来源：Appl Microbiol Biotechnol | 编译：DNA Lab Space
导读
木质纤维素生物质是储量最丰富的可再生资源，但其生物转化常需面对低pH、高温及发酵抑制物等多重胁迫环境。本研究以具有卓越多胁迫耐受性的非常规酵母东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）为宿主，发现酿酒酵母来源的展示组件在其体内失效后，基于内源 IoSED1 基因构建了全新的细胞表面展示盒，成功实现了增强型绿色荧光蛋白（eGFP）和β-葡萄糖苷酶（BGL）的表面固定化。BGL展示菌株能在以纤维二糖为唯一碳源的培养基中稳健生长，且在高浓度抑制物存在下仍保持代谢活性。这是首例在 I. orientalis 细胞表面固定功能蛋白并实现胁迫条件下木质纤维素衍生中间体同化的报道。
研究背景
气候变化加剧与石油资源枯竭推动了对非化石基可持续生产系统的迫切需求。木质纤维素生物质（LCB）——包括稻草、玉米秸秆、木片、甘蔗渣等农业残余物——因储量丰富且不与粮食作物竞争，成为最具潜力的替代原料。LCB主要由纤维素（占总量40–50%）、半纤维素（20–40%）和木质素构成，经化学与酶处理可水解释放出葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖等可发酵单糖，再经代谢工程微生物转化为生物基化学品与燃料。
酵母因抗噬菌体感染、遗传操作简便、异源蛋白表达能力强等优势，是LCB生物转化的理想宿主。然而，多数模式酵母（如酿酒酵母）缺乏天然水解纤维素和半纤维素的能力。通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定结构域将纤维素酶展示于酵母细胞表面，可将酶生产、糖化和发酵整合为单一步骤。但LCB的酸性热处理预处理会营造低pH、高温和含发酵抑制物的严苛培养条件，因此展示纤维素酶的宿主菌株必须对这些胁迫具备显著耐受性。本研究选用具有突出多胁迫耐受性的非常规酵母 I. orientalis，试图在其体内建立细胞表面展示系统。
研究方法
菌株与培养基
大肠杆菌NovaBlue菌株（Novagen，美国威斯康星州）作为重组DNA操作宿主。大肠杆菌转化子在Luria-Bertani培养基（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠5 g/L）中培养，添加100 µg/mL氨苄青霉素，温度37 °C。本研究所用 I. orientalis 野生型菌株共11株，均购自日本NITE生物资源中心（NBRC，东京）；酿酒酵母野生型菌株为BY4741（Life Technologies，美国加利福尼亚州）。所用酵母菌株及转化子的遗传特性汇总于补充表S1。酵母培养基为YPD（酵母提取物10 g/L、Bacto-蛋白胨20 g/L [Difco Laboratories，美国密歇根州]、葡萄糖20 g/L）、SC-URA缺陷培养基（不含氨基酸的酵母氮碱6.7 g/L [Difco Laboratories]、不含尿嘧啶的酵母合成缺陷培养基补充物1.92 g/L [Sigma-Aldrich，美国密苏里州]、葡萄糖20 g/L）或SD培养基（不含氨基酸的酵母氮碱6.7 g/L [Difco Laboratories]、葡萄糖20 g/L）。
I. orientalis NBRC1664的胁迫耐受性分析
为分析低pH和高温耐受性，将 I. orientalis 和酿酒酵母细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm预培养48 h，然后以初始OD600为0.05接种至5 mL SC培养基。SC培养基初始pH分别用1 M HCl调至2、用0.5 M KOH调至6。培养在L形管中进行，使用Bio-photorecorder TVS062CA（ADVANTEC，东京）于30 °C或45 °C、40 rpm振荡培养72 h。为评估对木质纤维素发酵抑制物（糠醛、5-HMF和香兰素）的耐受性，细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm预培养24 h。用Milli-Q水制备系列稀释液（OD600分别为1、0.1、0.01或0.001），各取3 µL点样于补充了尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、蛋氨酸及一种抑制物（糠醛21 mM；5-HMF 28 mM；香兰素10 mM）的SD琼脂平板上。平板于30 °C培养96–120 h，使用凝胶成像系统FAS-X（Nippon Genetics，东京）记录菌落生长。
