yao A, Tang J. Identification and In Vitro Functional Characterization of the CCR Gene Family Reveals Their Regulatory Roles in Lignin Biosynthesis of Pinus yunnanensis. Plants (Basel). PMID: 42588756.
PMID: 42588756