来源：J Biol Eng | 编译：DNA Lab Space
乳酸菌的细胞壁厚、转化效率低，还自带一套“防御系统”来抵制外源DNA入侵。这些特性让它的基因编辑长期停留在“能做但不好做”的尴尬境地。近日，一篇发表于《Journal of Biological Engineering》的研究，通过系统优化电转化条件和编辑流程，在植物乳杆菌8P-A3中成功实现了对细菌素群体感应负调控基因plnD的靶向敲除，编辑后的菌株抗菌活性明显增强。
研究背景
植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）是食品发酵和益生菌领域的重要工业菌株，其分泌的植物乳杆菌素（plantaricin）是一类具有广谱抑菌活性的核糖体合成肽。这类细菌素的合成并非“始终在线”，而是受控于一套精细的群体感应（quorum-sensing）调控网络。在该网络中，plnD基因编码的组氨酸蛋白激酶扮演着“刹车”角色——它感知外界信号后，会抑制下游细菌素合成基因的表达。
理论上，敲除plnD就能解除这种抑制，让细菌素合成通路“全速运转”。然而，理想很丰满，现实很骨感。乳酸菌厚厚的肽聚糖细胞壁让外源DNA难以进入；菌株特异的限制性修饰系统会主动降解外来质粒；而Cas9蛋白一旦在细胞内表达，其引发的双链断裂对许多乳酸菌来说往往是致命的。这些障碍叠加在一起，使得CRISPR/Cas9系统在乳酸菌中的应用远不如在大肠杆菌中那般“顺手”。
本研究选择植物乳杆菌8P-A3作为亲本菌株，目标是对plnD进行内部缺失突变。研究者没有另起炉灶设计全新系统，而是将一套已有的双质粒CRISPR/Cas9体系进行“本地化改造”——通过大量优化转化条件和编辑流程，最终在目标菌株中实现了高效基因编辑。
研究方法
菌株与培养条件
实验所用的植物乳杆菌8P-A3菌株由俄罗斯实验医学研究所的Alexander Suvorov博士于2017年惠赠，最初分离自商品化益生菌制剂Lactobacterinum siccum（Microgen公司，莫斯科）。菌株常规培养使用MRS培养基（pH 5.7，Carl Roth GmbH，德国，货号HP64.1），需要添加抗生素时则在MRS中补加相应抗生素，培养条件为37°C、150 rpm振荡培养12–16小时，全程保持厌氧环境。厌氧条件通过BD GasPak™ EZ产气袋系统（含指示剂，货号260683，BD公司，美国）实现。固体培养基使用MRS琼脂（Carl Roth GmbH，德国，货号HP65.1）。
电转感受态细胞制备
电转化是乳酸菌基因编辑的关键限速步骤。研究者制备了两种溶液用于感受态细胞处理：MRS-G（MRS-甘氨酸）溶液和蔗糖-甘油（SacGly）溶液。其中2.5% MRS-G溶液通过向25 mL MRS肉汤中加入0.625 g甘氨酸配制，然后用0.22 μm滤膜过滤除菌。SacGly溶液的配制方法为：将85.55 g蔗糖溶解于400 mL水中，再加入100 mL 50%甘油。
电击后的细胞复苏使用改良MRS培养基（MMRS），即在MRS肉汤中添加500 mM蔗糖、20 mM MgCl₂和2 mM CaCl₂。电转化操作使用Bio-Rad MicroPulser电转仪（货号1652100）和0.1 cm间隙的电转杯（货号1652093）。
双质粒CRISPR/Cas9系统构建
研究采用双质粒SpCas9系统实现plnD的靶向破坏。其中CR质粒（pCB578）负责表达SpCas9蛋白、tracrRNA以及repeat-spacer-repeat结构单元；RT质粒（pCB591）则携带plnD基因的内部缺失/突变序列，作为同源重组修复的模板。
两个质粒的正确组装通过菌落PCR（cPCR）、限制性酶切和Sanger测序三重验证确认。验证无误后，两个质粒依次导入植物乳杆菌8P-A3菌株，最终获得携带编辑工具的CRM菌株。
基因编辑与质粒消除
在CRISPR/Cas9系统完成靶向切割后，细胞会启动同源重组修复机制，以RT质粒上的缺失序列为模板修复断裂位点，从而将内部缺失引入plnD基因。编辑完成后，研究者通过在无抗生素培养基中连续传代，筛选丢失了红霉素和氯霉素抗性的菌落——抗生素敏感表型意味着两个质粒均已被成功清除。
编辑验证
编辑效果的验证采用多层面策略。首先，使用plnA-plnD位点两侧的引物进行PCR扩增，通过比较CRM菌株与野生型菌株的扩增产物大小判断是否存在内部缺失。其次，进行靶向扩增子测序，从核苷酸水平确认编辑结果。测序数据分别使用Geneious Prime、Benchling和SnapGene三个独立的多平台比对分析软件进行高严格度比对，交叉验证编辑连接位点。
