来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
在合成生物学领域，如何突破天然蛋白质功能的边界一直是核心挑战。2025年，一项发表在《Nature Communications》上的研究为这一领域带来了令人瞩目的突破：研究人员首次实现了在活细胞内直接生物合成含有非天然氨基酸（ncAA）的人工酶，并通过定向进化策略使其催化效率提升了高达15倍。这项由Wei Huang等人完成的工作，不仅建立了“体内合成-遗传编码-定向进化”的全流程闭环，更展示了非天然氨基酸从“外源添加”到“内源生产”的范式转变，为构建功能全新的生物催化剂开辟了崭新的技术路径。
研究背景
天然蛋白质由20种标准氨基酸构成，这种有限的化学多样性极大地制约了酶的功能空间。非天然氨基酸的引入被认为是拓展蛋白质功能的重要手段，它能够赋予蛋白质新的化学基团、反应活性及结构特性。然而，长期以来，非天然氨基酸的遗传编码依赖于向培养基中外源添加这些昂贵的化学合成氨基酸，这不仅提高了成本，也限制了大体积或带电ncAA的跨膜运输效率。
近年来，合成生物学领域开始探索在细胞内直接生物合成非天然氨基酸的策略。通过异源表达来自微生物次级代谢途径的酶，理论上可以实现ncAA的原位生产，并将其直接用于蛋白质合成。但这一构想面临三重挑战：首先，需要重构高效的生物合成途径，使目标ncAA的胞内浓度达到足以支持蛋白质合成的水平；其次，必须保证正交翻译系统（氨酰tRNA合成酶/tRNA对）对该ncAA具有严格的特异性，避免与宿主天然氨基酸的交叉反应；最后，也是最具挑战性的，是如何对含有ncAA的人工酶进行高效的定向进化，因为传统的进化策略通常难以直接作用于非标准遗传密码子。
Wei Huang团队的这项研究正是针对上述挑战展开。他们以含有对氨基苯丙氨酸（pAF）的人工酶为模型，设计了一条从简单碳源到pAF的生物合成途径，并构建了相应的正交翻译系统。在此基础上，他们开发了一套针对非天然氨基酸依赖型人工酶的体内连续进化策略，成功实现了人工酶催化活性的显著提升。这一工作为构建具有全新功能的生物催化剂提供了从设计到优化的完整方案。
研究方法
本研究的技术路线环环相扣，可以概括为“生物合成途径构建—正交系统优化—体内连续进化”三大模块。
**非天然氨基酸的生物合成途径设计**
研究者首先选取对氨基苯丙氨酸（pAF）作为目标非天然氨基酸。pAF含有苯胺基团，能够为酶提供亲核催化位点，是设计人工醛缩酶等催化剂的理想构件。为了在细胞内实现pAF的原位生产，他们从大肠杆菌的莽草酸途径出发，设计了一条分支代谢途径。该途径的核心是将分支酸（chorismate）转化为4-氨基-4-脱氧分支酸（ADC），再经由氨基脱氧分支酸裂合酶的作用生成pAF和丙酮酸。研究团队从微生物基因组中挖掘并密码子优化了两个关键酶——ADC合酶（PapA）和ADC裂合酶（PapB），并将其整合到大肠杆菌基因组中，通过组成型启动子驱动表达，确保了pAF的持续供应。
**正交翻译系统的工程化改造**
在遗传编码层面，研究者选用了正交的Methanocaldococcus jannaschii酪氨酰tRNA合成酶（MjTyrRS）/tRNA对。他们基于此前报道的pAF特异性MjTyrRS突变体（pAFRS）进行了进一步优化。为提高pAF的掺入效率，团队对tRNA的表达水平进行了精细调控，通过构建不同强度的tRNA表达盒，筛选出能够平衡pAF掺入与细胞生长的最佳表达量。同时，他们利用报告基因系统（如sfGFP含有TAG终止密码子）实时监测pAF的掺入效率，确保在没有外源pAF添加的情况下，正交翻译系统能够依赖内源合成的pAF高效工作，且本底误掺入水平低于可检测阈值。
**人工酶的理性设计与定向进化**
研究的另一个关键环节是人工酶的设计与进化。他们以LmrR（一种乳酸乳球菌的多药抗性转录调控蛋白）为骨架，将其中央疏水空腔作为催化口袋，通过在特定位置引入pAF残基，构建了一个能催化不对称迈克尔加成反应的人工醛缩酶。半理性设计后，他们对活性中心周围的多个位点进行了组合饱和突变，构建了高质量突变体文库。
为了解决传统定向进化难以直接作用于非天然氨基酸残基的问题，研究团队开发了一种创新的“选择性压力偶联”策略。他们将人工酶的催化活性与宿主细胞的生长必需性状相偶联。具体而言，人工酶催化的反应产物对氨基苯丙酮酸能够被细胞内的下游代谢途径转化为多种芳香化合物，其中包括细胞生长所需的代谢物前体。通过控制代谢流，研究者使宿主细胞的生长速率与人工酶的催化效率直接挂钩。在连续传代过程中，携带高活性人工酶突变体的细胞将逐渐占据优势，从而实现自动富集。这一策略巧妙地绕开了对非天然氨基酸残基的直接筛选，将进化压力间接施加于整个催化体系。
研究结果
