来源：J Biol Eng | 编译：DNA Lab Space
导读
气相生物过程通过将微生物细胞固定在固体载体上，实现挥发性或难溶性底物的高效转化。本研究系统评估了高黏附力菌株—不动杆菌属Tol 5在三种相对湿度条件下的干燥耐受性，并与多种模式菌株对比。结果显示，Acinetobacter菌株在16天干燥期间保持高存活率，固定化Tol 5在干燥后仍维持较高的甲苯降解活性。转录组分析揭示了该菌应对干燥胁迫的多层响应机制，为气相生物过程底盘菌株的筛选提供了新依据。
研究背景
气相生物过程将微生物细胞固定在固体载体上，能够高效转化挥发性或水溶性差的底物。Acinetobacter sp. Tol 5是一种高黏附力细菌，能够利用多种碳氢化合物，是气相生物过程的候选底盘菌株。然而，气相生物过程中细胞会暴露于波动湿度和瞬时干燥环境，这可能损害细胞活力和催化性能。在革兰氏阴性菌中，尤其是病原体，干燥会施加多因素胁迫，包括细胞水分和能量损失、DNA和蛋白质损伤、氧化应激以及细胞包膜破坏。相比之下，用于或考虑用于气相生物过程的底盘菌株，其干燥耐受性（包括湿度波动后生物催化活性的稳健性及对干燥胁迫的响应）尚未被充分定义。
研究方法
菌株与培养条件
本研究所用菌株列于表1。大肠杆菌（Escherichia coli）在LB培养基中于37°C、140 rpm振荡培养。Acinetobacter sp. Tol 5及其衍生菌株在LB培养基中于28°C、115 rpm振荡培养。恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）和Acinetobacter baylyi ADP1在LB培养基中于30°C、115 rpm振荡培养。
表1 本研究所用菌株
| 菌株 | 描述 | 参考来源 |
|------|------|----------|
| Acinetobacter sp. Tol 5 | 野生型菌株 | [20] |
| Tol 5 ΔataA | Tol 5的ataA基因敲除突变体 | [35] |
| A. baylyi ADP1 | Acinetobacter模式菌株 | ATCC 33,305 |
| Pseudomonas putida mt-2 | BTEX生物降解研究充分的菌株 | [36] |
| P. putida F1 | 甲苯降解研究的经典菌株 | [37] |
| Escherichia coli K-12 | 广泛使用的实验室模式菌株 | [38] |
干燥处理
过夜预培养：将细胞接种于2 mL LB培养基中培养10小时。随后按1:100比例接种至20 mL LB培养基中，培养16小时。细胞通过离心（3,000×g，10分钟）收集，并用磷酸盐缓冲液（PBS）（Nippon Gene，东京，日本）洗涤两次。洗涤后的细胞重悬于PBS中至1 × 10¹¹ CFU/mL，取10 µL分装至96孔板（353072；Corning Inc.，Corning，NY，USA）。将孔板置于3 L干燥器（017430-150；Sibata Scientific Technology，埼玉县草加市，日本）中，使用饱和盐溶液法[39]在28°C下控制湿度条件。将硫酸钾饱和溶液（30 g溶于8 mL蒸馏水）、硝酸镁饱和溶液（25 g溶于3 mL蒸馏水）或溴化锂饱和溶液（8 g溶于1 mL蒸馏水）置于干燥器底部。干燥器用带传感器（SK-L700R-TH-2；Sato Keiryoki Mfg.，东京，日本）的硅胶塞（6-336-05；AS ONE，大阪，日本）密封，使用温湿度数据记录仪（SK-L700R-TH；Sato Keiryoki Mfg.）每小时记录一次湿度，如图S1所示。在指定时间点，将孔板从干燥器中取出，向每孔加入100 µL PBS，通过移液吹打重悬样品，然后在室温放置20分钟进行再水化。
菌落形成单位（CFU）计数