I. orientalis NBRC1664尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建
使用Kaneka Easy DNA Extraction Kit version 2（Kaneka，大阪）提取 I. orientalis NBRC1664基因组DNA。 I. orientalis URA3（IoURA3）开放阅读框（ORF）的上游（543 bp）和下游（279 bp）同源臂分别用引物对URA3-UP-F/URA3-UP-R和URA3-DOWN-F/URA3-DOWN-R通过聚合酶链式反应（PCR）扩增（Xiao等，2014）。两片段通过重叠延伸PCR融合，所得DNA片段导入NBRC1664。转化子在补充1 mg/mL 5-氟乳清酸（5-FOA）的SC琼脂平板上筛选。IoURA3 ORF的缺失通过菌落PCR（引物Colony-P-F和Colony-P-R）确认。为验证尿嘧啶营养缺陷，转化子划线于含或不含尿嘧啶（76 µg/mL）的SD琼脂平板，30 °C培养。
细胞表面展示盒的构建
所有质粒使用In-Fusion试剂盒（TaKaRa Bio，滋贺）按制造商说明书构建。所用质粒和引物分别汇总于补充表S2和S3。
IoURA3基因DNA片段以 I. orientalis NBRC1664基因组DNA为模板，用引物URA3-F和Colony-P-R经PCR扩增，导入酵母着丝粒穿梭载体pRS415的HindIII位点，得到pVT。包含eGFP细胞表面展示基因表达盒的质粒pleGFP-SSS（Inokuma等，2020）用引物ScSED1p-F和ScSAG1t-R经PCR扩增，导入pVT的SacI位点，得到pVT-SceGFP。
IoSED1 编码区（去除其分泌信号，补充表S4）以 I. orientalis NBRC1664基因组DNA为模板，用引物IoSED1a-F1和IoSED1a-R1经PCR扩增。该片段与以plBG-SSS（Inokuma等，2016）为模板、用引物Vector-F和Vector-R经PCR扩增的DNA片段融合，所得质粒命名为plBG-SSIoS，其中plBG-SSS的锚定结构域被替换为IoSED1锚定结构域。用于以IoSED1启动子、分泌信号和锚定结构域展示eGFP的质粒构建如下：含IoSED1启动子和分泌信号的DNA片段以 I. orientalis NBRC10737基因组DNA为模板，用引物IoSED1ps-F1和IoSED1ps-R1经PCR扩增；eGFP编码区DNA片段以pleGFP-SSS为模板，用引物eGFP-F和eGFP-R经PCR扩增；编码IoSED1锚定结构域的DNA片段以plBG-SSIoS为模板，用引物IoSED1a-F2和IoSED1a-R2经PCR扩增。三个片段导入pVT的SacI位点，生成质粒pVT-IoeGFP。
用于将基因导入 I. orientalis NBRC1664染色体2先前鉴定的基因间位点IS2（Lee等，2022）的整合型质粒构建如下：IS2上游和下游约1 kbp DNA片段分别以 I. orientalis NBRC1664基因组DNA为模板，用引物对IS2-UP-F/IS2-UP-R和IS2-DOWN-F/IS2-DOWN-R扩增。在IS2-UP-R的重叠区插入PacI识别位点。两个DNA片段通过重叠延伸PCR融合，获得中心含一个PacI位点的DNA片段。该片段导入pVT的PpuMI位点，所得质粒命名为pVT-IS。pVT-IoeGFP中展示eGFP的基因表达盒用引物IoSED1p-F和ScSAG1t-R经PCR扩增，导入pVT-IS的SacI位点，所得质粒命名为pVT-IS-IoeGFP。
用于展示 Aspergillus aculeatus BGL1的整合型质粒构建如下：IoSED1启动子与分泌信号、IoSED1锚定结构域的DNA片段分别以pVT-IoeGFP为模板，用引物对IoSED1ps-F1/IoSED1ps-R2和IoSED1a-F2/IoSED1a-R2扩增。编码 A. aculeatus BGL1的DNA片段以plBG-SSS为模板，用引物BGL-F和BGL-R经PCR扩增。三个片段导入pVT-IS的SacI位点，所得质粒命名为pVT-IS-BGL。
细胞表面展示菌株的构建
