来源：Synth Biol (Oxf) | 编译：DNA Lab Space
导读
细胞-free生物传感系统为便携式诊断提供了极具潜力的平台。本研究以辣根过氧化物酶（HRP）为氧化还原酶报告蛋白，在大肠杆菌细胞-free转录-翻译系统中成功合成该酶，并通过计时电流法实现电化学检测。研究显示，细胞-free表达的HRP产生强稳态电流，其米氏常数与天然酶接近。将HRP置于四环素响应调控启动子控制下，加入脱水四环素后电流提升2.5倍，证明HRP可作为细胞-free生物传感器的电化学报告蛋白，为手持式分析设备提供了光学报告蛋白之外的互补选择。
研究背景
生物传感器将生物识别元件与物理化学换能器耦合，具有高选择性、高灵敏度、低成本、快速读出等优势，在环境监测和即时诊断等领域应用广泛。合成生物学的进展推动了传感器设计新策略。其中，由细胞裂解液或重建转录-翻译（TX-TL）机制组成的细胞-free蛋白合成（CFPS）系统，可在体外实现基因表达，不受细胞活力和调控约束。细胞-free生物传感器包含三个功能模块：识别分析物的检测模块、转导识别事件的加工模块、以及产生可测量信号的输出模块。本研究将HRP作为报告蛋白，把细胞-free TX-TL生物传感器与电化学输出相结合，以拓展此类系统在实际应用中的潜力。
研究方法
DNA制备
野生型（WT）HRP、H170A突变体、T7tetOHRP和T7tetOmCherry的合成基因片段由Integrated DNA Technologies合成（序列见补充序列信息S1），并使用Gibson Assembly® Master Mix [New England Biolabs (NEB)]按照制造商说明组装到T7p14表达载体中。所得质粒构建体经Sanger测序（Genewiz）验证序列正确。随后使用ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit（Zymo Research）制备质粒DNA，并使用Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase（NEB）按照制造商说明，用结合插入片段上游和下游250个碱基对的引物（补充表S1）PCR扩增线性DNA。所有DNA样品在使用前进一步用DNA Clean & Concentrator-5 Kit（Zymo Research）纯化，去除残留盐和酶污染物。
粗提物制备
本程序完整遵循文献[30]中详述的方案。简言之，大肠杆菌BL21细胞提取物采用mini-midi-maxi策略制备——将细胞在递增规模（5 ml、50 ml、400 ml）的培养物中于37°C生长至OD600为1.8，然后离心收集、洗涤，并在−80°C冷冻。次日，将细胞沉淀解冻、重悬，并用溶菌酶（89833, Thermo Scientific）以1 mg/ml终浓度在冰上裂解90 min。5 ml细胞悬液在冰水浴中使用6 mm预冷超声探头（12931181, Fisher scientific）以70%振幅、10 s开/10 s关、1500 J条件进行超声处理。裂解液经12 000 × g离心澄清，然后在37°C进行80 min的run-off反应，再经两轮30 000 × g离心。澄清提取物用10 kDa MWCO透析盒（66380, Thermo Scientific）在4°C下对S30B缓冲液（14 mM谷氨酸镁、150 mM谷氨酸钾，用Tris调至pH 8.2）透析过夜。使用Bradford法测定最终蛋白浓度，样品以35 mg/ml分装为50 μl等分试样快速冷冻，于−80°C保存备用。
细胞-free TX-TL表达
所有TX-TL反应的主混合物在1.5 ml微量离心管中制备。添加剂组分在加入管中前于冰上解冻。10 μl体积的细胞-free TX-TL反应组装时加入10 nM质粒或线性DNA，并补充适当浓度的添加剂，包括核苷三磷酸、氨基酸、转移RNA、盐和拥挤剂（补充表S2）。基于3-磷酸甘油酸的能量溶液（补充表S3）和氨基酸溶液（补充表S4）按先前描述的方法制备和使用[31]。对于HRP表达，反应混合物补充15 μM血红素、0.5 mM乙酸钙、2 mM谷氨酸镁，以及商业二硫键增强试剂盒（PURExpress® Disulfide Bond Enhancer, NEB），以促进HRP酶的正确折叠和催化活性。反应在PCR管中于20°C孵育8 h，使用热循环仪（ProFlex PCR System）。对于mCherry，谷氨酸镁加至终浓度8 mM，反应在384孔板中于29°C孵育12 h，使用酶标仪（Biotek Synergy H1）。含tet调控启动子模板的反应补充100 nM重组TetR蛋白（HY-P71520, MedChem）和/或1 μM脱水四环素盐酸盐（94 664, Merck）。
