来源：J Phys Chem B | 编译：DNA Lab Space
木质素是自然界中最丰富的芳香族天然聚合物，被视为未来芳香族平台化学品的重要原料。然而，其在水相中的低溶解度长期制约着酶法解聚的效率。一项发表于《物理化学杂志B》的最新研究，系统考察了乙二醇/氯化胆碱基低共熔溶剂与甘氨酸缓冲液的混合体系，发现这一组合能显著提升木质素的溶解能力，同时保持β-醚酶级联反应的催化活性。该研究结合实验与分子动力学模拟，揭示了溶剂组分在分子层面如何影响木质素的溶解行为及其酶解效率。
研究背景
木质素作为植物细胞壁的主要组分，占木质纤维素生物质的15%至30%，是自然界中唯一大量存在的可再生芳香族资源。将其转化为高附加值芳香族平台化学品，是替代化石基路线的重要方向之一。然而，木质素分子结构复杂，含有大量苯丙烷单元通过C-O-C和C-C键连接，其中β-O-4键占比最高，可达50%以上。酶法解聚因其反应条件温和、选择性高而受到广泛关注，但木质素在水溶液中的溶解度极低，严重限制了酶与底物的有效接触。
向反应体系中添加共溶剂是改善木质素溶解度的常用策略。有机溶剂如DMSO已被证明可用于木质素酶解，但其对酶活性的抑制作用不容忽视。近年来，低共熔溶剂（DES）作为一种新型绿色溶剂，在木质素溶解方面展现出潜力。DES由氢键供体（HBD）与氢键受体（HBA）按一定摩尔比混合而成，具有可调性、低挥发性和良好的生物相容性。本研究聚焦于乙二醇基DES与甘氨酸缓冲液的混合体系，探讨其在β-醚酶催化的木质素解聚反应中的适用性。
研究方法
化学试剂与材料准备
研究采用1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-(2-甲氧基苯氧基)丙烷-1,3-二醇（GGE）作为木质素模型化合物，购自TCI公司（美国波特兰）。目标产物紫丁香基羟基丙酮（SHP）和愈创木基羟基丙酮（GHP）由索邦大学分子化学研究所的Alexandre Pradal博士提供。来自山毛榉木的Organosolv木质素K053由德国Fraunhofer CBP的Marlen Verges博士提供。
低共熔溶剂的制备
研究共制备了七种DES，通过将两种组分按特定摩尔比混合，在70°C下搅拌过夜而成。七种DES在室温下均为液态，但其中Res:ChCl（1:1）和Gu:ChCl（2:1）表现出高黏度特性，为后续酶解应用，这两种DES被加水稀释至80%（v/v）浓度。七种DES的具体组成如下：EG:ChCl 2:1、EG:ChCl 3:1、EG:ChCl 4:1（乙二醇/氯化胆碱）、EG:Bet 3:1、EG:Bet 4:1（乙二醇/甜菜碱）、Gu:ChCl 2:1（愈创木酚/氯化胆碱）和Res:ChCl 1:1（间苯二酚/氯化胆碱）。
合成基因与酶的表达
编码Cα脱氢酶LigN（WP_014077904）和LigD（WP_014075190）的合成基因来自鞘氨醇单胞菌SYK-6菌株，β-醚酶LigF-261（WP_104831261）来自黄海杆菌，谷胱甘肽裂解酶NaGSTNu（WP_011446237）来自芳香新鞘氨醇菌，谷胱甘肽酰胺还原酶TtGAR（WP_153973747）来自嗜温红螺菌。这些基因由Twist Bioscience公司（美国旧金山）合成，经过密码子优化以适配大肠杆菌表达系统，并已克隆至pET28a(+)表达载体（Merck公司，德国达姆施塔特）。
酶级联反应体系
酶解反应采用五酶级联体系，包含两个对映体互补的Cα脱氢酶、两个对映体互补的β-醚酶、一个非选择性谷胱甘肽裂解酶，以及一个用于原位辅因子再生的谷胱甘肽酰胺还原酶。
基于级联酶的pH依赖性，研究仅采用非酸性DES以维持反应体系pH 9.0，确保级联反应的最佳性能。有机共溶剂DMSO作为对照，因其已被证实适用于木质素酶解反应。
低木质素浓度下的DES筛选
首先考察不同DES（以乙二醇、愈创木酚或间苯二酚为HBD，以甜菜碱或氯化胆碱为HBA）对酶级联反应性能的影响。实验采用2 g L⁻¹的低木质素浓度，逐步增加共溶剂浓度（10%至60% v/v）。反应条件为30°C、1000 rpm振荡1小时，反应体积250 μL，包含400 mM甘氨酸/NaOH缓冲液（pH 9.0）、5 mM NAD⁺、8 mM GSH，以及各0.25 g L⁻¹的纯化酶。以解聚产物SHP和GHP的产量作为木质素解聚效率的读数。
