来源：Small | 编译：DNA Lab Space
活体生物治疗产品（LBPs）正在成为能定点干预疾病的“活药物”，但如何让细菌表面同时展示多种功能模块，还能随时拆卸重组，一直是道难题。韩国学者近日在《Small》期刊报道了一种名为TriSCs（Tri-specific Scaffold Cells）的三特异性支架细胞，基于大肠杆菌Nissle 1917，通过三对正交的卷曲螺旋相互作用，实现了多种功能蛋白在细菌表面的自发、特异且可逆的共展示。这一“混匀即用”的策略，为精准诊疗和下一代工程化活体药物提供了新的平台思路。
研究背景
活体生物治疗产品是近年来合成生物学与医学交叉领域的热点。与传统药物不同，这类产品利用工程化细菌在体内特定部位发挥治疗功能，例如靶向肿瘤微环境、调节肠道菌群或递送治疗分子。然而，如何对细菌表面进行功能化修饰，始终是制约该领域发展的瓶颈。
现有策略主要依赖静态的基因融合或共价修饰。基因融合将目标蛋白直接与膜锚定域融合表达，操作简单但难以同时展示多个不同功能模块；共价修饰虽能实现部分功能化，但反应条件苛刻、可控性差，且一旦修饰完成便无法动态调整。这些方法在多重展示（multiplexing）和动态重构（dynamic reconfiguration）方面存在明显短板。
卷曲螺旋（coiled-coil）结构域为这一问题提供了新的解法。这类α-螺旋结构通过疏水界面和静电配对形成高度特异的异源二聚体，天然存在于多种蛋白质复合物中。若能设计多对互不干扰的正交卷曲螺旋对，就能在细菌表面构建一个“可编程插座”，让携带对应配对结构域的功能模块自发组装到细菌表面——需要展示哪个模块，就往体系里“混入”哪个模块，无需基因改造。
基于这一思路，研究团队在E. coli Nissle 1917（EcN）表面构建了三对正交卷曲螺旋，开发出TriSCs平台。EcN本身是一种被广泛研究的益生菌株，具备良好的安全性记录，是活体生物治疗产品的理想底盘。
研究方法
菌株与材料来源
E. coli Nissle 1917由浦项科技大学（POSTECH）的Gyoo Yeol Jung实验室惠赠。E. coli SHuffle T7（#C3026J）购自New England Biolabs。抗DR5纳米抗体（11H6）的基因序列来自专利[68]，抗EGFR纳米抗体（7D12）的基因序列参照Roovers等人[69]的描述。Ni-NTA琼脂糖购自Qiagen，截留分子量10 kDa的Amicon Ultra离心过滤器及Millicell EZ SLIDE 8孔玻璃腔室购自Merck。PD-10脱盐柱来自GE Healthcare。聚丙烯酰胺电泳使用Bio-Rad的Mini-PROTEAN系统，手灌胶按12%聚丙烯酰胺凝胶标准流程制备。质粒提取和凝胶回收试剂盒购自Bioneer。氯化钠、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠购自Samchun Chemical。小鼠抗6×His一抗（#MA1-21315）、小鼠抗FLAG标签抗体（#MA1-91878）、小鼠抗HA标签抗体（#26183）和Hoechst 33342均购自Thermo Fisher Scientific。山羊抗小鼠IgG（H+L）-HRP二抗购自GenDEPOT。未标记的Coil A′、Coil B′和Coil C′肽段由上海GL Biochem合成。RPMI-1640培养基、胎牛血清和青霉素-链霉素购自Thermo Fisher Scientific。其他化学品和试剂均购自Sigma-Aldrich。
细胞系与培养条件
HCT116（#10247）和Colo205（#10222）细胞系购自韩国细胞系库（Korean Cell Line Bank）。原文摘要未详述具体培养条件，但根据材料部分列出的试剂推断，细胞培养使用RPMI-1640培养基添加胎牛血清和青霉素-链霉素。
三特异性展示系统的设计
研究团队选用Lpp-OmpA融合蛋白作为EcN表面的锚定结构域。Lpp-OmpA是一种紧凑且经过充分表征的支架蛋白，已被广泛验证可用于异源蛋白的表面展示，且能以最小折叠负担实现高效定位。
三对卷曲螺旋的筛选遵循三项标准（表S3）：形成正交异源二聚体以确保无交叉反应的选择性结合；高结合亲和力以支撑稳健的表面组装；紧凑尺寸以最小化对膜定位和宿主代谢负担的干扰。
第一对是Coil A-Coil A′。选择它的理由在于关键七肽重复位置上的互补电荷分布——Coil A在e和g位置含有多个谷氨酸残基，同时在第五个七肽的g位置含有一个带正电的精氨酸，而Coil A′则提供相反的电荷排布（图S1A）。这种模式促进了定向静电配对。两条螺旋的第二个七肽中还含有天冬酰胺，起“天冬酰胺锁”作用，进一步稳定异源二聚体的形成。
第二对是Coil B-Coil B′，一种高度规则的合成拉链。其稳定性源于e和g位置上谷氨酸或赖氨酸的重复排列，形成延伸的盐桥梯（图S1B）。疏水界面几乎完全由a和d位置的缬氨酸和亮氨酸构成，产生紧密互锁的核心，有利于选择性和稳健的二聚化。
第三对是Coil C-Coil C′，引入了一种天然的、方向独特的相互作用模式。与平行拉链不同，这一对的相互作用方式在原文中未详述完整细节——原文摘要未详述具体参数。
