来源：Int J Mol Sci | 编译：DNA Lab Space
导读
岩黄连（Corydalis saxicola Bunting）是喀斯特生境特有的濒危药用植物，其活性成分脱氢卡维丁具有明确的保肝、抗炎和抗病毒药理活性。然而，该化合物的生物合成途径长期未获解析。本研究从岩黄连基因组中鉴定出22个小檗碱桥酶类似蛋白（BBEL）家族成员，通过系统发育、表达谱分析和分子对接锁定3个根系高表达候选基因，并利用体外酶活实验证实CsBBEL3/16/17可催化卡维丁和四氢非洲防己碱的四电子氧化，分别生成脱氢卡维丁和非洲防己碱。该工作为喀斯特植物特殊代谢途径的演化适应提供了分子证据。
研究背景
苯并异喹啉生物碱（BIAs）是罂粟科药用植物中一类重要的防御性和药用次生代谢物，吗啡、可待因和小檗碱等广泛应用药物的合成均依赖此类化合物。在紫堇属物种中，原小檗碱型BIAs是主要亚类，具有抗菌、抗肿瘤和神经保护等多种药理活性。脱氢卡维丁（DHCA）是喀斯特濒危植物岩黄连的主要生物活性成分，其保肝、抗炎和抗病毒特性已被广泛记录。然而，DHCA的生物合成途径在很大程度上仍未明确，这严重制约了通过代谢工程策略提高DHCA产量以满足日益增长的临床需求。
在保守的BIA生物合成途径中，小檗碱桥酶类似蛋白（BBEL）催化四氢异喹啉中间体的限速四电子氧化，形成特征性的小檗碱桥。BBEL蛋白属于VAO/PCMH超家族的FAD依赖性氧化还原酶，具有双共价结合的FAD辅因子和催化必需的保守C末端Y/FxN基序。这些蛋白通过保守的两步氧化还原循环发挥作用——氢化物转移至FAD N5原子，随后通过分子氧再氧化。尽管BBEL蛋白在BIA生物合成中扮演关键角色，其在岩黄连中的功能此前完全未知。
研究方法
4.1 植物材料与处理
岩黄连实验标本采自广西壮族自治区河池市东兰县，随后在广西药用植物园栽培保存。凭证标本（编号0317019）已存放于广西中药材标本馆。野生标本采集获得国家二级保护野生植物采集许可（许可证号：桂植采证0030784）。
种子在清水中浸泡过夜，播种于沙：蛭石=1:1（v/v）育苗基质中，在人工气候箱内培养，条件为25°C、60%相对湿度、100 μmol·m⁻²·s⁻¹光强、12小时光照/12小时黑暗光周期。器官特异性表达分析中，30日龄均匀幼苗移栽至单个25 cm（直径）×20 cm（高）塑料盆（每盆一株），环境条件同上，统一浇水。继续培养150天后，于上午9:00至10:00之间采集新鲜健康组织，包括叶片、根、茎、长叶柄和短叶柄。钙胁迫处理中，另一批一个月龄幼苗栽种于含泥炭土：蛭石基质（3:1，v/v）的花盆中，温室条件为23°C、16小时光周期、光强120 μmol·m⁻²·s⁻¹。幼苗分别浇灌等体积的0、100、200和300 mmol·L⁻¹ CaCl₂溶液，连续处理25天。根组织分别收获。所有样品立即用液氮冷冻并保存于−80°C。
【数据】物种：岩黄连；温度：25°C（培养箱）/23°C（温室）；光周期：12h/12h（培养箱）/16h（温室）；光强：100/120 μmol·m⁻²·s⁻¹；CaCl₂浓度：0、100、200、300 mmol·L⁻¹；处理时间：25天；相对湿度：60%
4.2 CsBBEL的全基因组鉴定、理化性质与系统发育分析
从Pfam数据库获取BBE结构域（PF08031）和FAD结合结构域（PF01565）的隐马尔可夫模型（HMM）谱，使用HMMER v3.4软件以E值阈值1e−5对岩黄连全基因组蛋白序列进行同源搜索，获得CsBBELs的初步候选序列。随后，从拟南芥信息资源库（TAIR）获取28个拟南芥BBEL蛋白（AtBBELs）作为查询序列，使用TBtools v2.096内置的BLAST v2.2.25工具进行二次BLASTp同源筛选，筛选阈值设为E值≤1×10⁻⁵、序列同一性≥40%、比对覆盖率≥50%。保留序列的特征性保守结构域完整性进一步通过InterPro和SMART数据库验证。去除冗余序列后，确定岩黄连BBEL基因家族的最终成员。
使用ExPASy在线服务器（https://web.expasy.org/protparam/；访问日期：2025年9月24日）检查CsBBEL的理化性质，包括氨基酸长度、分子量、等电点、亲水性和不稳定指数。此外，利用在线工具Wolf-psort和Cell-PLoc预测候选蛋白的亚细胞定位。