HRP活性的光学检测
表达HRP的活性使用基于TMB在H2O2存在下氧化的常规比色法确认。简言之，90 μl商业TMB底物溶液（T4444, Merck）与10 μl稀释的细胞-free反应产物混合，室温孵育10 min，然后用50 μl 1 M H2SO4淬灭。使用FLUOstar Omega酶标仪（BMG Labtech）在450 nm处测量吸光度。数据分析前，从样品读数中减去仅含底物对照的空白吸光度。
HRP活性的电化学检测
电化学测量使用EmStat3 Blue或Palmsens4恒电位仪（PalmSens BV）配合商业丝网印刷电极（DRP-C223BT-U75, DropSens）进行，该电极由1.6 mm直径金工作电极、银参比电极和金对电极组成。所有电位均相对于Ag伪参比电极报告。在进行任何进一步读数前，使用0.1 M H2SO4进行电极表面电化学清洁，CV扫描速率为0.1 V/s，步进电位0.002 V，范围0.0–1.6 V。随后，对40 μl目标样品进行CV，扫描速率0.1 V/s，步进电位0.005 V，范围−0.2至+0.1 V。TMB底物（T4444或T3405, Merck）补充10 mM KCl，这些初始实验使用天然HRP（P8375, Merck）。CA在0.0 V施加电位下进行60 s，采样间隔0.1 s，评估稳态电流（50至60 s的平均电流读数）。
细胞-free报告蛋白的荧光检测
对于mCherry表达，10 μl反应在黑色384孔板中设置，于29°C在Biotek Synergy H1酶标仪中孵育12 h，每2 min用579 nm激发和616 nm发射、增益设置为50进行读数，伴有轨道振荡。
统计分析
数据使用GraphPad Prism 11.0.1版分析。误差线代表平均值的标准误（SEM）。统计显著性使用非配对双尾T检验（两组比较）或方差分析后Bonferroni事后检验（三组及以上比较）评估。非线性回归分析使用Michaelis-Menten模型（酶动力学）和Gompertz模型（HRP和mCherry的TX-TL动力学）。
研究结果
HRP的安培检测
我们首先建立了基于HRP介导产生氧化态TMB（TMBox）的电化学检测方案，TMBox随后在电极上被还原。这些初始实验使用纯化的天然HRP验证方案，然后应用于细胞-free系统表达的HRP。对含H2O2和TMB的底物溶液进行循环伏安法表征。阳极扫描限制在+0.1 V以避免TMB在电极上的直接电化学氧化。仅底物显示可忽略的法拉第还原电流，与不存在TMBox一致（图2a）。相比之下，底物与HRP（5 mUnits/ml）孵育2 min后产生显著的还原电流，在约+0.06 V处有阴极峰，对应于酶促氧化TMB的还原（图2a）。信号与背景的最大分离出现在0.0 V，因此选择该电位进行CA定量HRP活性。CA测量显示初始瞬态电流，随后发展为稳态还原电流。仅底物对照的稳态电流为−8.3 ± 1.1 nA，而HRP（5 mUnits/ml）的存在将电流增加至−302.6 ± 25.9 nA，确认CA信号反映HRP活性（图2b）。
随后，为确定测定的灵敏度和检测限（LoD），在不同HRP浓度下测量稳态CA电流。如图2c所示，HRP浓度与稳态电流之间观察到清晰的线性关系，可实现定量传感。对HRP的灵敏度为−40.17 ± 2.43 nA/（mUnit/ml），偏移为−0.04 ± 0.01 μA。LoD（空白信号标准偏差的三倍除以灵敏度）为0.14 mUnits/ml。
HRP的细胞-free表达与电化学检测
HRP在细胞-free TX-TL系统中的表达首先通过改变孵育温度（补充图S1）、血红素、钙和镁的浓度（补充图S2）进行优化，并筛选商业二硫键增强剂的效果（补充图S3）。HRP的细胞-free表达和功能验证最初使用H2O2和TMB作为显色底物的光学测定评估。在HRP存在下，TMB转化为有色产物，用酸淬灭后在450 nm处有吸光度。WT HRP表达反应中观察到吸光度显著增加，而无DNA模板对照（NTC）或催化失活突变体（H170A）[32]检测到可忽略的信号（图3a）。HRP在450 nm处的吸光度读数（3.014 ± 0.074）显著大于NTC（0.064 ± 0.001）或H170A（0.066 ± 0.002）。