表面展示与功能模块组装
三对卷曲螺旋的“正链”（Coil A、Coil B、Coil C）通过Lpp-OmpA锚定域展示在EcN外膜上，构成可重构的生物界面。对应的“负链”（Coil A′、Coil B′、Coil C′）则与功能模块融合表达。当功能模块与工程菌混合时，正负链通过卷曲螺旋相互作用自发组装，无需额外化学交联剂或基因操作。
功能模块验证实验
研究团队构建了三种功能模块用于验证TriSCs平台：DR5激动型纳米抗体（anti-DR5 nanobody，11H6）、EGFR靶向纳米抗体（anti-EGFR nanobody，7D12）和荧光报告蛋白。这些模块分别与不同的卷曲螺旋负链融合，通过“混匀即用”（mix-and-go）策略同时或选择性地展示在细菌表面。
体外抗肿瘤活性评估
将展示DR5激动型纳米抗体和EGFR靶向纳米抗体的工程菌与HCT116和Colo205肿瘤细胞共培养，评估其抗肿瘤活性。对照组为可溶性形式的纳米抗体组合。原文摘要未详述具体的共培养时间、效应细胞与靶细胞比例等参数。
荧光成像
将荧光报告模块通过卷曲螺旋组装到细菌表面后，使用Hoechst 33342进行核染色，通过实时荧光成像观察细菌与肿瘤细胞的相互作用。原文摘要未详述具体激发/发射波长等参数。
研究结果
三对正交卷曲螺旋的成功设计
研究团队成功设计并验证了三对正交卷曲螺旋：Coil A-Coil A′、Coil B-Coil B′和Coil C-Coil C′。这三对螺旋在序列层面经过精心设计，确保彼此之间不发生交叉反应。Coil A-Coil A′依靠互补电荷分布和天冬酰胺锁实现特异性配对；Coil B-Coil B′通过规则的盐桥梯和缬氨酸/亮氨酸疏水核心获得高稳定性；Coil C-Coil C′则引入了天然的方向选择性相互作用模式。原文摘要未提供各卷曲螺旋对的具体结合亲和力数值（如Kd值）。
“混匀即用”的多模块共展示
TriSCs平台的核心优势在于其“混匀即用”特性——只需将携带不同卷曲螺旋负链的功能模块与工程菌混合，即可实现自发、特异且可逆的组装。实验证实，三种不同的功能模块可以同时展示在细菌表面，且互不干扰。这种正交性意味着用户可以根据需要，灵活组合不同的功能模块，实现真正的可编程表面展示。
表面组织化信号增强抗肿瘤活性
在功能验证中，研究团队将DR5激动型纳米抗体和EGFR靶向纳米抗体同时展示在TriSCs表面。结果显示，这种表面共展示策略产生的抗肿瘤活性优于可溶性纳米抗体组合。这一结果凸显了表面组织化信号传导的重要性——当两个纳米抗体以精确的空间排布展示在细菌表面时，它们能够更有效地协同激活DR5死亡受体信号通路，从而增强对肿瘤细胞的杀伤效果。原文摘要未提供具体的细胞活力百分比或IC50数值。
实时荧光生物成像
将荧光报告模块通过卷曲螺旋组装到细菌表面后，TriSCs平台成功实现了实时生物成像。这一结果表明，该平台不仅适用于治疗性功能模块的展示，还能兼容成像报告模块，为治疗诊断一体化（theranostics）提供了可能。原文摘要未提供具体的成像分辨率或荧光强度数据。
平台的可逆性与动态重构能力
由于卷曲螺旋相互作用是非共价的，TriSCs平台具备可逆性——功能模块可以在需要时从细菌表面解离，更换为其他模块。这种动态重构能力是传统基因融合或共价修饰策略无法实现的，为活体生物治疗产品的“按需定制”奠定了基础。原文摘要未详述模块解离和重新组装的具体条件。
讨论与展望
TriSCs平台的价值在于它将正交性、可逆性和多重展示能力集于一身。三个独立的卷曲螺旋对如同三个互不干扰的“接口”，让细菌表面变成了一个可编程的展示面板。相比静态基因融合，这种策略无需每次更换功能模块都重新构建工程菌株；相比共价修饰，这种非共价组装更加温和、可逆，也更适合体内应用场景。
研究团队选择DR5激动型纳米抗体和EGFR靶向纳米抗体作为验证模块，具有明确的临床指向。DR5是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）通路的关键受体，激活后可诱导肿瘤细胞凋亡；EGFR则在多种实体瘤中高表达。将两者以精确的空间排布共展示在细菌表面，模拟了天然免疫突触中的受体聚集效应，这可能是其抗肿瘤活性优于可溶性组合的机制基础。
当然，从目前的体外验证到真正的体内应用，还有很长的路要走。原文摘要未提供体内实验数据，也未涉及工程菌在复杂生理环境中的稳定性、安全性或免疫原性评估。此外，卷曲螺旋组装的长期稳定性、模块在体内的解离动力学等问题，也需要进一步研究。但无论如何，TriSCs为活体生物治疗产品的表面功能化提供了一种全新的范式——一种可编程、可重构、多功能的“活支架”，有望推动精准诊疗和下一代生物工程化治疗药物的发展。
参考来源
Cho YJ, Lee GJ, Park JH, Lim SI. Orthogonal Tri-Modular Coiled-Coil Assembly for Programmable Multi-Cargo Display on Escherichia coli Nissle 1917. Small. PMID: 41860170.
PMID: 41860170