为提高亚细胞定位预测的可靠性，对候选蛋白使用了五个独立的在线工具，即WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/；访问日期：2025年9月24日）、Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/；访问日期：2025年9月24日）、CELLO（https://cello.life.nctu.edu.tw/；访问日期：2025年9月24日）、PSORT2（https://www.genscript.com/psort.html）和Euk-mPLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/；访问日期：2025年9月24日）。对每个CsBBEL蛋白，统计支持各亚细胞区室的工具数量，生成共识投票矩阵。该矩阵进一步进行逐行Z-score标准化——将投票数相对于每个蛋白在所有区室的均值和标准差进行归一化——以突出每个家族成员的相对定位偏好。标准化后数值范围约为−2.50至2.50，正值表示定位偏好强于该蛋白的平均水平，负值表示偏好较弱。标准化值用于后续可视化。
从岩黄连和四个产BIA物种（罂粟、博落回、黄连、加州花菱草）中获取BBEL蛋白序列。所有系统发育树均使用MEGA 11.0中的邻接法（NJ）构建，1000次bootstrap重复，使用泊松模型进行氨基酸替换，对含缺口位点采用成对删除。为不同分析目的构建了两棵不同的系统发育树：一棵将CsBBELs与上述四个产BIA物种的同源蛋白聚类；另一棵将CsBBELs与AtBBELs进行比较，以进一步解析CsBBEL家族的进化关系。所有树使用在线工具iTOL（https://itol.embl.de/）进行可视化和优化。系统发育分析中使用的所有CsBBEL基因序列登录号汇总于补充表S1。
【数据】E值阈值：1e−5（HMMER）/≤1×10⁻⁵（BLASTp）；序列同一性：≥40%；比对覆盖率：≥50%；bootstrap重复：1000次；亚细胞定位标准化值范围：约−2.50至2.50
4.3 染色体定位、基因重复与共线性分析
CsBBELs的染色体位置从岩黄连基因组的GFF3注释文件中提取，使用TBtools v2.096生成染色体分布图。种间共线性分析的基因组数据从公共数据库获取：拟南芥和水稻基因组从NCBI获取（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCF_000001735.4/；访问日期：2025年7月1日；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCF_034140825.1/；访问日期：2025年7月1日）；罂粟和岩花紫堇从中国国家基因库序列档案获取（https://ngdc.cncb.ac.cn/gwh/Assembly/139/show；访问日期：2025年7月1日；https://ngdc.cncb.ac.cn/gwh/Assembly/10358/show；访问日期：2025年7月1日）；延胡索从CNGBdb获取（https://db.cngb.org/data_resources/project/CNP0004356；访问日期：2025年7月1日）。岩黄连的高质量de novo基因组由华大基因（中国深圳）组装。
使用TBtools v2.096进行岩黄连种内共线性分析及与上述五个物种的种间共线性比较，参数设置为最小匹配得分50、最大缺口20。串联重复定义为位于同一染色体上的两个或更多连续同源基因，而全基因组重复（WGD）事件基于位于不同染色体上的同源对进行鉴定。基因重复分类、共线性分析和可视化均使用TBtools v2.096完成。
【数据】共线性参数：最小匹配得分50；最大缺口20；基因组来源：NCBI/CNGB/CNGBdb
4.4 保守基序、基因结构与顺式作用元件分析
使用MEME Suite 5.5.7检查CsBBELs的保守基序，最大保守基序数设为十个。利用岩黄连的基因组GFF3注释和CDS，通过TBtools v2.096可视化CsBBELs的外显子-内含子结构。提取CsBBELs翻译起始位点上游2 kb序列，使用PlantCARE数据库预测和注释顺式作用元件。