在PBS中制备系列稀释液，取100 µL各稀释液涂布于R2A琼脂平板（396–01611；Shiotani M.S.，兵库县尼崎市，日本）。平板过夜培养后计数菌落，并考虑稀释倍数计算CFU/mL。
ATP测定
将细胞悬液（干燥前1 × 10⁷ CFU/mL）与BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay试剂（Promega，Madison，WI，USA）按1:1混合，各取100 µL加入白色96孔板（353296；Corning）中。孵育3分钟后，使用酶标仪（Infinite 200 PRO M Plex；Tecan Group，Männedorf，瑞士）测量发光值。发光值归一化至干燥前信号（设为100%），计算相对ATP水平。
甲苯降解实验
细胞在含4 mL LB培养基（补充2 µL甲苯）的50 mL离心管中过夜预培养。随后按1:100比例接种至500 mL挡板摇瓶中的100 mL LB培养基（含50 µL甲苯）。摇瓶用Viton塞密封，于28°C、115 rpm振荡培养16小时。测定OD660后，取5 mL培养液（调整至OD660 = 2.0），通过真空过滤固定到玻璃滤膜（1825-047；Cytiva，Marlborough，MA，USA）上。带有固定化细胞的滤膜在干燥器中按上述干燥实验的湿度控制条件孵育。在此24小时孵育期间，将50 µL液体甲苯置于干燥器内，以诱导/维持甲苯分解代谢基因的表达。24小时后，向滤膜加入600 µL PBS进行再水化，然后将玻璃滤膜转移至50 mL小瓶中，用Teflon覆膜盖（5-112-7；Maruemu，大阪，日本）密封。降解实验中，用微量进样器向小瓶内加入5 µL液体甲苯，避免与滤膜接触，小瓶于28°C孵育。甲苯仅通过顶空向细胞供给，PBS仅用于提供水分，不作为底物输送的液相主体。（实验装置照片见图S1。）
使用配备火焰离子化检测器的气相色谱仪（GC-FID）（GC-2014；Shimadzu，京都，日本）定量顶空中的甲苯。使用HP-5MS UI毛细管柱（30 m长，0.25 mm内径；Agilent，Santa Clara，CA，USA），以氮气为载气。使用气密注射器（1710 N PST-2；Hamilton，Reno，NV，USA）从小瓶抽取50 µL顶空气体，注入GC-FID系统。柱温箱温度在50°C保持1分钟，然后以20°C/min升温至80°C。载气总流量为19 mL/min，分流比设为5:1。
RNA测序
干燥后的Tol 5细胞置于24孔板（92424；TPP Techno Plastic Products，Trasadingen，瑞士）中，用PBS重悬后立即离心收集（10,000×g，25°C，3分钟），不进行任何有意的恢复孵育，细胞沉淀保存于-80°C。每种干燥条件制备三个生物学重复。使用Cica Geneus RNA Prep Kit (for Tissue) 2（Kanto Chemical，东京，日本）按制造商方案提取总RNA。使用NEBNext rRNA Depletion Kit (Bacteria)（New England Biolabs，Ipswich，MA，USA）去除核糖体RNA，使用NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina（New England Biolabs）构建cDNA文库。cDNA文库在Illumina NextSeq550上测序。原始FASTQ读段使用fastp（版本0.23.2）进行质量过滤，使用Bowtie2（版本2.5.1）默认参数比对至Tol 5基因组（登录号：AP024708和AP024709）。使用featureCounts（版本2.0.6）对比对读段进行计数。
差异基因表达分析