为构建展示eGFP的 I. orientalis 菌株，将携带eGFP展示盒的附加型质粒pVT-SceGFP或pVT-IoeGFP导入NBRC1664/ura3Δ菌株，分别得到16-ScGFP-p和16-IoGFP-p菌株。空载体pVT同样导入NBRC1664/ura3Δ菌株，得到16-pVT菌株。对于eGFP展示盒的基因组整合，整合型质粒pVT-IS-IoeGFP用PacI线性化后整合至NBRC1664/ura3Δ菌株的IS2位点，得到16-IoGFP-int菌株。类似地，为构建展示BGL的 I. orientalis 菌株，整合型质粒pVT-IS-IoBGL用PacI线性化后整合至NBRC1664/ura3Δ菌株的IS2位点，得到16-IoBG-int菌株。
所有 I. orientalis 菌株均采用醋酸锂法转化，方法参照Xiao等（2014）并略作修改。酵母细胞在3 mL YPD培养基中于30 °C、200 rpm过夜培养，取等分试样接种至3 mL新鲜YPD培养基中继续培养（后续步骤原文未详述）。
研究结果
I. orientalis NBRC1664的多胁迫耐受性评估
为比较 I. orientalis 与模式酵母酿酒酵母的多胁迫耐受性，我们评估了 I. orientalis NBRC1664（从NBRC获得的11株 I. orientalis 菌株中耐受性最强的一株，图S1）和酿酒酵母BY4741在低pH、高温及木质纤维素发酵抑制物条件下的胁迫耐受性。如图1a所示，两种菌在pH 6时均生长良好，但 I. orientalis 的生长优于酿酒酵母。 I. orientalis 在pH 2时表现出稳健生长，72 h后的OD600与pH 6时几乎相同，而酿酒酵母在pH 2时无法生长。类似地，在45 °C时 I. orientalis 成功生长而酿酒酵母不能；两种菌在正常温度30 °C下均生长良好（图1b）。此外，为评估在发酵抑制物（21 mM糠醛、28 mM 5-HMF和10 mM香兰素）存在下的生长情况，进行了点板实验（图1c）。本研究所用各抑制物浓度处于木质纤维素水解液中观察到的浓度范围内（Mills等，2009）。在补充了适当营养物的SD培养基上、非胁迫条件下，两种菌均形成明显菌落。当暴露于发酵抑制物时， I. orientalis 在全部三种抑制物条件下均成功形成清晰菌落，而酿酒酵母在任何抑制物条件下均无法生长。这些结果与Akita和Matsushika（2024）的报道一致。综上， I. orientalis NBRC1664具有卓越的多胁迫耐受性。
展示eGFP的 I. orientalis 菌株评估
为确定与GPI锚定结构域融合的蛋白质能否固定在 I. orientalis 细胞表面，我们构建了eGFP展示基因表达盒，并通过荧光显微镜检查eGFP信号的定位。首先尝试表达此前已显示可在酿酒酵母细胞表面展示eGFP的基因表达盒（Inokuma等，2020），该表达盒由酿酒酵母SED1（ScSED1）启动子、分泌信号和锚定结构域以及酿酒酵母SAG1终止子组成（图2a）。携带该表达盒的附加型质粒（pVT-SceGFP）导入 I. orientalis NBRC1664/ura3Δ菌株（尿嘧啶营养缺陷型菌株，其尿嘧啶缺陷已通过生长分析确认，图S2），按"材料与方法"所述进行荧光显微镜观察。然而，未检测到eGFP信号（图2b）。
接下来我们假设，荧光的缺失源于异源遗传元件在该 I. orientalis 菌株中功能不佳。细胞表面展示盒的启动子、分泌信号和锚定结构域对展示效率有决定性影响（Inokuma等，2014，2016；Zhang等，2013）。因此，我们构建了一个修饰型展示盒，将上述每个元件替换为 IoSED1 基因的对应元件（图2a）。 IoSED1 与ScSED1基因同源（Kitagawa等，2010），且根据big-PI Fungal Predictor等预测工具（Eisenhaber等，2004），其编码蛋白被预测为GPI锚定蛋白。此外， IoSED1 来源的信号序列已被报道可介导目标蛋白的胞外分泌（Kitagawa等，2010）。将这一新构建的展示盒导入NBRC1664/ura3Δ后，荧光显微镜观察显示清晰的表面定位荧光（图2b）。荧光模式与eGFP展示的酿酒酵母菌株（Inokuma等，2020）中观察到的相当，表明eGFP成功展示在 I. orientalis 细胞表面。