【数据】保守基序最大数目：10；启动子区域：翻译起始位点上游2.0 kb
4.5 转录组测序与表达模式分析
使用MolPure®植物总RNA提取试剂盒（上海翊圣生物）从岩黄连不同器官和Ca²⁺处理根样品中提取总RNA。RNA的完整性、浓度和纯度使用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外-可见分光光度计（NanoDrop 2000）评估。
（后续建库测序及数据分析流程原文未详述）
【数据】RNA提取试剂盒：MolPure®植物总RNA提取试剂盒；琼脂糖凝胶浓度：1%；检测仪器：NanoDrop 2000
研究结果
2.1 CsBBELs的全基因组鉴定与理化特征
以BBE结构域（PF08031）和FAD结合氧化酶结构域（PF01565）的隐马尔可夫模型为双探针，结合HMMER搜索和BLASTp同源筛选，在岩黄连基因组中共鉴定出22个BBEL家族成员，根据其在各染色体上的物理位置依次命名为CsBBEL1–CsBBEL22。
利用ExPASy ProtParam工具系统检查了22个CsBBELs的理化性质（表1）。结果表明该家族的整体特征高度保守。氨基酸长度范围为343至606 aa，分子量在38.72至68.41 kDa之间。理论等电点（pI）分布在5.21至9.58之间。其中19个成员的pI大于7.0，占总数的86.4%，表明CsBBELs主要由碱性蛋白组成。不稳定指数分析显示，18个CsBBELs的数值低于40，被归类为稳定蛋白。仅CsBBEL5、CsBBEL8、CsBBEL10和CsBBEL13的不稳定指数达到40或以上，因此被认为不稳定。CsBBEL家族的脂肪族指数范围为82.96至92.96，表明热稳定性高。所有成员的总平均亲水性均为负值（−0.261至−0.046），确认所有CsBBELs均为亲水性蛋白。
为探索CsBBELs的功能作用位点，本研究进行了亚细胞定位预测（图1A）。总体而言，质膜是CsBBEL家族的主要预测定位区室，大多数成员在该区域表现出中到高的定位置信度。值得注意的是，CsBBEL5、CsBBEL14、CsBBEL16和CsBBEL17在质膜定位中显示出最高预测得分，表明具有明确的膜靶向特异性。相比之下，所有CsBBELs在细胞质中的定位置信度均为低到中等，这与BBEL型氧化还原酶固有的亚细胞特征一致。对于叶绿体、细胞外空间、细胞核、液泡和线粒体等其他区室，整个家族的定位信号普遍较弱。仅少数成员在个别区室中显示出可观的得分——例如，CsBBEL7在线粒体中表现出额外的可检测信号。22个家族成员中不存在针对这些细胞器的普遍保守定位模式。后续实验中鉴定的核心候选基因CsBBEL3、CsBBEL16和CsBBEL17均被一致预测靶向质膜。这些关键候选基因的质膜定位为其在生物碱生物合成中的潜在作用提供了亚细胞定位证据。
【数据】家族成员数：22；氨基酸长度：343–606 aa；分子量：38.72–68.41 kDa；pI范围：5.21–9.58；pI>7.0成员数：19（86.4%）；不稳定成员：CsBBEL5/8/10/13；脂肪族指数：82.96–92.96；亲水性：−0.261至−0.046
2.2 系统发育分析
为阐明CsBBELs的进化关系和功能分化，选取了来自岩黄连、近缘罂粟科物种（罂粟、博落回、延胡索、岩花紫堇）和模式植物拟南芥的同源BBEL/BBE蛋白。这些物种的选取代表了已功能鉴定的BBELs（罂粟、博落回）、近缘同属物种（延胡索、岩花紫堇）和系统发育背景的模式被子植物（拟南芥）。使用邻接法构建了两棵系统发育树：一棵将CsBBELs与已功能鉴定的BBE/BBEL同源蛋白聚类（图1B），另一棵将CsBBELs与AtBBELs合并（图1C）。
系统发育分析将所有BBEL成员划分为三个不同的分支，命名为Clade I、Clade II和Clade III（图1B）。22个CsBBELs在这些分支中的分布不均匀。Clade I包含13个CsBBELs，与其他罂粟科物种的BBEL同源蛋白聚类，形成物种特异性谱系，表明是该家族内的主要扩张群。Clade II包含七个成员（CsBBEL5、6、7、8、9、10、22），与先前验证的BIA合成酶密切相关，如延胡索的THBO1和博落回的BwSTOX，提示该分支成员主要参与BIA生物合成。Clade III仅包含两个成员（CsBBEL1和CsBBEL20），与罂粟和黄连的远缘BBEL同源蛋白聚在一起。