使用光学方法确认HRP表达后，我们接下来评估了细胞-free表达HRP的电化学检测。WT HRP样品的稳态还原电流（−52.56 ± 1.58 nA）显著大于NTC（−0.73 ± 0.13 nA）和H170突变体（−0.55 ± 0.06 nA），确认观察到的信号源自HRP的酶活性（图3b）。在光学和电化学方法中，NTC与H170A之间均未观察到显著差异，表明信号对功能性过氧化物酶具有特异性，并非来自细胞-free提取物的背景活性，且H170A变体缺乏可测量的酶活性。SDS-PAGE显示H170和WT HRP均成功翻译（补充图S4）。此外，电化学结果与光学测定获得的结果一致，证明电化学平台在检测细胞-free表达HRP方面的可靠性。
先前研究表明，酶促报告蛋白在细胞-free系统中比荧光蛋白报告蛋白成熟更快[18]。为探索这一点，我们测量了HRP和荧光蛋白mCherry的表达动力学。对于HRP测量，在孵育期间按定义的时间间隔取出单个细胞-free反应管，快速冷冻，然后解冻并一起通过CA分析。单独的mCherry表达反应在酶标仪中孵育，随时间记录同一孔中的荧光。报告蛋白输出使用非对称S形生长模型（Gompertz）拟合，该模型同时捕获初始延迟期和最终饱和。达到最大信号一半的时间估计HRP为20 min，而mCherry为184 min（图3c和d）。这一结果与先前关于酶促报告蛋白比荧光蛋白提供更快读出的报道一致，有利于生物传感应用中快速信号生成。
最后，为评估细胞-free表达HRP的功能质量，我们使用天然HRP和细胞-free表达HRP进行了Michaelis-Menten动力学分析（图3e）。在固定TMB浓度下，记录不同H2O2浓度下的稳态电流。对于天然HRP，所得曲线显示特征性饱和行为，表观Km为0.91 ± 0.96 mM。细胞-free表达HRP显示相当的动力学特征，Km为1.37 ± 0.48 mM（图3f）。
HRP作为报告蛋白的电化学检测
最后，作为HRP可从细胞-free生物传感器系统发挥报告蛋白功能的概念验证，将其表达置于调控启动子控制下。选择常用的四环素诱导系统，验证基因表达的调控是否能可靠地转导为可测量的电化学信号[11, 33, 34]。tet操纵子（tetO）序列置于驱动HRP表达的T7启动子下游。识别并结合tetO位点的重组TetR蛋白加入细胞-free反应中，抑制基础HRP转录。诱导物aTc与TetR结合后将其从tetO位点释放，从而允许HRP表达（图4a）。在加入TetR的HRP表达反应中，稳态CA电流从−31.68 ± 1.32 nA（无TetR的ON状态）降至−8.74 ± 0.57 nA（OFF状态），表明TetR对HRP表达的抑制。加入1 μM aTc后，电流恢复至−21.86 ± 1.58 nA，与无TetR对照相比增加了2.5倍。比色TMB氧化照片与电化学结果一致（图4b）。
讨论与解读
本研究的目标是将细胞-free TX-TL生物传感器系统与使用HRP作为报告蛋白的电化学输出相结合，以提升此类系统在实际应用中的可用性。本研究中HRP在CFPS系统中成功表达，与Zhu等人和Park等人此前的工作一致[28, 29]。本研究观察到相似的最优表达条件——20°C温度、15 μM血红素，而Ca2+最优浓度在与Mg2+共同优化时较低，为0.5 mM。重要的是，细胞-free表达HRP的Km（1.37 ± 0.48 mM）与天然HRP（0.91 ± 0.96 mM）相似，且与文献报道值0.7 ± 0.2 mM一致[35]。这些数值的接近确认了细胞-free产物具有催化活性，并保持与纯化酶相似的底物亲和力。尽管在大肠杆菌细胞-free系统中表达的HRP缺乏天然糖基化——糖基化支持折叠、溶解性和稳定性[36]——它仍保持相似的动力学行为。这些发现推进了HRP作为细胞-free生物传感应用报告酶的应用价值。CFPS平台相比传统生物传感方法具有多种优势，但也存在局限性。细胞-free反应在实验室外条件下的稳定性仍有待解决。
编译者解读
本研究巧妙地将HRP这一成熟酶学工具引入细胞-free生物传感器读出体系，以电化学信号替代传统光学读出，显著降低了设备对光学元件的依赖。方法选择上，作者系统优化了血红素、钙离子、镁离子及二硫键增强剂等关键因子，使HRP在大肠杆菌裂解液中正确折叠并保持催化活性，Km与天然酶接近，体现了细胞-free系统表达复杂酶蛋白的可行性。以四环素调控系统验证2.5倍电流增强的概念演示，为未来集成手持式电化学检测设备奠定了基础。局限在于当前仍处于概念验证阶段，实际样本中的灵敏度与干扰控制有待进一步探索。
PMID: 42577899