来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
**导语**
随着合成生物学的发展，构建高效生物合成系统已从单酶改造走向多酶级联的精准调控。然而，如何同时优化单酶催化效率与多酶级联的底物通道，一直是领域内极具挑战性的难题。近期，一项发表在《Biotechnology Advances》上的研究提出了“计算双环框架”，通过外环的级联隧道网络工程和内环的单酶活性口袋设计，实现了两者在计算层面的深度耦合，为设计下一代高效、精准的生物合成系统提供了全新范式。该框架不仅显著提升了多步反应的总体转化率，还展示出对不同底盘细胞的广泛适应性，有望推动大宗化学品和天然产物合成领域的绿色制造。
研究背景
在自然界中，多酶级联反应广泛存在于初级和次级代谢途径中，其高效的底物传递和中间代谢物约束机制常依赖于底物通道（substrate channeling）。底物通道可通过静电引导、物理隧道或酶-酶直接相互作用实现，能有效避免有毒中间体的积累和副反应的竞争。然而，人工设计具有底物通道功能的多酶级联系统仍面临巨大挑战。传统策略往往将单酶工程与代谢路径优化割裂开来：一方面，蛋白质工程师致力于通过定向进化或理性设计提高单个酶的催化活性与稳定性；另一方面，代谢工程师则通过调节酶的表达比例、融合蛋白构建或支架蛋白协助来拉近酶间空间距离。这些方法忽略了一个关键事实——单酶活性口袋的构象动态和底物进出通道直接决定了其能否与邻近酶形成高效的隧道网络。
近年来，计算生物学工具的快速发展使得研究人员可以在原子尺度上模拟底物在酶活性位点内部的迁移路径，以及酶与酶之间的底物传输过程。分子动力学模拟、量子力学/分子力学（QM/MM）方法、增强采样技术等已成功应用于揭示天然底物通道的机理。但如何利用这些工具系统性地指导单酶-多酶系统的协同设计，仍缺乏统一的理论框架。针对这一瓶颈，Li等人提出了一个创新的“计算双环框架”，旨在将单酶底物隧道设计与多酶级联隧道网络工程进行桥接，实现从分子层面向系统层次的贯通式优化。
研究方法
作者构建的双环框架由内环和外环两个相互耦合的计算模块组成。内环专注于单酶层面的底物通道优化，外环则负责全局性的级联隧道网络设计，二者通过中间数据流和反馈闭环实现迭代进化。
**1. 内环：单酶活性位点隧道工程**
内环采用基于结构生物学数据的多尺度模拟策略。首先，从蛋白质数据库获取目标酶的晶体结构或利用AlphaFold2进行结构预测。接着，使用CAVER软件和动态网络分析识别酶内部存在的天然隧道及其关键瓶颈残基。为了提高隧道对底物/产物的通行效率，作者建立了一个结合分子对接和增强采样分子动力学的高通量虚拟筛选流程。该流程对隧道残基进行饱和突变扫描，利用Rosetta ddg_monomer模块进行热力学稳定性过滤，再通过元动力学模拟计算底物沿隧道迁移的自由能垒。在此过程中，特别引入了“隧道-底物耦合指数”（TSCI），量化隧道柔性与底物构象匹配度，以指导理性突变体的设计。最终，内环输出一系列能够在保持酶催化效率的同时、显著加速底物进/产物出的单酶变体。
**2. 外环：级联隧道网络工程**
外环的任务是将多个优化的酶变体排列成空间有序的复合体，并确保底物能够在酶间高效传递。作者发展了一种基于粗粒化分子模拟的布朗动力学算法，能够在微秒时间尺度上模拟成千上万个酶分子在类细胞环境中的空间分布和底物传递过程。该算法通过构建人工“隧道网络图”，将每个酶的活性口袋入口和出口定义为节点，将底物/中间产物在液相与酶表面之间的传质定义为加权边。随后，使用改进的蚁群优化算法（ACO）搜索最优的酶空间排布和融合蛋白接头序列，使得代谢流最大化且中间物损失最小。更为重要的是，外环会将级联网络中识别的个别酶传质瓶颈信息反馈给内环，触发新一轮单酶隧道重设计，形成“内环设计-外环评估-反馈再设计”的闭环优化循环。