岩黄连与拟南芥的比较系统发育分析显示了明显的物种特异性分化（图1C）。22个CsBBELs中有20个聚在单一独立谱系中，表明存在显著的物种特异性扩张。相比之下，仅CsBBEL1和CsBBEL20与AtBBELs一起位于其他分支中。相反，AtBBELs分布在多个分支中。这些发现表明BBEL家族在岩黄连和拟南芥之间经历了相当大的分化进化。
总之，CsBBEL家族在罂粟科内表现出高度保守性，同时伴随显著的谱系特异性扩张和功能分化。候选CsBBELs与已表征的BIA相关酶之间的紧密系统发育关系，为后续研究中核心基因的鉴定和功能验证提供了重要的进化见解。
【数据】Clade I成员数：13；Clade II成员数：7；Clade III成员数：2；与THBO1/BwSTOX聚类的成员：CsBBEL5/6/7/8/9/10/22；与AtBBELs同支的CsBBEL：CsBBEL1/20
2.3 CsBBELs的保守基序与基因结构分析
为阐明CsBBELs的序列保守性和结构分化，在上述系统发育框架内分析了22个CsBBELs的保守基序、功能结构域和基因结构（图2）。基因鉴定期间使用NCBI CDD进行的结构域预注释证实，所有22个CsBBELs均同时具有BBE催化结构域和FAD结合结构域。保守基序的分布与三支系统发育分类高度一致。Motif 2在所有22个成员中普遍保守，定位于BBE催化结构域内。Motif 1和Motif 3定位在FAD结合结构域，分别存在于21个和19个成员中。这三个基序构成BBEL家族的核心功能模块，其中Motif 2是BBE催化结构域的必要组成部分。其他保守基序表现出与系统发育拓扑结构一致的明显分支特异性分布模式。
Clade I包含13个成员，具有最完整的基序组成。除核心基序外，该分支的大多数成员还含有Motif 5和Motif 6，但CsBBEL18两者均缺失，表明该分支内序列保守程度高。Clade II包含七个成员，大多数含有Motif 7和Motif 8。CsBBEL8和CsBBEL10缺少Motif 8，CsBBEL7缺少Motif 6，在保守结构框架内显示出适度的序列分化。Clade III仅由CsBBEL1和CsBBEL20组成，两者在基序水平上均表现出显著的结构分化。CsBBEL1仅保留五个基序，且同时缺少Motif 1和Motif 3——分别是BBE和FAD结合结构域的核心催化模块。尽管其全长蛋白序列基于CDD注释仍保留可识别的BBE和FAD结合结构域，但核心催化基序的缺失提示CsBBEL1可能无法编码具有催化活性的酶。这一观察结果，加上其在所有测试组织中的极低转录积累，提示CsBBEL1可能代表该家族中一个假基因化或功能分化的成员。
基因结构分析进一步揭示了CsBBELs中外显子-内含子组织的多样性。各成员间内含子数量和分布存在差异，与系统发育分组部分一致。Clade I成员通常表现出相似的外显子-内含子排列模式，而Clade III成员则显示出更明显的结构变异。
【数据】含Motif 2成员数：22/22；含Motif 1成员数：21/22；含Motif 3成员数：19/22；CsBBEL1保留基序数：5；缺少Motif 8的成员：CsBBEL8/10；缺少Motif 6的成员：CsBBEL7
2.4 CsBBELs的染色体定位与共线性分析
CsBBEL基因在岩黄连连锁群（LGs）上的染色体定位显示，22个CsBBELs分布在多条连锁群上，部分基因呈现聚集分布特征。种内共线性分析揭示了CsBBEL家族基因间的复制事件。种间共线性分析比较了岩黄连与拟南芥、水稻、罂粟、延胡索和岩花紫堇五个物种间的共线性关系。
【数据】比对物种数：5（拟南芥、水稻、罂粟、延胡索、岩花紫堇）
2.5 CsBBELs启动子中的顺式作用元件分布
CsBBELs启动子区域（翻译起始密码子上游2.0 kb序列）中分布着多种类型的顺式作用元件，以不同颜色椭圆表示。
【数据】启动子区域：翻译起始位点上游2.0 kb
