来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
蛋白质是生命功能的执行者，其工程化改造始终是合成生物学的核心挑战。定向进化曾以随机突变与高通量筛选策略斩获诺贝尔奖，却难以彻底脱离天然骨架的“历史包袱”；从头设计则试图从物理化学原理出发构建全新蛋白质，但成功率长期低迷。近日，由Xiong Wei等人发表于《Biochemical Engineering Journal》的综述与前瞻性论文“Protein engineering design from directed evolution to de novo synthesis”，首次系统性地梳理了从定向进化到完全从头合成的设计演化路径，并提出一种融合两种范式的迭代设计框架，为突破蛋白质设计瓶颈、实现全人工功能蛋白的“按需定制”提供了全新视角。这一工作不仅揭示了计算模拟与进化实验间的深层耦合机制，更展示了全合成蛋白质在工业酶催化与生物医药领域的巨大潜力。
研究背景
蛋白质工程的发展大致经历了三个标志性阶段。第一阶段是理性设计时代，依赖对三维结构的认知进行定点突变，但受限于结构解析的滞后和蛋白质构效关系的复杂性，成功案例屈指可数。第二阶段始于1993年Frances Arnold实验室提出的定向进化技术，通过反复易错PCR、DNA改组等方式在基因水平制造大量随机变异，并结合高效筛选体系“模仿”自然选择，无需完全了解结构即可获得功能优化突变体。这一策略大幅降低了设计门槛，推动了包括转氨酶、细胞色素P450在内的一系列工业酶的产业化，并在2018年荣膺诺贝尔化学奖。然而，定向进化本质上是在天然蛋白的序列空间内“爬坡”局部优化，其搜索范围通常局限于序列相似度高于60%的区域，很难产生全新生化功能，且高度依赖后续筛选通量。
为突破天然骨架的桎梏，从头设计（de novo design）应运而生。这一理念要求根据指定的功能位点（如催化三联体、金属结合中心等）反向设计一条能够自组装成立体结构并稳定容纳该位点的氨基酸序列。华盛顿大学David Baker实验室是这一领域的先驱，其开发的Rosetta软件套件和近年出世的深度学习模型ProteinMPNN等，已能够高效生成具有预定拓扑结构且能折叠成稳定三维构象的人工序列。2023年，Baker团队更实现了通过扩散模型按需生成结合特定抗原的迷你蛋白结合剂，标志着从头设计进入“功能生成”时代。尽管如此，从头设计的成功率仍不理想：直接从零设计具有高催化活性的全人工酶，成功率往往低于1%，许多设计虽然在计算机模拟中能量合理，但在实验中或表达失败，或无活性，或因动力学因素无法实际应用。造成这一鸿沟的根本原因在于现有能量函数对柔性、溶剂效应和动态构象采样的描述不够完备，且实验环境的复杂性难以完全模拟。
在此背景下，定向进化与从头设计这两种曾被视作对立范式的策略，逐渐展现出极强的互补性。定向进化擅长在“已有原型”的基础上进行快速功能优化；从头设计则能够创建自然界不存在的全新骨架和活性中心。将二者整合，通过计算设计生成最小的核心骨架，再由定向进化对其进行功能修补和适应性优化，有望打通“从无到有”再到“从有到优”的完整创新链条。Xiong Wei等的论文正是围绕这一融合思路，从方法论、工作流程和前沿案例等多维度梳理了蛋白质工程设计范式从定向进化走向从头合成的转折与未来方向。
研究思路与技术路线
该论文并非一项单一实验研究，而是基于大量前沿文献提出的整合型设计框架。作者们提炼出“计算预设计—定向进化优化—反馈再设计”的闭环技术路线，并将其划分为五个逻辑紧密衔接的阶段，实质上构建了一套蛋白质从部分人工到完全合成的工程化流水线，具体如下。
**第一阶段：骨架扫描与结构最小化**
以目标功能的天然蛋白质为出发点，利用多序列比对、残基共进化分析和分子动力学模拟，识别出维持折叠和功能所必需的“最小不可侵犯核心”。随后，借助RosettaRemodel等工具逐步截除非保守环区，收缩序列长度，同时保持骨架热力学稳定性。这一过程得到的“迷你骨架”天然成分占比可降至60%以下，但仍继承了祖先的折叠类型，为后续完全人工化提供了可进化的起点。
**第二阶段：深度突变扫描与序列-功能图谱构建**
对上述压缩骨架进行全位点饱和突变，结合微流控单细胞分选或噬菌体辅助连续进化（PACE）技术，在高温、有机溶剂或非天然底物等极端压力下实施大规模筛选。同时，利用二代测序对输入和选择的文库进行配对测序，计算每一个单氨基酸取代的富集系数，进而绘制出高分辨率的序列-功能适应度地图。该图谱能够明确区分活性关键区、可塑区与惰性区，为后续计算设计提供约束条件和可突变自由度。
**第三阶段：生成式深度学习驱动的全新序列生成
DOI: 10.1016/J.BEJ.2021.108096