![Quorum sensing–regulated plantaricin system in L. plantarum 8P-A3 strain (Figure adapted and modified from Goel, A. et al., 2023 [ 23 ] and Tsapieva, A. et al., 2011 [ 24 ]). Schematic representation of the plnABCD regulatory network. Extracellular PlnA activates the histidine kinase PlnB, which pho](/d/file/research/202608/art_90_1786591635_0.webp)
研究结果
双质粒系统成功构建并验证
CR质粒pCB578与RT质粒pCB591的正确组装得到了三重验证——菌落PCR、限制性酶切和Sanger测序结果均与预期一致。这一步骤虽属常规操作，但考虑到乳酸菌中质粒构建的难度，每一步验证都不可或缺。
plnD基因编辑成功实现
将两个质粒依次导入植物乳杆菌8P-A3后，CRISPR/Cas9系统成功在plnD基因中引入了程序化的内部缺失/突变。经过无抗生素培养基中的连续传代，研究者筛选到了同时丧失红霉素和氯霉素抗性的菌落——这些菌落的抗生素敏感性表明两个质粒均已被成功清除，避免了Cas9蛋白持续表达可能带来的潜在毒性。
PCR扩增plnA-plnD全长位点的结果清晰显示，CRM菌株的扩增产物明显短于野生型菌株，这与plnD基因内部缺失的预期一致。
靶向扩增子测序从核苷酸水平提供了最终确认。三个独立的比对分析软件（Geneious Prime、Benchling、SnapGene）均显示一致的HDR介导的缺失连接位点，且在plnD基因区域内存在少量突变碱基。更为关键的是，CRM等位基因完全缺失了完整的20 nt间隔序列识别位点及其相邻的5′-NGG PAM基序。这意味着即便有残留的Cas9蛋白活性，也无法再识别该位点进行切割——编辑事件是不可逆的。
编辑后细菌素合成基因上调
plnD编码的组氨酸蛋白激酶是细菌素群体感应网络中的负调控因子。敲除该基因后，其下游的plnA、plnE和plnF基因表达水平均出现上调。这三个基因分别参与植物乳杆菌素的调控、转运和结构合成，它们的协同上调表明整个细菌素合成通路被激活。
抗菌活性增强
与基因表达上调相对应的是，CRM菌株表现出升高的抗菌活性。虽然原文摘要未提供具体的抑菌圈直径或最小抑菌浓度数值，但抗菌活性的提升与plnA、plnE、plnF的上调形成了逻辑闭环——基因表达的变化最终转化为了功能层面的表型差异。
讨论与展望
这项研究的价值在于提供了一个可复用的方法论框架。双质粒系统将Cas9表达与修复模板分离，避免了单质粒体系可能存在的组装困难；电转化条件的系统优化（甘氨酸处理削弱细胞壁、蔗糖-甘油溶液保护细胞膜、MMRS培养基促进复苏）则针对乳酸菌的“先天顽疾”逐一给出了解决方案。
从调控逻辑来看，靶向plnD这一负调控基因的策略颇为巧妙。传统上，增强细菌素生产往往通过过表达正调控因子或结构基因来实现，而本研究选择拆除“刹车”而非猛踩“油门”——这种思路在代谢工程中并不常见，却可能更符合细胞的能量经济原则。
当然，这项技术仍有值得深挖的空间。质粒消除依赖于无抗生素传代筛选，耗时较长；plnD的完全敲除虽然激活了细菌素合成，但群体感应网络的复杂性意味着可能存在其他补偿机制。未来若能将这一平台扩展至其他乳酸菌菌株，或在此基础上叠加多基因编辑，其应用潜力还将进一步释放。
原文摘要未详述电转化的具体参数（电压、电阻、时间常数）以及抗菌活性的定量测定方法，这些细节的缺失为后续研究留下了验证空间。
参考来源
Anand R, Lütticken R, De Laporte L, Herrmann A, Heine E. An optimized CRISPR/Cas9-based genome editing platform enhances bacteriocin production in Lactiplantibacillus plantarum. J Biol Eng. PMID: 42527938.
PMID: 42527938