机器学习辅助设计严格正交生物传感器

📅 2026-08-14 📰 J Adv Res 2026 Jun 📂 研究进展 👁 21

来源：J Adv Res | 编译：DNA Lab Space

导读

转录因子通过结合特定信号分子激活转录，但设计能精准识别非天然信号分子的转录因子一直是合成生物学的难题。本研究以BmoR为模型，结合机器学习与半理性设计，鉴定控制信号分子正交性的关键残基区域（CRRs），获得具有严格信号分子正交性的BmoR突变体。该生物传感器成功用于筛选异戊醇高产菌株，摇瓶及补料分批发酵产量达12.6 g/L。

研究背景

转录因子（TFs）通过结合特定信号分子（SMs）激活转录起始，然而设计能够精准靶向非天然信号分子的TFs仍然充满挑战。BmoR作为一种能够响应戊醇和丁醇等信号分子的转录因子，其天然配体谱较宽，限制了其在生物传感中的应用。本研究旨在通过机器学习指导的蛋白质工程策略，重塑BmoR的信号分子正交性，使其能够严格区分结构相似的醇类分子（正戊醇、异戊醇、正丁醇、异丁醇），并应用于微生物细胞工厂的高通量筛选。

研究方法

本研究采用随机森林算法构建了模型BT，用于定位控制信号分子正交性的关键残基区域（CRRs）。具体方法如下：

1. 训练数据集构建：通过易错PCR构建了包含245个BmoR突变体的训练数据集，以突变体对四种信号分子（正戊醇、异戊醇、正丁醇、异丁醇）的响应值作为输出。分子模拟量化了五个结构参数（BSH计数、突变位点所在结构域、突变位点所在二级结构、突变位点至SBD距离、突变前后残基特性），与输出配对形成训练数据。

2. 模型BT训练与验证：使用随机森林算法对208个突变体进行训练生成模型BT，剩余37个突变体用于测试模型BT的准确性。

3. 计算模拟：模型BT预测了BmoR N端信号分子识别区域（残基1–300）内5,700个饱和突变体对四种信号分子的响应值。使用Discovery Studio进行批处理，生成22,800个复合物结构（5,700个饱和突变体分别与四种SM配对），用于识别CRRs。

4. CRRs半理性改造：针对CRRs内的残基，使用简并引物构建精确突变文库。通过两轮荧光激活细胞分选（FACS）对突变文库进行高通量筛选，验证所得突变体的突变位点及其对四种信号分子的响应值。

5. 亲和力验证：通过微量热泳动（MST）亲和力测定验证BmoR突变体与信号分子的结合特性。

6. 理性设计：将M94V/F272L或S240P突变分别引入BmoR A117T/F163Y中，抑制其对正丁醇的敏感性，实现严格的正戊醇正交性；将M94V/F272L或S240P突变分别引入BmoR W128R中，实现严格的异戊醇正交性。

7. AlphaFold建模：使用AlphaFold 2.0和AlphaFold 3.0分别模拟野生型BmoR的六聚体结构，鉴定链A与链B之间关键残基的11种相互作用。

8. 发酵验证：将具有严格正交性的BmoR突变体（BmoR M94V/W128R/F272L）应用于异戊醇高产菌株的筛选，并进行3 L补料分批发酵验证。

研究结果

实验验证了245个TF-SM复合物的转录激活效应，为生成基于机器学习的模型BT提供了训练和测试数据集，模型BT的准确率达88.5%。通过Discovery Studio模拟了5,700个BmoR突变体与四种信号分子的结合，生成22,800个复合物，输出BmoR-SM氢键（BSH）计数。BSH计数与补充参数共同构成预测数据集。模型BT成功预测了包含36个残基的CRRs。