CDS的原始读段计数在R中使用edgeR包（版本3.42.4）分析。使用filterByExpr函数去除表达极低的基因。使用calcNormFactors函数中实现的trimmed mean of M-values（TMM）方法进行归一化。使用准似然流程进行差异基因表达分析。以> 95% RH条件为参考，8% RH和52% RH条件为对比，构建设计矩阵。使用estimateDisp函数获得离散度估计，使用glmQLFit函数进行模型拟合。使用glmQLFTest函数评估各条件间的差异基因表达。以错误发现率（FDR）< 0.01且|log2倍数变化（FC）| > 1为标准提取显著差异表达基因。基因功能使用多个数据库注释，包括NCBI数据库、UniProtKB/Swiss-Prot数据库、KEGG数据库和eggNOG数据库，如前所述[21]。此外，使用COGclassifier[41]通过RPS-BLAST搜索直系同源基因簇（COGs）数据库[40]对基因进行分类。
统计分析
除非另有说明，所有实验均使用三个独立生物学重复（n = 3）。数据以平均值±标准差（SD）表示。对于CFU和ATP实验，使用GraphPad Prism（版本11.0.0；GraphPad Software，Boston，MA，USA）中的双因素方差分析（菌株×时间）分析Log10转换的CFU和相对ATP水平。使用Dunnett多重比较检验将各菌株与Tol 5 ΔataA进行比较。报告调整后P值，统计显著性设为P < 0.01。对于气体实验（原文未详述具体统计方法）。
图1 干燥过程中CFU的时间变化。在指定时长的干燥后定量CFU。细胞在（A）8% RH、（B）52% RH或（C）> 95% RH条件下孵育。纵轴表示CFU，横轴表示干燥天数。误差线表示平均值±标准差（生物学重复，n = 3）
图2 干燥过程中胞内ATP水平的时间变化。在干燥后测量胞内ATP。细胞在测定前于（A）8% RH、（B）52% RH或（C）> 95% RH条件下孵育。纵轴表示相对于干燥前值（设为100%）的ATP水平，横轴表示干燥天数。误差线表示平均值±标准差（生物学重复，n = 3）
研究结果
本研究评估了Tol 5作为气相过程底盘菌株在受控干燥（8%、52%和> 95% RH）后的活力、能量状态和气相甲苯降解能力，并与Acinetobacter baylyi ADP1、Pseudomonas putida和Escherichia coli进行比较。为尽量减少干燥后测量中与黏附相关的偏差，实验中使用ataA缺陷型Tol 5突变体（Tol 5 ΔataA）。
干燥存活率
Acinetobacter菌株在16天干燥期间保持高存活率，而P. putida和E. coli在8% RH和52% RH条件下表现出显著的活力丧失。如图1所示，在8% RH条件下，P. putida和E. coli的CFU随干燥时间急剧下降，而两种Acinetobacter菌株（Tol 5 ΔataA和ADP1）的CFU维持在较高水平。在52% RH条件下，观察到了相似的趋势。而在> 95% RH条件下，所有测试菌株均保持相对较高的存活率。
胞内ATP水平
胞内ATP测量进一步表明，干燥降低了所有菌株的胞内ATP水平，但E. coli在8%和52% RH条件下迅速耗竭ATP，而Acinetobacter菌株和P. putida保留了胞内ATP（图2）。在8% RH条件下，E. coli的ATP水平下降最为剧烈，而Tol 5 ΔataA和ADP1的ATP水平虽然也有所下降，但保持了相对较高的水平。
干燥后甲苯降解能力
图3 干燥后甲苯降解能力。通过密封含有固定化细胞和甲苯的小瓶，监测甲苯的减少来评估甲苯降解。（A）非干燥细胞作为对照。细胞在测定前于（B）> 95% RH、（C）52% RH或（D）8% RH条件下孵育1天。Blank表示无细胞孵育的结果。纵轴表示根据顶空甲苯浓度下降计算的甲苯降解效率，归一化至甲苯添加后2小时测得的顶空浓度。横轴表示甲苯添加后的时间。误差线表示平均值±标准差（生物学重复，n = 3）。星号表示统计学显著性（P < 0.05，Welch's t检验）