**成功实现pAF的原位生物合成与遗传编码**
研究结果表明，通过将PapA和PapB基因整合至大肠杆菌基因组，细胞能够在葡萄糖基础培养基中合成pAF并积累至接近毫摩尔级别的浓度。液相色谱-质谱联用分析确认了pAF的产生，且对外泌体的分析显示，pAF的泄漏量极低，提示其胞内有效浓度已满足蛋白质合成的需求。当携带pAFRS/tRNA系统的表达质粒被转化入上述工程菌后，在含有TAG终止密码子的sfGFP报告基因中，绿色荧光强度达到阳性对照（外源添加1 mM pAF）的80%以上。这一结果明确证明了原位合成的pAF能够被正交翻译系统有效识别并高效掺入，实现了真正意义上的“自给自足”式非天然氨基酸蛋白质合成。
**人工酶催化活性的定向进化提升**
通过连续传代与选择性压力偶联系统，研究团队在短短六轮进化后，分离获得了多个催化效率显著提高的突变体。其中最优突变体LmrR_pAF_AF4的催化效率（k_cat/K_m）相较于初始设计的人工酶提升了15倍。动力学参数测定显示，k_cat从0.23 min⁻¹提升至1.95 min⁻¹，而K_m从560 μM降低至320 μM，表明该进化不仅加快了催化速率，也增强了酶对底物的亲和力。
X射线晶体结构分析揭示了催化效率提升的结构基础。在进化后的AF4突变体中，pAF残基周围的微环境发生了显著重排：一个关键的水分子介导的氢键网络被重组，使得pAF的苯胺基团更精准地定位在催化中心，与底物的α,β-不饱和醛形成了更有效的亚胺键中间体。同时，口袋底部的疏水残基突变（V15L）压缩了活性空腔体积，减少了底物进入后的构象熵损失，进一步贡献了亲和力的提升。
**系统的普适性与可拓展性验证**
为了验证策略的通用性，研究者还将相同的生物合成与正交翻译系统应用于另外一种非天然氨基酸——O-甲基-L-酪氨酸（OMeTyr）。通过替换相应的生物合成酶（使用来自植物的O-甲基转移酶），同样实现了细胞内OMeTyr的原位生产并将其掺入目标蛋白。此外，他们还在另一类蛋白骨架（多药外排泵转录调控因子TtgR）上成功构建了含pAF的人工酶，并用同样的体内进化策略使其催化活性提升了8倍。这些结果有力地证明了该平台技术的普适性，为未来多样化非天然氨基酸人工酶的构建和优化提供了可参考的范式。
表：人工酶LmrR_pAF不同进化阶段的动力学参数对比
| 酶变体 | k_cat (min⁻¹) | K_m (μM) | k_cat/K_m (min⁻¹ mM⁻¹) | 相对催化效率 |
|--------|---------------|----------|------------------------|--------------|
| 初始设计 | 0.23 ± 0.02 | 560 ± 35 | 410 | 1.0 |
| AF1 | 0.51 ± 0.04 | 490 ± 28 | 1040 | 2.5 |
| AF2 | 0.89 ± 0.07 | 420 ± 22 | 2120 | 5.2 |
| AF4 | 1.95 ± 0.11 | 320 ± 18 | 6090 | 14.9 |
讨论与展望
这项工作最重要的贡献在于首次实现了从中心代谢途径直接生物合成非天然氨基酸并用于人工酶的体内进化的完整闭环。这一策略的建立使得含非天然氨基酸的蛋白质可以像天然蛋白质一样，在无外源添加的条件下进行高效生产和定向优化，极大地降低了技术门槛和成本。
从酶工程的角度看，将催化活性直接与宿主生长偶联的进化策略具有深远意义。它使得那些原本需要通过复杂筛选才能获得的非天然氨基酸依赖型催化剂，能够通过简单的连续培养实现自动富集，为构建具有全新催化机制的酶开辟了高效的进化路径。
然而，这一体系也存在一些亟待改进之处。目前的胞内pAF浓度虽然已满足蛋白质合成，但在高拷贝数蛋白质表达时仍可能成为限制因素，未来可通过优化前体供给和途径酶的表达强度进一步提升产量。此外，选择性压力偶联策略对特定类型化学反应的通用性尚待验证，对于不能直接产生生长有益产物的反应，可能需要设计更复杂的遗传回路。
展望未来，随着代谢工程与合成生物学的进一步融合，我们可以预见到一整套非天然氨基酸“胞内生物合成库”的建立，并搭配模块化的正交翻译系统，实现任意目标蛋白中多种非天然氨基酸的按需嵌入。这将真正释放人工酶的潜力，让科学家能够像搭建乐高积木一样，通过组合不同的非天然氨基酸模块，创造出自然界中从未存在过的生物催化剂，在医药、绿色化工、生物材料等领域发挥变革性作用。
参考来源
1. Wei Huang, Shiping Wang, Ya Wei, Yuting Bai, Zhixi Zhu. Design and evolution of artificial enzyme with in-situ biosynthesized non-canonical amino acid. *Nature Communications*, 2025, DOI: 10.1038/s41467-025-63733-3.
DOI: 10.1038/s41467-025-63733-3