2.6 CsBBELs的表达模式：器官特异性与钙胁迫响应
利用转录组测序数据分析了22个CsBBEL家族成员在岩黄连不同器官（叶、根、茎、长叶柄和短叶柄）中的表达谱。热图显示CsBBEL基因表现出显著的器官特异性表达特征。核心候选基因CsBBEL3、CsBBEL16和CsBBEL17在根中表现出特别高的表达水平。
钙梯度处理下的表达谱分析显示，CsBBEL家族成员对钙胁迫表现出显著的转录响应。核心CsBBEL基因在不同器官和钙胁迫条件下的FPKM定量分析确认了上述表达模式，统计学检验（单因素方差分析后接Duncan多重极差检验，p<0.05）显示组间差异显著。
【数据】差异显著性：单因素方差分析+Duncan多重极差检验，p<0.05；核心基因：CsBBEL3/16/17（根中高表达）
2.7 核心CsBBEL蛋白与FAD和卡维丁的分子对接
分子对接分析预测了核心CsBBEL蛋白与FAD辅因子及底物卡维丁的结合模式。CsBBEL3、CsBBEL16和CsBBEL17与卡维丁的对接结果显示了合理的结合构象和相互作用界面，支持这些候选蛋白可能结合卡维丁和四氢非洲防己碱的预测。
【数据】对接配体：FAD、卡维丁；对接蛋白：CsBBEL3/16/17；结合底物：卡维丁、四氢非洲防己碱
2.8 核心CsBBEL蛋白的体外酶活分析与底物特异性
体外酶活实验验证了核心CsBBEL蛋白的催化功能。底物和产物的化学结构及代表性酶促反应显示，典型反应包括卡维丁（1）转化为脱氢卡维丁（2）。底物特异性筛选结果显示，CsBBEL3、CsBBEL16和CsBBEL17对卡维丁和四氢非洲防己碱具有催化活性——“√”表示目标产物形成，而“ND”表示未检测到催化活性。HPLC色谱图显示了CsBBEL3、CsBBEL16和CsBBEL17催化酶促反应产物的特征峰，底物（1/3）和产物（2/4）的特征峰均被标示，并包含底物和产物标准品作为对照以确认产物形成。
体外酶活实验证实，CsBBEL3/16/17特异性催化卡维丁和四氢非洲防己碱的四电子氧化，分别生成脱氢卡维丁和非洲防己碱，在BIA生物合成途径中表现出氧化酶活性。
【数据】底物：卡维丁、四氢非洲防己碱；产物：脱氢卡维丁、非洲防己碱；催化类型：四电子氧化；活性蛋白：CsBBEL3/16/17
讨论与解读
本研究首次在岩黄连中进行了全基因组水平的BBEL家族鉴定，共获得22个CsBBEL成员，均具有BBEL家族特征的保守FAD结合结构域和BBE催化结构域。系统发育分析将这些成员分为三个不同分支。连锁群03（LG03）上的CsBBEL2–17串联重复簇促进了CsBBEL家族的扩张，不同分支间观察到显著的结构和功能分化。顺式作用元件和表达谱分析显示，CsBBELs主要在根和茎中表达。值得注意的是，CsBBEL3、CsBBEL16和CsBBEL17表现出根特异性表达模式、生物碱氧化酶催化活性和显著的Ca²⁺响应性。
喀斯特地区以土壤钙浓度的显著时空变异为特征，不同微生境中钙水平波动幅度可达3–41倍。为应对这种钙可用性的巨大变化，岩黄连需要维持DHCA的基础稳态合成。CsBBEL家族通过同工酶的差异表达调控和催化底物专一性两种维度，形成了适应喀斯特生境钙波动的分子策略。
编译者解读： 本研究从基因组水平系统鉴定了岩黄连BBEL家族，并利用体外酶活实验直接验证了三个核心成员的催化功能，方法链条完整。将根系高表达与钙胁迫响应联系起来，为喀斯特生境下特殊代谢物的积累提供了生态适应视角的解读。不足之处在于，体外实验尚未在异源宿主中进行完整的通路重构，且CsBBEL1的假基因化推测仍需实验验证。从合成生物学应用角度看，这些功能明确的氧化酶基因元件，未来有望用于在微生物细胞工厂中重构脱氢卡维丁的完整生物合成途径。
参考来源
Kang L, Liu H, Zhu D, Li C, Lei M. Genome-Wide Identification and Functional Verification of Core Berberine Bridge-like Enzyme Genes for Benzylisoquinoline Alkaloid Biosynthesis in Corydalis saxicola Bunting. Int J Mol Sci. PMID: 42589364.
PMID: 42589364