▲ 机器学习辅助半理性设计BmoR以实现严格正交性。通过机器学习鉴定了控制BmoR信号分子正交性的关键残基区域（CRRs）。通过对CRRs的半理性设计，BmoR实现了严格信号分子正交性（SSO）。（A）整合机器学习与BmoR半理性设计并实现SSO及其在异戊醇生产中应用的工作流程概述。建立了一种机器学习驱动的方法来工程化转录因子BmoR以实现SSO。该方法精确定位了CRRs，从而实现了BmoR突变体的半理性工程。

图3显示了机器学习驱动的CRRs鉴定过程。模型BT的混淆矩阵评估结果显示，37个突变体的预测分类与实验响应值具有较高的一致性。部分依赖图表明，BSH计数显著影响BmoR对四种信号分子的响应。模型BT预测了5,700个饱和突变体对四种SM的响应值，二值输出"0"表示突变显著改变BmoR-SM结合的残基，"0"频率越高表示功能影响越大。具有显著结合影响的残基及其邻近残基被归类为CRRs。

▲ Machine learning-driven identification of the CRRs for SM orthogonality. (A) The whole process of machine learning-driven identification of the CRRs for SM orthogonality. Dataset construction. A training dataset of 245 error-prone PCR mutants was generated, and the response values to four SMs were t

对CRRs进行半理性改造后，获得了具有严格信号分子正交性的BmoR突变体。图4展示了双正交突变体的工程与筛选过程。BmoR A117T/F163Y在10 mM信号分子存在下的绿色荧光显示，该突变体对正戊醇和异戊醇有响应，而对正丁醇和异丁醇几乎无响应。响应曲线进一步证实了其正交性。分子模拟显示BmoR A117T/F163Y与正戊醇或正丁醇的结合模式存在差异。在10 mM正戊醇或异戊醇浓度下，梯度增加正戊醇或异戊醇浓度（0–60 mM），证实了BmoR A117F/F163Y对正戊醇和正丁醇的正交性。BmoR W128R则表现出对异戊醇的严格正交性——在10 mM信号分子存在下仅对异戊醇有强响应，对正戊醇、正丁醇和异丁醇响应极弱。梯度实验（0–60 mM）进一步确认了BmoR W128R对异戊醇和正丁醇的正交性。

▲ Engineering of the CRRs for screening mutants with dual orthogonality. (A) The whole engineering and screening process of the mutagenesis library of the CRRs. A precise mutagenesis library targeting the residues within the CRRs was constructed using degenerate primers. High-throughput screening of m

图5展示了严格正交突变体的理性设计过程。将M94V/F272L或S240P突变引入BmoR A117T/F163Y后，获得的BmoR M94V/A117T/F163Y/F272L和BmoR A117T/F163Y/S240P在10 mM SM存在下的绿色荧光显示，其对正丁醇的敏感性被抑制，同时保留了对正戊醇的响应能力。梯度实验（0–60 mM）证实了BmoR M94V/A117T/F163Y/F272L对正戊醇的严格正交性。类似地，将M94V/F272L或S240P突变引入BmoR W128R后，获得的BmoR M94V/W128R/F272L和BmoR W128R/S240P实现了对异戊醇的严格正交性。野生型BmoR、BmoR M94V/A117T/F163Y/F272L和BmoR M94V/W128R/F272L对四种SM的分数结合拟合图进一步验证了突变体的正交性。

▲ Rational design of mutants with strict orthogonality. (A) The rational design process of BmoR A117T/F163Y . The mutation sites M94V/F272L or S240P could enable BmoR to selectively sense isobutanol over n -butanol while retain pentanol responsiveness. These mutations were individually introduced into

图6验证了严格正交突变体在乙醇干扰下的稳健性。在100 mM乙醇存在下，携带不同BmoR突变体的菌株绿色荧光显示，乙醇本身不会触发响应。响应曲线表明BmoR突变体对乙醇无响应。在300 mM乙醇噪声背景下，梯度增加正戊醇或异戊醇浓度（0–60 mM），BmoR M94V/A117T/F163Y/F272L对正戊醇的正交性和BmoR M94V/W128R/F272L对异戊醇的正交性均得到保持。