高木质素浓度下的DES性能评估
在确定最优DES类型后，研究进一步考察高木质素浓度下的解聚效率。实验将木质素浓度提升至20 g L⁻¹和30 g L⁻¹，在60% v/v DES条件下进行反应。
分子动力学模拟
为深入理解溶剂组分对木质素溶解的分子机制，研究对木质素模型化合物GGE与溶剂混合体系（含甘氨酸缓冲组分）进行了详细的分子动力学（MD）分析。模拟聚焦于乙二醇、氯化胆碱和甘氨酸与GGE的相互作用模式，考察DES中EG与ChCl的比例如何影响GGE在溶剂体系中的溶剂化结构和动力学行为。
研究结果
不同DES对酶级联反应的影响
在低木质素浓度（2 g L⁻¹）条件下，不同DES对酶级联反应性能的影响呈现显著差异。以乙二醇为HBD的DES（EG:ChCl和EG:Bet系列）在10%至60% v/v浓度范围内均能维持酶的催化活性。相比之下，以愈创木酚和间苯二酚为HBD的DES（Gu:ChCl和Res:ChCl）对酶活性的抑制更为明显。
EG:ChCl 2:1在木质素溶解中的优势
在木质素溶解能力方面，EG:ChCl 2:1表现最为突出。该DES体系在60% v/v浓度下，能够支持高达30 g L⁻¹的木质素浓度而不丧失酶活性。这一结果证实了乙二醇基DES在保持酶活性与提高底物载量之间的良好平衡。
最高产物产率的反应条件
尽管EG:ChCl 2:1在溶解木质素方面表现最佳，但最高体积产率并非在此条件下获得。研究显示，当使用20 g L⁻¹木质素和50% v/v EG:ChCl 4:1时，目标单芳香族解聚产物GHP和SHP的体积产率达到最高。这一发现表明，木质素溶解能力与酶解效率并非简单正相关，溶剂体系对酶活性的微妙影响同样关键。
分子动力学模拟揭示的溶剂化机制
MD模拟结果揭示了溶剂组分在木质素溶解中的不同角色。乙二醇和甘氨酸对木质素溶解度起关键作用，而DES中EG与ChCl的比例则显著影响GGE在溶剂体系中的溶剂化结构和动力学行为。具体而言，乙二醇分子通过氢键与GGE的羟基和醚氧原子相互作用，形成稳定的溶剂化层；甘氨酸作为缓冲组分，不仅维持体系pH，还通过静电相互作用参与GGE的溶剂化过程。ChCl的比例变化会改变溶剂体系的氢键网络结构，进而影响GGE的扩散行为和局部构象动态。
酶级联反应的时间进程
在优化的反应条件下（20 g L⁻¹木质素，50% v/v EG:ChCl 4:1），酶解反应在1小时内即可完成，SHP和GHP的产率随反应时间呈近线性增长。这一时间尺度表明DES共溶剂并未显著降低酶的催化速率，反而通过提高底物溶解度增加了有效碰撞频率。
讨论与展望
本研究通过系统的实验筛选与分子动力学模拟相结合的策略，明确了乙二醇基DES在木质素酶法解聚中的独特优势。EG:ChCl 2:1和EG:ChCl 4:1在不同层面的优异表现提示，DES组成不仅影响木质素的溶解热力学，还深刻改变酶与底物的微观相互作用环境。MD模拟所揭示的乙二醇和甘氨酸的关键作用，为理性设计更高效的木质素溶解溶剂体系提供了分子层面的依据。
值得注意的是，最高溶解能力与最高产物产率并不对应同一DES配比，这意味着在实际应用中，需要根据具体工艺目标——追求最大底物载量还是最大产物收率——来优化溶剂组成。未来研究可进一步探索其他HBD/HBA组合对木质素溶解和酶活性的协同效应，并将这一策略拓展至其他木质素降解酶系。
参考来源
Schilke J, Sprick M, Schneider E, Ledezma Fierro JA, Pradal A. Efficient Lignin Dissolution and Enzymatic Depolymerization in Ethylene Glycol-Based Deep Eutectic Solvent Mixtures: Integrated Experimental and Molecular Dynamics Study. J Phys Chem B. PMID: 41668673.
PMID: 41668673