尽管检测到表面定位的eGFP信号，但仅有限数量的细胞观察到荧光。为提高展示eGFP的细胞比例，我们将展示盒整合至基因组。按"材料与方法"所述构建了设计用于将表达盒插入 I. orientalis NBRC1664 IS2位点（Lee等，2022）的整合型质粒，并将eGFP展示盒整合至NBRC1664/ura3Δ菌株。与携带质粒的菌株（16-IoGFP-p）相比，基因组整合菌株（16-IoGFP-int）的荧光显微镜观察显示，表现出清晰表面定位信号的细胞比例显著增大（图2b），这与流式细胞术结果一致（图S3）。综上，这些结果表明我们成功构建了能够在 I. orientalis 细胞表面展示目标蛋白的基因表达盒。
展示β-葡萄糖苷酶的 I. orientalis 菌株评估
接下来，利用所构建的蛋白质细胞表面展示基因表达盒，我们构建了展示 A. aculeatus BGL1（可将纤维二糖水解为葡萄糖，Murao等，1988）的 I. orientalis 菌株，命名为16-IoBG-int（图3a）。该菌株在YPD培养基中于30 °C培养72 h，随后在30 °C下分别评估细胞组分和培养上清中的BGL活性。16-IoBG-int及其亲本菌株的培养上清中均未检测到BGL活性。相反，16-IoBG-int的细胞组分表现出显著更高的BGL活性（4.35 ± 0.5 mU/OD600），而亲本菌株的细胞组分几乎检测不到活性（图3b）。这表明BGL已成功展示在 I. orientalis 细胞表面。
此外，为评估所展示的 A. aculeatus BGL1在LCB生物转化预期高温条件下的活性（Yanase等，2010），将在30 °C培养72 h的细胞于45 °C下进行相同的BGL活性测定。在45 °C下测定时，BGL活性显著升高至30 °C测定值的3倍以上（16.1 ± 1.6 mU/OD600）（图3c）。该结果与 A. aculeatus BGL1的最适温度位于50 °C以上高温范围的事实一致（Murao等，1988）。
胁迫条件下以纤维二糖为唯一碳源的发酵
为评估所构建的BGL展示菌株是否能以纤维二糖为唯一碳源生长（后续结果原文未完整呈现）。
讨论与解读
本研究开发了适用于多胁迫耐受酵母 I. orientalis 的细胞表面展示盒。利用该展示盒，成功构建了在细胞表面展示 A. aculeatus BGL1的菌株，该菌株能以纤维二糖为唯一碳源稳健生长。更重要的是，该菌株在LCB生物转化相关的多种胁迫条件下仍能同化纤维二糖，表明携带纤维素酶的 I. orientalis 菌株非常适合高效的LCB生物转化。
我们采用 IoSED1 基因来源的启动子、分泌信号和锚定结构域构建了新型基因表达盒，并成功展示了eGFP（图2b）。研究发现，与附加型质粒表达系统相比，基因组整合显著提高了细胞表面呈现eGFP荧光的细胞比例，表明质粒表达在 I. orientalis NBRC1664中本质上不稳定。这一解释得到先前报道的支持——携带相同酿酒酵母来源着丝粒和自主复制序列的附加型质粒在另一株 I. orientalis 菌株中也表现出不稳定性（Tran等，2019；Cao等，2020）。另一方面，即使在基因组整合菌株中，仍观察到一小部分无荧光细胞（图2b和图S3）。值得注意的是，如图2b所示，较小尺寸的细胞几乎不显示荧光（后续内容原文未完整呈现）。
编译者解读
本研究的关键价值在于揭示了异源展示元件在非模式酵母中的"水土不服"问题，并以内源 IoSED1 元件替代解决了这一障碍——这种"入乡随俗"的策略对在非传统酵母中开发细胞表面展示技术具有普适参考意义。从合成生物学应用角度看，将纤维素酶展示与宿主固有胁迫耐受性相结合，为"整合生物加工"（CBP）提供了更贴近工业实际的底盘方案。然而，本研究仍处于概念验证阶段：展示的仅为单一BGL，而完整的纤维素水解需要内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶与BGL的协同作用；纤维二糖同化实验虽在抑制物存在下成功，但实际LCB水解液成分更为复杂。未来若能将多种纤维素酶共展示于同一细胞表面，并验证其在真实水解液中的长期操作稳定性，该平台有望成为木质纤维素可持续生物转化的重要工业底盘。
参考来源
Kawahara Y, Nasuno R, Jin YS, Hasunuma T. Engineering a robust cell-surface display platform in the multi-stress-tolerant yeast Issatchenkia orientalis. Appl Microbiol Biotechnol. PMID: 42154235.
PMID: 42154235