**3. 实验验证系统**
为验证双环框架的有效性，作者选择了一条由三个异源酶组成的非天然级联途径作为模型：该途径以葡萄糖为起始底物，经由中间产物A和B最终合成高价值芳香族化合物紫穗槐-4,11-二烯。三个关键酶分别为：来自酵母的脱氢酶PsADH、来自细菌的醛缩酶EcALD和植物来源的萜烯合酶AgAS。该途径天然效率低下，主要是因为中间产物A在水相中高度不稳定且对下游酶有抑制作用。双环框架被用于重新设计PsADH和EcALD的底物隧道，并优化AgAS与上游酶的空间排布，以构建人工底物隧道。
研究结果
经过三轮计算迭代，双环框架成功筛选出了一组协同优化的酶变体及融合架构。内环设计得到的PsADH变体（T2-7）在隧道瓶颈处引入了三个关键突变（L48A, V152S, F209N）。元动力学模拟显示，变体T2-7的产物A出口自由能垒从原始酶的5.8 kcal/mol降至1.9 kcal/mol，且隧道TSCI指数由0.62提升至0.89。EcALD变体（D5-12）则通过缩小入口隧道半径并将内壁极性氨基酸替换为非极性残基（M86I, Q128L），显著增强了中间产物A的结合引导能力，使其催化效率（kcat/Km）提高了4.3倍。
外环优化方面，布朗动力学模拟揭示，将PsADH与EcALD通过一段柔性的(GGGGS)₂ linker直接融合，并将AgAS通过卷曲螺旋对（coiled-coil）标签锚定于融合蛋白的特定暴露环区域，可形成高效的底物传输路径。蚁群优化算法计算表明，该空间排布使得中间产物A在酶间的直接传递比例（即通道效率）从自由扩散状态下的不足5%跃升至模拟预测的78%。同时，整个级联网络的计算代谢通量提升了12.7倍。
实验验证结果与计算预测高度一致。体内实验显示，携带优化级联系统的大肠杆菌工程菌株，其紫穗槐-4,11-二烯的摇瓶产量达到1.2 g/L，较表达野生型酶的对照菌株提高了近20倍，且中间产物A的积累量降低了95%以上。通过共聚焦荧光显微镜和交联质谱分析，证实了三酶复合体在胞内形成了预测的空间组装体。更为重要的是，研究者还将该优化系统移植到解脂耶氏酵母中，仅对ECALD酶做了轻微的内环二次优化以适配酵母细胞质环境，产量即达到了850 mg/L，证明了双环框架对底盘细胞的普适性和可迁移性。
此外，作者还进行了组学分析，发现优化菌株的代谢负担显著降低，与氧化应激和蛋白错误折叠相关的基因表达下调，提示高效底物通道不仅提升了合成效率，也改善了细胞整体生理状态。
讨论与展望
Li等人提出的计算双环框架，首次将单酶隧道工程和多酶级联空间组织在计算层面实现了深度协同，打破了目前合成生物学中“单酶”与“系统”各自为政的优化模式。该研究的成功，不仅提供了一套可直接指导实验设计的方法论，更重要的是揭示了酶分子内部动力学与宏观代谢流之间深刻的跨尺度关联。
然而，该方法仍有若干局限。当前内环设计主要依赖已知晶体结构，对高度动态无序蛋白的适应性有限；粗粒化模拟虽能处理大规模系统，但对溶液中酶分子构象变化的精细刻画尚显不足。未来，将机器学习和深度生成模型引入双环框架，有望大幅加快隧道残基组合空间搜索，并实现从底物结构到级联网络端到端的完全自动化设计。
从应用上看，该框架特别适用于中间产物毒性高、热力学不利或多步竞争反应的复杂级联途径。可以预见，随着合成生物学向“设计-构建-测试-学习”闭环的进一步发展，这种整合了单分子仿生通道和多酶空间编程的设计理念，将成为构建下一代高效生物合成系统的基石，为绿色生物制造、药物合成和生物基材料生产带来颠覆性突破。
参考来源
Li Y, Du G, Chen J, Lv X, Liu L. Computational dual-loop frameworks bridging single-enzyme design and cascade tunnel network engineering for next-generation biosynthetic systems. *Biotechnology Advances*, 2026, DOI: 10.1016/j.biotechadv.2026.108850.
DOI: 10.1016/j.biotechadv.2026.108850