▲ Robust orthogonality validation against ethanol interference. (A) The whole detective process of the flavor compounds in wine fermentation. The by-products including n -pentanol, isopentanol, n -butanol and isobutanol influenced the mouthfeel of the wine. SSO-enabled BmoR-based biosensor could monit

图7展示了BmoR六聚体建模结果。AlphaFold 2.0和AlphaFold 3.0分别模拟了野生型BmoR的六聚体结构。链A与链B之间关键残基存在11种相互作用。对11个关键残基进行丙氨酸替换后，测定了其对10 mM SM的响应值。对BmoR A117F/F163Y和BmoR W128R的Glu579位点进行饱和突变后，测定其对四种SM的响应值，结果显示Glu579位点的突变可进一步调节突变体的响应特异性。

▲ Modeling BmoR hexamer to identify key residues for pentanol orthogonality. (A) The hexamer structures of wild-type BmoR simulated by AlphaFold 2.0 and AlphaFold 3.0, respectively. (B) 11 interactions of the key residues between Chain A and Chain B. (C) The response values of alanine substitutions at

图8展示了严格正交突变体在异戊醇生产中的应用。在大肠杆菌中，正戊醇、异戊醇、正丁醇和异丁醇共享部分生物合成途径。野生型MG1655对正戊醇和异戊醇的耐受性测试显示，随着醇浓度增加，菌株生长受到抑制。从大肠杆菌MG1655衍生敲除菌株文库中，分别在20 mM和40 mM正戊醇压力下筛选获得耐受菌株，同样在20 mM和40 mM异戊醇压力下筛选获得耐受菌株。利用基于BmoR M94V/W128R/F272L的生物传感器，从戊醇耐受菌株中筛选获得异戊醇高产菌株。摇瓶发酵验证了该高产菌株的异戊醇生产能力。补料分批发酵中，异戊醇产量达12.6 g/L，副产物异丁醇的滴度同时被监测。生物量和葡萄糖浓度在补料分批发酵过程中的变化也被记录。统计检验显示，*P < 0.1，**P < 0.01（双尾t检验）。

▲ Application of strictly orthogonal mutant in isopentanol production. (A) The biosynthetic pathway of n -pentanol, isopentanol, n -butanol and isobutanol in E. coli . (B) The tolerance of wild-type MG1655 to n -pentanol and isopentanol. (C) Selection of the tolerance strains from a library of E. coli

讨论与解读

本研究通过机器学习指导的蛋白质工程策略，成功实现了BmoR转录因子的严格信号分子正交性改造。研究证实了BSH计数在TF-SM相互作用中的主导作用，建立了机器学习指导的转录因子进化框架。该框架为工程化具有精确分子识别能力的转录因子提供了理性设计原则，在合成生物学和代谢工程中具有广泛应用前景。

编译者解读：本研究的方法论亮点在于将机器学习与半理性设计有机结合——先用随机森林模型从245个突变体的小数据集出发，预测5,700个饱和突变体的响应行为，再通过Discovery Studio批量模拟22,800个复合物结构，实现了从"实验数据→计算预测→实验验证"的高效闭环。这种"干湿结合"策略大幅减少了实验筛选工作量。从应用角度看，获得严格正交性的BmoR突变体可直接用于发酵过程中目标醇类代谢物的实时监测，12.6 g/L的异戊醇产量也验证了该传感器在工业菌株筛选中的实用性。值得关注的是，该方法框架具有通用性，可推广至其他转录因子的正交性改造，为合成生物学传感元件的精准设计提供了可复用的技术范式。不过，当前策略仍依赖对已知转录因子结构的理解，对于结构信息匮乏的转录因子，其适用性有待进一步验证。

参考来源

Wu T, Yan D, Lin S, Zhang R, Wang Y. Design of strictly orthogonal biosensors for maximizing renewable biofuel overproduction. J Adv Res. PMID: 40939890.

PMID: 40939890

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