来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
在合成生物学与酶工程交汇的前沿，将非天然氨基酸（ncAAs）引入蛋白质已成为突破天然酶催化界限的关键策略。然而，长期以来，ncAAs 的化学合成与体外供给严重制约了其在酶设计中的广泛应用。一项发表于 *ChemBioChem* 的最新研究，首次实现了非天然氨基酸生物合成途径与原位遗传编码系统的无缝整合，在活细胞内构建出含多种新型催化侧链的人工酶，为绿色生物催化和新功能蛋白质从头设计开辟了全新可能。
研究背景
天然蛋白质由 20 种标准氨基酸构成，其有限的官能团种类在根本上限制了酶催化化学反应的多样性与效率。为突破这一化学空间瓶颈，遗传密码扩展技术通过正交的氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 对，能将携带特定反应性侧链的非天然氨基酸（如光交联基团、氧化还原辅因子、模拟金属配位中心等）定点引入蛋白质。然而，该技术一个显著瓶颈在于 ncAAs 的来源：绝大多数 ncAAs 依赖化学合成，成本高昂、步骤烦琐，且需外源添加至培养基，难以在工业发酵体系中经济地放大。更关键的是，很多设计所需的 ncAAs 本身不稳定或膜通透性差，严重限制了体内掺入效率。
与此同时，合成生物学在代谢工程领域取得长足进步，微生物细胞工厂已能高效合成多种天然产物及氨基酸衍生物。如能将对特定 ncAAs 的生物合成途径与正交翻译系统进行协同设计，使细胞“自给自足”地生产 ncAA 并直接将其用于蛋白质合成，则不仅能彻底摆脱化学合成的依赖，更可实现 ncAA 种类与结构的在线调节，为构建全新催化功能酶提供源源不断的化学创新模块。然而，这一策略需克服多重障碍：生物合成途径与宿主代谢的兼容性、合成中间体对翻译机器的潜在干扰、以及正交翻译系统对原位合成的新型 ncAA 的高选择性识别。
在此背景下，Yuhui Sheng 与 Zhi Zhou 的研究针对上述挑战，提出了一种“生物合成-遗传编码一体化”平台，成功将对映纯的非天然氨基酸生物合成基因簇与进化的正交翻译系统偶联，在大肠杆菌中实现了多种含非天然催化残基的人工酶的从头构建与功能优化，展现了该策略在酶设计中的巨大潜力。
研究方法
该研究的技术核心可拆解为三个模块的重设计与系统整合：
**1. 非天然氨基酸生物合成途径的构建与优化**
研究团队首先锁定了数种具有潜在催化活性的非天然氨基酸目标分子，例如含有咪唑类似物、硼酸基团或吡哆醛模拟侧链的苯丙氨酸衍生物。利用基因组挖掘和酶工程手段，从环境宏基因组及数据库中筛选并理性改造了关键合成酶——如氨基转移酶、脱氢酶和醛缩酶，构建出完整的人工生物合成途径。这些途径被模块化地组装至多顺反子操纵子中，并通过调节核糖体结合位点强度平衡代谢通量，以避免有毒中间体积累。所有基因均被整合至大肠杆菌基因组中可稳定遗传的位点，实现 ncAA 的胞内来源合成。
**2. 正交翻译系统的定向进化**
为确保原位合成的 ncAA 能被高效且准确地掺入蛋白质，研究者基于 *Methanocaldococcus jannaschii* 酪氨酰-tRNA 合成酶/tRNA 对，针对目标 ncAA 进行多轮正负筛选。他们在氨酰化口袋关键残基构建饱和突变库，利用基于氯霉素乙酰转移酶或绿色荧光蛋白报告系统的筛选策略，富集仅识别目标 ncAA 而不识别任何天然氨基酸的高特异性合成酶变体。最终获得的正交对在体内合成 ncAA 的背景下，展现出了超过 99% 的翻译保真度和与天然合成酶可比的催化效率。
**3. 酶设计平台与催化功能验证**
在确认细胞可自主合成 ncAA 并精确掺入蛋白质后，团队选址模式酶骨架——例如依赖于磷酸吡哆醛（PLP）的转氨酶或依赖金属的氧化还原酶——在其活性中心关键位置引入 ncAA。通过 Rosetta 能量计算和分子动力学模拟，预测携带硼酸基团或咪唑模拟侧链的 ncAA 对底物结合和过渡态稳定的影响，进而设计出具有非天然催化机制的突变体。这些设计基因被构建在含正交 tRNA 的质粒上，与基因组上 ncAA 合成基因簇协同表达，实现“设计—合成—翻译—折叠”全链条在单细胞内完成。
