来源：Front Plant Sci | 编译：DNA Lab Space
外源褪黑素能显著提升枣树叶片中五环三萜类化合物的积累，而这一过程的核心开关，是转录因子ZjWRKY11和ZjWRKY7直接激活关键合成基因ZjHMGR与ZjOSC1的表达。中国科学院武汉植物园的研究团队通过转录组学、过表达与沉默实验，揭示了褪黑素调控枣树次生代谢的全新路径，相关成果发表在《Frontiers in Plant Science》上。
研究背景
枣树（Ziziphus jujuba Mill.）既是传统干果，也是重要的药用木本植物。其果实和叶片中富含三萜类化合物——包括熊果酸、齐墩果酸、白桦脂酸等五环三萜，这些成分具有抗炎、保肝、抗肿瘤等多种药理活性。然而，枣树三萜的生物合成调控机制长期悬而未决，尤其是上游信号分子如何传递到转录调控层面，一直缺乏系统的分子证据。
褪黑素（melatonin, MT）在植物中不仅扮演昼夜节律调节者的角色，近年的研究还发现它参与胁迫响应和次生代谢调控。但褪黑素是否影响枣树三萜积累、通过何种转录因子发挥作用，此前并无报道。这项研究从外源褪黑素处理入手，沿着"信号—转录因子—靶基因"的链条层层推进，填补了这一空白。
研究方法
材料处理与浓度筛选。 研究以枣树幼苗为材料，设置三个褪黑素浓度梯度——50、100和200 μM，并以未处理植株为对照。处理后的幼叶在多个时间点取样，用于测定总三萜含量变化。每个处理设置三次独立培养，每次培养包含三个生物学重复，数据以平均值±标准误表示。
总三萜含量测定。 采用分光光度法测定叶片总三萜含量，以干燥重量（DW）为基准计算。这一指标用于初步判断褪黑素处理的效果和最佳浓度。
HPLC定量分析单萜组分。 针对100 μM褪黑素处理168小时后的叶片样品，利用高效液相色谱（HPLC）定量检测四种主要五环三萜——科罗索酸（corosolic acid）、白桦脂酸（betulinic acid）、齐墩果酸（oleanolic acid）和熊果酸（ursolic acid）的含量变化。同时测定了褪黑素自身的含量动态，以确认外源褪黑素的吸收与内源积累情况。
转录组测序与差异表达基因鉴定。 对褪黑素处理和对照的枣树叶片进行转录组测序，筛选差异表达基因（DEGs）。通过功能富集分析，确定这些差异基因主要富集于哪些代谢通路——特别是次生代谢相关途径。
转录因子与关键合成基因的关联分析。 将转录组数据与三萜积累数据进行整合分析，锁定与三萜含量显著相关的候选基因。重点考察两类基因：一是三萜生物合成的直接催化酶，如3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（ZjHMGR）和2,3-氧化鲨烯环化酶（ZjOSC1）；二是可能调控这些酶基因表达的WRKY转录因子家族成员。
过表达与沉默功能验证。 对筛选出的ZjWRKY11和ZjWRKY7进行功能验证。过表达实验在植物体内增强这两个转录因子的表达水平，观察三萜积累的变化；沉默实验则相反，通过基因沉默技术降低其表达，检测三萜含量是否随之下降。两套实验互为印证，确认转录因子对三萜合成的正向调控作用。
启动子结合验证。 为阐明分子机制，采用启动子结合实验检测ZjWRKY11和ZjWRKY7能否直接结合到ZjHMCR和ZjOSC1的启动子区域。实验同时比较了两个转录因子的激活能力差异。
原文摘要未详述转录组测序的平台参数、过表达所用载体系统、沉默技术的具体方法（如VIGS或RNAi），以及启动子结合实验的具体技术形式（如酵母单杂交、EMSA或ChIP-qPCR）。这些细节有待查阅全文获取。
