来源：Plant Biotechnol J | 编译：DNA Lab Space
静脉活性化合物地奥司明（Diosmin）传统上依赖化学半合成——从橙皮苷脱氢制备。这项研究绕开化学路线，在植物体内完整搭建了地奥司明及其类似物的生物合成通路，并在番茄和烟草中成功实现了异源生产。研究者从野菊（Chrysanthemum indicum）中筛选并鉴定了关键酶基因，借助一种基于同尾酶的多基因堆叠策略，将五个酶基因一次性导入番茄和烟草基因组。转基因番茄果皮中地奥司明含量达到474 ng/g DW，烟草叶片中检出地奥司明、蒙花苷和异蒙花苷三种目标产物。这是首次在产黄酮醇的植物中实现O-甲基化和鼠李糖基化黄酮双糖苷的异源生物合成。
研究背景
地奥司明属于黄酮类化合物，常作为膳食补充剂使用，也用于制备治疗静脉疾病的静脉活性药物。传统制备工艺依赖化学半合成：以黄烷酮糖苷橙皮苷为原料，通过脱氢反应获得地奥司明。这一路线存在步骤繁琐、副产物多、环境负担重等问题。
植物体内天然存在黄酮鼠李糖苷类化合物的合成途径。野菊中富含多种黄酮类代谢物，其花和花蕾中大量积累柚皮素、圣草酚、木犀草素和芹菜素等关键中间产物。此前研究已在野菊中发现了黄酮合酶（FNSII）和鼠李糖基转移酶（RhaT），但完整的生物合成通路尚缺两个关键酶——催化黄酮B环4'-羟基甲基化的O-甲基转移酶（F4'OMT），以及催化7-O-葡萄糖基化的葡萄糖基转移酶（F7GlcT）。
补齐这两个酶，就能打通从柚皮素到地奥司明的完整合成线路。本研究的目标正是筛选并表征这两个关键酶，再将整套通路组装进农作物底盘，实现目标产物的异源生产。
研究方法
候选基因筛选与鉴定
研究者首先用HPLC-MS分析了野菊不同组织的代谢物谱。花和花蕾中柚皮素、圣草酚、木犀草素、芹菜素等黄酮通路关键中间体含量较高，此前鉴定的FNSII基因（Unigene0043683）也在花和花蕾中高表达。基于此，研究者将筛选重点锁定在叶片、花和花蕾中高表达的甲基转移酶和葡萄糖基转移酶基因。
野菊转录组测序数据库中注释为氧甲基转移酶的基因有两个：Unigene0020994和Unigene0037029。其中Unigene0020994编码的蛋白被命名为CiFOMT。注释为葡萄糖基转移酶的基因有六个：Unigene0041339、Unigene0044495、Unigene0067064、Unigene0007317、Unigene0063126和Unigene0067064（原文所列基因编号，后文以F7GlcT简称指代所筛选到的功能基因）。
对候选基因编码蛋白进行序列分析和功能表征，确认了F4'OMT催化黄酮B环4'-羟基的甲基化修饰，F7GlcT催化7-O-葡萄糖基化反应。这两个酶与前期发现的FNSII、RhaT共同构成完整的地奥司明合成通路——从柚皮素出发，经FNSII生成芹菜素，经F7GlcT生成7-O-葡萄糖苷，经F4'OMT完成4'-O-甲基化，再经RhaT连接鼠李糖基，最终生成地奥司明及其类似物蒙花苷（linarin）和异蒙花苷（isorhoifolin）。
多基因堆叠载体构建
多基因共表达是植物合成生物学的一大瓶颈。本研究采用同尾酶（isocaudarner）策略构建多基因载体。同尾酶识别不同的限制性酶切位点，但切割后产生相同的粘性末端，这使得多个基因表达盒可以按顺序串联插入同一载体，避免了传统多步克隆中酶切位点重复的麻烦。
通过这一策略，研究者将FNS、OMT、GlcT和RhaT四个酶基因组装进一个多基因载体。构建完成后，载体分别转化番茄和烟草。
植物转化与栽培
番茄转化采用Solanum lycopersicum cv. 'MicroTom'品种——一种矮化模式番茄，生长周期短、转化效率高。烟草转化采用Nicotiana tabacum。转化后的植株在温室条件下培养，按常规农艺管理。原文摘要未详述农杆菌菌株、侵染浓度、共培养时间、筛选抗生素种类及浓度等具体转化参数。
代谢物提取与定量分析