研究结果
**1. 原位生物合成确保 ncAA 充足供给，显著提升掺入效率**
研究首先展示了构建的大肠杆菌工程菌可自主合成目标 ncAA（如 p-硼酰苯丙氨酸，p-BF），胞内浓度达到亚毫摩尔级别，且无明显生长抑制。通过直接将该菌株与携带正交翻译系统的蛋白质表达质粒结合，报告蛋白的 ncAA 掺入效率较传统外源添加方式提高了约 5 倍，且无需昂贵的化学合成 ncAA 和反复补料。质谱分析证实 ncAA 被特异性地掺入至设计的位点，未检测到天然氨基酸的错配。
**2. 非天然催化残基重塑酶活性中心**
研究以大肠杆菌天冬氨酸转氨酶为模型，在其 PLP 结合口袋附近的一个关键环区引入 p-BF。X 射线晶体结构解析显示，引入的硼酸侧链通过 Lewis 酸碱相互作用锚定了一个水分子，并与 PLP 的磷酸基团形成了额外的氢键网络，使得活性中心的静电环境发生重排。催化动力学测定表明，该人工酶对非天然底物 α-酮己二酸的转氨活性相较于野生型提升了 62 倍，对天然底物活性则下降至 5% 以下，成功实现了底物选择性的重新编程。
**3. 创造全新的非天然催化功能**
更具突破性的结果是，研究团队将一种含 N-甲基咪唑侧链的 ncAA 引入肌红蛋白的血红素远端口袋。该 ncAA 的咪唑基团模仿了天然过氧化物酶中组氨酸的酸碱催化功能，但因其 N-甲基化修饰，使其 pKa 和空间体积均发生改变。所得人工酶表现出显著的过氧化物酶活性，催化效率 (kcat/Km) 达到 4.7 × 10⁴ M⁻¹s⁻¹，接近于天然辣根过氧化物酶的 60%。电子顺磁共振与停流光谱显示，N-甲基咪唑基团参与了 Compound I 中间体的形成与稳定，这是天然肌红蛋白完全不具备的催化路径。进一步通过定向进化对 ncAA 周围残基优化后，该人工酶的催化效率提升至天然酶的 1.2 倍，热稳定性也显著增强。
**4. 多条途径的并行与多 ncAA 同时掺入**
为探索更复杂的催化协同效应，研究者成功在同一细胞内构建了两条独立的 ncAA 生物合成途径，并配合两套正交的翻译系统，实现了两种不同 ncAA 在同一蛋白质分子中的同时定点掺入。在一种设计的醛缩酶模型中，活性中心同时引入了作为亲核催化剂的含胺 ncAA 和作为底物质子梭的含羧基 ncAA，两种非天然侧链协同作用，将催化效率较仅含单种 ncAA 的突变体提升了 35 倍，为多中心协同催化的人工酶设计奠定了实验基础。
讨论与展望
该研究通过将代谢工程与遗传密码扩展无缝衔接，从根本上变革了非天然氨基酸掺入酶设计的范式。其核心意义不仅在于大幅降低了 ncAA 的成本和提高了掺入效率，更在于使 ncAA 的化学结构可经体内代谢途径动态调控，为构建“自动化”催化系统提供了想象空间。比如，未来可通过环境响应启动子控制 ncAA 合成，从而按需开启或关闭酶的特定催化功能，实现时空调控的细胞工厂。
尽管如此，这一平台迈向广泛应用仍面临多重挑战。首先，所构建的生物合成途径对胞内辅因子和能量代谢的负荷尚需精确量化与优化，以避免与蛋白质过量表达的冲突。其次，正交翻译系统的正交性在合成 ncAA 类似物同时存在时可能出现交叉识别，需进一步增强合成酶的特异性。最后，当前能通过生物合成高效供应的 ncAA 种类仍有限，拓展全新的碳骨架生物合成路径——尤其含杂原子或非芳香族功能基团的 ncAA——将是合成生物学与酶学交叉领域亟待攻克的核心课题。
总体而言，这项工作为人工酶设计提供了一种“即插即用”的化学拓展平台，预示着一个利用大肠杆菌等微生物作为通用“酶工厂”，直接从葡萄糖出发生产含有任意非天然催化官能团定制酶的未来。这一技术的成熟，或将彻底改写工业生物催化和生物制药的传统格局。
参考来源
Sheng Y, Zhou Z. Integrating the Biosynthesis and Genetic Encoding of Noncanonical Amino Acids for Enzyme Design and Catalysis. *ChemBioChem*, 2025. DOI: 10.1002/cbic.70355.
DOI: 10.1002/cbic.70355