研究结果
褪黑素浓度与三萜积累呈倒U型关系。 100 μM褪黑素处理使枣树叶片总三萜含量持续上升，在处理168小时达到峰值——25.9 mg/g DW，约为对照组的2.6倍。50 μM处理虽然也促进了三萜积累，但差异未达到统计学显著水平。200 μM处理则适得其反，三萜含量呈现下降趋势，表明高浓度褪黑素对三萜生物合成具有抑制作用。这一浓度依赖效应提示，褪黑素的作用并非线性增强，而是存在最优窗口。
四种五环三萜组分同步显著上升。 HPLC定量结果显示，100 μM褪黑素处理168小时后，四种主要五环三萜含量均显著升高。白桦脂酸、科罗索酸和熊果酸的增幅分别约为2.3倍、2.5倍和2.6倍——注意，这里引用的是原文的近似倍数，精确数值需查阅全文图表。齐墩果酸同样显著增加，但摘要中未给出具体倍数。值得注意的是，褪黑素含量在三萜积累之前先达到峰值，这一时间先后关系暗示褪黑素作为上游信号触发了后续的代谢响应。
转录组揭示次生代谢通路富集。 差异表达基因的功能富集分析显示，褪黑素处理显著影响了次生代谢相关通路。整合转录组与代谢数据后，研究锁定了两个关键合成基因——ZjHMGR和ZjOSC1，以及两个与三萜积累显著相关的WRKY转录因子——ZjWRKY11和ZjWRKY7。这四个基因的表达变化与三萜含量呈现高度相关性，构成了一条潜在的调控轴。
过表达与沉默实验确认正向调控。 在植物体内过表达ZjWRKY11或ZjWRKY7后，三萜积累显著增加；相反，沉默这两个转录因子导致三萜含量明显下降。功能实验从正反两个方向证实，ZjWRKY11和ZjWRKY7是三萜生物合成的正向调控因子。原文摘要未提供过表达和沉默实验中三萜含量的具体数值，仅给出了"显著增强"和"显著降低"的定性结论。
分子机制：直接结合启动子并激活靶基因。 启动子结合实验证明，ZjWRKY11和ZjWRKY7均能直接结合ZjHMCR和ZjOSC1的启动子区域，从而激活这两个关键酶基因的转录。进一步比较发现，ZjWRKY11的激活能力明显强于ZjWRKY7。这一结果将转录因子与合成酶基因之间的调控关系从相关性推进到了因果性。
讨论与展望
这项研究的核心贡献在于打通了一条完整的调控链：外源褪黑素→诱导ZjWRKY11/ZjWRKY7表达→两个转录因子直接结合ZjHMCR和ZjOSC1启动子→激活三萜合成→五环三萜积累增加。链条中的每一个环节都有实验支撑，而非仅仅基于转录组的相关性推测。
两个转录因子的功能分化值得关注。ZjWRKY11的激活能力强于ZjWRKY7，这可能意味着两者在调控网络中扮演不同角色——一个偏重快速响应，一个偏重精细调节。后续研究若能解析它们与启动子结合位点的差异，或许能更清晰地描绘这一调控模块的运作逻辑。
从应用角度看，ZjWRKY11和ZjWRKY7为枣树三萜的代谢工程提供了明确的靶点。枣树生长周期长，传统育种改良三萜含量耗时费力。若能利用这两个转录因子进行定向调控，或将为高附加值三萜成分的绿色生产开辟新途径。当然，从实验室验证到生产应用之间还有相当距离——过表达是否影响其他代谢通路、田间条件下的稳定性如何，都是需要回答的问题。
参考来源
Wen C, Wang Z, Liu Y, Wang Y, Wang C. Melatonin-induced ZjWRKY11 and ZjWRKY7 regulate triterpenoid biosynthesis in jujube (Ziziphus jujuba Mill.). Frontiers in Plant Science. PMID: 42582415.
PMID: 42582415