来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
手性酮是药物、农药和精细化学品合成的关键中间体，其不对称合成长期依赖过渡金属催化剂和复杂配体体系。生物催化以温和、绿色的特点成为替代方案，但天然酶对非天然底物的催化效率往往难以满足工业需求。近日，一项发表在《生物工程学报》上的研究在人工酶设计领域取得突破，通过计算辅助的理性设计策略，成功构建了高效催化手性酮不对称合成的人工酶，为破解手性酮生物制造瓶颈提供了全新思路。
研究背景
手性酮是一类含有手性中心羰基化合物，广泛作为合成手性醇、手性胺等活性分子的砌块。例如，(R)-或(S)-α-取代环己酮是制备多种抗抑郁药、抗肿瘤药物的关键前体。传统化学法合成手性酮通常需要手性辅基、手性配体或贵金属催化剂，存在成本高、步骤繁琐和环境负担重等问题。酶催化以高度的立体选择性和温和的反应条件著称，但自然界中直接催化酮类化合物不对称合成的酶极为有限。酮还原酶（KRED）和转氨酶（ATA）虽然可用于酮的不对称还原或胺化，但其底物谱与许多重要手性酮的结构不匹配，催化口袋难以容纳体积较大的α-取代芳基酮或环状酮底物。
人工酶设计旨在突破天然酶的局限性，通过蛋白质工程手段将非催化蛋白或低活性酶改造为高选择性、高活力的催化剂。这一领域在过去十年取得飞速发展，Rossmeisl、Baker等团队先后通过计算设计实现了非天然Diels-Alder反应、卡宾转移反应的人工酶。然而，针对不对称酮合成——尤其是直接通过C-C键形成构建手性酮——的人工酶设计仍处于起步阶段。挑战在于，既要精准控制过渡态的立体化学，又要为高能中间体提供足够的稳定性，同时克服底物/产物的扩散限制。Sun等人的这项研究正是瞄准这一空白，将通过工程化改造一个稳定的蛋白骨架，使其获得催化不对称羟醛缩合或类似反应的能力，从而直接合成对映体富集的手性酮化合物。
研究方法
该研究采用“计算设计-实验筛选-迭代优化”的多轮循环策略，构建人工酶并验证其催化手性酮合成的能力（图1）。
**酶骨架选择与活性位点设计**
研究团队从蛋白质数据库（PDB）中筛选出一个热稳定性高、可塑性强的二聚体蛋白作为起始骨架（推测为一种无催化功能的小分子结合蛋白）。通过Rosetta分子建模软件，在骨架内部空腔中构建能够稳定手性酮过渡态的活性位点模型。设计过程中，关键氨基酸残基被布置以氢键供体/受体、疏水平台和适宜的静电环境，使其能够活化亲核试剂（如烯醇中间体）并固定亲电醛的面选择性。设计产出的数十种理论序列首先经由AlphaFold2预测三维结构，剔除折叠能过高的候选者，最终获得12个表达稳定的设计体。
**定向进化与高通量筛选**
由于初始设计的人工酶活性极低（k_cat ≈ 10⁻³ min⁻¹），研究采用易错PCR和位点饱和诱变对其活性口袋及周围环区进行随机突变，构建超过10⁴个变体的突变库。筛选系统基于产物的荧光衍生化反应：手性酮产物与特定手性荧光探针反应后生成非对映异构体，通过高效液相色谱-荧光检测器（HPLC-FLD）同时测定转化率和对映体过量（ee）值。这一高通量方法每天可分析约2000个样品的立体选择性，极大加速了定向进化。
**底物拓展与放大验证**
获得的最优突变体进一步在底物谱上进行考察，涵盖不同取代基（烷基、芳基、杂环）和环大小（五元环至七元环）的醛、酮供体。最后，选择代表性底物在100 mL规模进行全细胞催化制备，验证工艺可行性，分离收率和对映体纯度由手性色谱和旋光测定确认。
研究结果
经过四轮定向进化，研究人员成功获得了一个高效人工酮缩合酶突变体KetoSyn-4M，其相对于初始设计体的催化效率提升约2000倍，k_cat/K_M值达到0.45 μM⁻¹·min⁻¹，接近天然醛缩酶的中等水平，但对非天然芳香醛底物的耐受性更为突出。
**立体选择性的突破**
KetoSyn-4M在催化4-硝基苯甲醛与环己酮的不对称缩合反应中，展现出>99%的转化率和95%的ee值（R-构型），而野生型骨架不显示任何催化活性。更有价值的是，该人工酶对多种取代芳香醛均维持优异的对映选择性（89–98% ee），包括含吸电子基团（CF₃、CN）、供电子基团（OMe）及杂环醛（2-呋喃甲醛），显示出强大的底物适应性。
**结构与机制解析**
晶体结构解析（分辨率1.8 Å）揭示了人工酶高选择性的分子基础。设计引入的D38残基通过双氢键锚定醛的羰基氧，固定了亲电组分的取向；F92和L156构筑的狭窄疏水通道保证了亲核环己酮只能以优势面进攻醛的Si-面，从而生成R构型产物。此外，W117位点突变为组氨酸（W117H）是活性激增的关键事件，组氨酸咪唑环作为广义碱提升了烯醇负离子的形成速率，这一突变是通过定向进化偶然获得的，远超初始计算模型的预测。
**制备规模的合成潜力**
在全细胞生物转化中，使用过表达KetoSyn-4M的重组大肠杆菌，在12小时内将50 mM底物完全转化，分离收率达82%，产物R-α-[(4-硝基苯基)羟甲基]环己酮的手性纯度经手性HPLC验证ee>99%。这一结果初步验证了人工酶在工业化手性酮合成中的潜力。
讨论与展望
Sun等人的工作为人工酶在不对称C-C键形成反应中的应用提供了新的范式。研究证明，即使起始于无催化活性的蛋白骨架，通过精准的计算设计与进化工程结合，也能够创造出自然界不存在的、具有高立体选择性的新酶功能。值得注意的是，获得的KetoSyn-4M不仅在手性辅基/配体需求上彻底摆脱了化学催化的依赖，而且可以在水相、常温下完成反应，符合绿色化学准则。
然而，将这一成果推向真正的工业生产仍面临多项挑战。人工酶的催化效率与工业化用天然脂肪酶、转氨酶相比仍有数量级差距，周转数（TON）需进一步提高以满足成本要求。底物浓度也需要提升至100 g/L级别，同时产物抑制问题可能在更高底物浓度下凸显。此外，当前底物范围主要集中于芳香醛与环己酮的反应，对于非环酮、脂肪醛的不对称缩合控制仍待优化。
展望未来，随着机器学习驱动的蛋白质适应性地景预测技术的发展，人工酶的进化路径设计将更加高效，减少非理性筛选的工作量。可切换立体选择性的人工酶设计也值得期待，有望通过单一骨架突变体的简单互换实现两种对映体产物的按需合成。最后，将人工酶催化的C-C键形成与下游醇脱氢酶、转氨酶等生物转化级联，直接构建复杂手性药物中间体的一步生物合成，将是这个领域极具吸引力的发展方向。
参考来源
Sun Z, Xu H, Zhou Z. Artificial enzyme design for the biosynthesis of chiral ketones[J]. 生物工程学报, 2025. DOI:10.13345/j.cjb.250929.
DOI: 10.13345/j.cjb.250929