在气相甲苯降解实验中，固定化Tol 5在干燥后比P. putida mt-2保持了更高的甲苯降解活性（图3）。非干燥对照组中，Tol 5 ΔataA和P. putida mt-2均表现出较高的甲苯降解效率。经> 95% RH处理1天后，Tol 5 ΔataA仍保持较高的降解活性。在52% RH和8% RH条件下干燥1天后，Tol 5 ΔataA的甲苯降解活性虽有下降，但仍显著高于P. putida mt-2。P. putida mt-2在8% RH干燥后几乎完全丧失了甲苯降解能力。
转录组响应
图4 Tol 5对不同相对湿度干燥的转录组响应。（A）Tol 5在> 95% RH、52% RH和8% RH干燥后全基因组转录组图谱的主成分分析（PCA）。每个点代表一个独立的生物学重复。各主成分解释的方差百分比标注在坐标轴上。（B）以> 95% RH为参考，8% RH（左）和52% RH（右）条件下差异基因表达的火山图。红点和蓝点分别代表显著上调和下调的基因（|log₂FC| > 1，FDR < 0.01）。（C）基于COG的（B）中鉴定到的DEGs功能分类。环形图总结了各条件下DEGs的功能组成。外环显示四个COG超类别的分布，内环显示25个COG功能类别的分布
转录组分析揭示了Tol 5的多层响应机制，涉及DNA和RNA维护、细胞包膜转运和重塑、氧化还原响应功能，以及生长相关代谢的广泛抑制（图4）。主成分分析（PCA）显示，不同湿度条件下的转录组图谱明显分离，其中8% RH和52% RH条件下的转录组与> 95% RH条件有显著差异。火山图展示了在8% RH和52% RH条件下相对于> 95% RH参考的差异表达基因分布。COG功能分类显示，差异表达基因涉及多个功能类别，包括细胞包膜生物发生、翻译、能量产生与转换等。
图5 选定的差异表达基因（DEGs）突显湿度依赖性响应。列显示相对于> 95% RH各条件下的基因座标签、基因符号、预测功能、log₂FC、log₂（TPM + 1）和FDR调整P值
图5列出了选定的差异表达基因，展示了湿度依赖性响应。这些基因包括与DNA修复、RNA维护、细胞包膜功能、氧化还原平衡以及生长代谢相关的基因，其表达水平随干燥条件的不同而变化。
讨论与解读
本研究结果表明，Acinetobacter属，特别是Tol 5菌株，是气相生物过程的有前景的底盘菌株候选者。与P. putida和E. coli相比，Acinetobacter菌株在极端干燥条件下（8% RH和52% RH）保持了更高的存活率和胞内ATP水平，并在干燥后维持了更强的甲苯降解活性。转录组分析揭示了Tol 5应对干燥胁迫的多层防御机制，包括核酸维护、细胞包膜重塑和氧化还原平衡等途径。这些发现为理解细菌干燥耐受机制提供了新视角，也为在低水活度条件下稳定细菌细胞提供了潜在的机制靶点。
编译者解读
从合成生物学应用角度看，该研究选择Tol 5作为底盘菌株具有明确的应用导向——其天然的高黏附特性恰好满足气相反应器中细胞固定的需求，而本研究证实了其干燥耐受性同样出色。方法上，使用ataA缺陷突变体排除黏附干扰，保证了不同菌株间比较的公平性。值得关注的是，该研究将转录组数据与表型（存活率、ATP、降解活性）关联分析，为后续理性工程改造提供了靶基因线索。局限在于实验均在实验室规模进行，气相反应器中的实际表现仍需放大验证。未来若能将鉴定的关键耐受基因导入其他工业菌株，或可拓展气相生物过程的底盘选择范围。
参考来源
Yoshimoto S, Yamada H, Inoue S, Hori K. Desiccation-tolerant Acinetobacter as a robust chassis candidate for gas-phase bioprocesses. J Biol Eng. PMID: 41872925.
PMID: 41872925