转基因番茄和烟草收获后，分别取番茄果皮和烟草叶片进行代谢物提取。样品经冷冻干燥、研磨、有机溶剂提取后，用HPLC-MS进行分析。代谢物定量以标准品制作标准曲线，结果以每克干重（DW）中含有的目标化合物纳克数表示。原文摘要未详述提取溶剂种类、提取温度与时间、色谱柱型号、流动相梯度、质谱离子模式等分析参数。
研究结果
转基因番茄中的地奥司明积累
多基因载体转化番茄后，目标通路在植株中成功表达。转基因番茄果皮中检测到地奥司明，含量为474 ng/g DW。这是首次在番茄果实中实现地奥司明的异源生物合成。
番茄果皮是类黄酮积累的主要部位，这一结果与番茄内源黄酮代谢的组织分布特征相符。474 ng/g DW的产量虽然远低于化学合成规模，但证明了完整通路在异源植物底盘中的功能性。
转基因烟草中的多种目标产物积累
转基因烟草叶片中同样检测到目标产物。地奥司明含量为20.5 ng/g DW，蒙花苷（linarin）含量为299.5 ng/g，异蒙花苷（isorhoifolin）含量为2.8 ng/g。三种产物在烟草叶片中同时积累，表明转入的四个酶基因均发挥了功能，且代谢流能够分流至不同分支产物。
蒙花苷和异蒙花苷是地奥司明的结构类似物——蒙花苷为芹菜素-7-O-芸香糖苷，异蒙花苷为芹菜素-7-O-葡萄糖苷。它们在烟草叶片中的积累水平存在差异：蒙花苷含量比地奥司明高约14倍，比异蒙花苷高约107倍。这种差异反映了不同分支路径的代谢通量分配——鼠李糖基化步骤的效率、底物特异性以及内源酶对通路的干扰都可能影响最终产物分布。
内源酶与代谢流的影响
研究讨论了内源酶和代谢流对目标化合物生产的影响。烟草和番茄本身含有黄酮醇合成通路，内源黄酮醇合酶（FLS）与转入的黄酮合酶（FNSII）竞争共同底物。此外，内源糖基转移酶可能对异源产物进行额外的糖基化修饰，改变最终产物谱。原文摘要未详述具体的内源酶干扰数据或代谢流分析结果。
异源生物合成的首次尝试
研究者指出，这是首次在产黄酮醇的植物中实现O-甲基化和鼠李糖基化黄酮双糖苷的异源生物合成。此前黄酮糖苷的微生物合成多在大肠杆菌或酿酒酵母中进行，植物底盘的优势在于具有完整的内质网系统和液泡储存能力，适合膜定位的细胞色素P450酶（如FNSII）的功能表达。
讨论与展望
这项研究的核心价值在于通路补全和底盘验证两个层面。通路层面，CiFOMT和F7GlcT的鉴定补齐了地奥司明生物合成缺失的酶学证据，使从柚皮素到地奥司明的完整酶促路线得以闭合。底盘层面，同尾酶多基因堆叠策略在番茄和烟草中一次转化即实现了五个基因的共表达，绕开了多轮杂交或多次转化的繁琐流程。
产量方面，474 ng/g DW和20.5 ng/g DW的水平距离商业化生产仍有很大距离。但作为概念验证，这一结果证明了植物底盘合成地奥司明的技术可行性。后续优化方向可能包括：组织特异性启动子驱动通路基因在果实或叶片中高表达、RNAi抑制内源竞争通路（如FLS）、前体喂饲增强代谢流、以及利用基因编辑在基因组安全位点整合多基因盒。
野菊中筛选到的酶在番茄和烟草中表现出功能活性，说明这些酶具有较好的跨物种兼容性。但不同产物在烟草叶片中的含量差异提示，分支路径的代谢通量分配仍需精细调控。蒙花苷的积累量远高于地奥司明，可能反映了鼠李糖基转移酶对底物的偏好性，或者内源酶对中间产物的竞争性转化。原文摘要未提供这些差异的具体机制分析。
参考来源
Zhang Q, Wu Q, Shi W, Deng Y, Zhan R. Engineering of the Flavone Rutinoside Biosynthetic Pathway Enables Production of Diosmin, a Venoactive Compound in Solanum lycopersicum and Nicotiana tabacum. Plant Biotechnol J. PMID: 41230737.
PMID: 41230737