来源：Front Plant Sci | 编译：DNA Lab Space
导语
西洋参（*Panax quinquefolius* L.）是贵重中药材，其活性成分人参皂苷的生物合成受植物激素精细调控。油菜素内酯作为一种促生长类固醇激素，在提高作物产量与品质方面潜力显著，然而其对西洋参根中皂苷积累的系统性影响及分子机制尚不明晰。本研究首次通过代谢组学与转录组学联合分析，揭示了叶面喷施油菜素内酯重塑西洋参根中人参皂苷谱的全局图景，锁定了关键差异代谢物和核心调控基因，为利用植物生长调节剂定向提升药用植物活性成分提供了全新思路和理论依据。
研究背景
人参皂苷是西洋参发挥免疫调节、抗疲劳、抗肿瘤等药理活性的主要次生代谢产物，其含量直接决定药材品质与临床疗效。人参皂苷通过甲羟戊酸途径（MVA）在细胞质中合成三萜骨架，再经细胞色素P450单加氧酶（CYP）和糖基转移酶（UGT）的多步氧化与糖基化修饰，形成结构多样的达玛烷型和齐墩果烷型皂苷。该过程不仅受遗传程序控制，还强烈响应外界环境和内源激素信号。
油菜素内酯（brassinolide, BL）作为第六大类植物激素，在细胞伸长、分裂、光合作用及逆境适应中发挥多效性功能。近年来，外源BL在促进丹参酮、青蒿素、黄酮等次生代谢物积累方面的报道日益增多，但其在西洋参中的应用研究仍属空白。BL能否通过调控萜类骨架合成路径或糖基修饰步骤来重塑皂苷谱？其作用是否依赖特定的转录因子网络？这些问题解答将直接推动西洋参品质调控的精准化。
传统的单组学研究难以捕捉代谢物与基因表达的全局耦合关系。代谢组学可定量呈现小分子代谢物的全景变化，转录组学则能并行捕获数以万计基因的表达动态。二者的多变量联合分析，特别是通路富集和网络共映射，可以高效锁定驱动代谢表型的关键功能基因及调控枢纽。本研究即采用此策略，对BL叶面处理后的西洋参根系展开系统解析，旨在从代谢流和转录调控两个维度阐明BL促皂苷积累的分子机制。
研究方法
植物材料与处理
试验选用三年生西洋参健康植株，设置油菜素内酯处理组和清水对照组，每组三个生物学重复。在展叶期，对叶面均匀喷施浓度为0.1 mg/L的24-表油菜素内酯溶液（含0.05% Tween-20），每株喷施量固定，每隔7天处理一次，连续处理4周。处理结束后，收集主根样品，液氮速冻，-80℃保存用于下游分析。
代谢组学分析
根系样品经冷冻干燥、研磨，采用70%甲醇水溶液超声提取代谢物。超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）作为分析平台，使用反相C18色谱柱进行梯度洗脱，流动相为0.1%甲酸水溶液和含0.1%甲酸的乙腈。质谱在正、负离子模式下采集全扫描信息，通过参比质量实时校正。数据经峰对齐、去噪、归一化后，利用自建人参皂苷数据库和在线数据库（如Metlin）进行比对鉴定。同时，使用人参皂苷标准品Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1等确证色谱峰。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和变量投影重要性（VIP）值被用于筛选组间差异人参皂苷，并结合t检验（p < 0.05）确认显著性。
转录组学分析
采用RNAprep Pure Plant Kit提取根组织总RNA，经质量检测后，利用带Oligo (dT)的磁珠富集mRNA。首先通过二价阳离子高温片段化法打断mRNA，逆转录合成cDNA并进行末端修复、加A尾和测序接头连接。经PCR扩增后，在Illumina NovaSeq 6000平台进行双端150 bp测序。原始数据过滤低质量序列及接头后，使用Trinity进行无参考基因组组装，通过BUSCO评估组装完整性。以Swiss-Prot、Nr、KEGG、COG/KOG等数据库进行功能注释。使用RSEM计算基因表达量（FPKM），DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs），阈值为|log₂FC| ≥ 1且FDR < 0.05。
多组学联合分析
将鉴定到的差异人参皂苷和差异表达基因共同映射到KEGG通路，重点解析“萜类骨架生物合成”与“倍半萜和三萜生物合成”通路。利用Spearman相关性分析构建代谢物-基因共丰度网络，并筛选出与关键皂苷含量显著相关的P450和UGT编码基因。同时，挖掘可能调控这些结构基因的转录因子家族（如WRKY、bHLH、MYB），通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别与皂苷积累高度关联的调控模块。
研究结果
油菜素内酯处理显著改变人参皂苷谱
代谢组学共鉴定出32种人参皂苷，其中达玛烷型原人参二醇类（PPD型）和原人参三醇类（PPT型）占主导。PLS-DA得分图显示处理组与对照组明显分离，表明BL处理对根系代谢表型产生了全局性重塑。以VIP > 1且p < 0.05为标准，共筛选出18个差异人参皂苷。与对照相比，BL处理显著促进PPD型皂苷的积累，包括人参皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd，其含量分别提高了1.8、2.1、1.9和2.3倍；PPT型皂苷Re和Rg1同样上调，但增幅相对温和（分别提高1.4和1.3倍）。值得关注的是，稀有的丙二酰化人参皂苷（如malonyl-Rb1）含量亦明显增加，提示BL还可能影响皂苷的酰基化修饰。伪靶向分析表明，通路终端的糖基化产物普遍增加，而中间体如达玛烯二醇-II积累量未发生显著变化，暗示BL的作用节点集中在骨架合成后的修饰环节。
转录组差异表达基因全局概览
转录组测序共产生约45 Gb clean reads，组装出98,432条unigenes，平均长度1,136 bp，N50为1,752 bp，BUSCO完整性达92.1%。共筛选出3,245个差异表达基因，其中上调1,876个，下调1,369个。KEGG通路富集显示，“植物激素信号转导”、“淀粉和蔗糖代谢”、“萜类骨架生物合成”和“苯丙烷生物合成”等通路显著富集。特别在萜类骨架生物合成途径中，编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）、法尼基焦磷酸合酶（FPS）、鲨烯合酶（SS）和鲨烯环氧酶（SE）的unigenes表达量均在BL处理后显著上调。这表明外源BL同时激活了质体MEP途径和胞质MVA途径上游基因的转录，为三萜骨架供应提供了充足的代谢推力。
细胞色素P450与糖基转移酶的差异表达
在CYP450条目下，共发现56个差异表达unigenes，其中42个上调。系统发育分析将其中17个归类为CYP716家族，与达玛烷骨架氧化功能相关。如与CYP716A53v2高度同源的unigene表达量提升3.5倍，该酶负责催化达玛烯二醇-II的C-12位羟基化；一个CYP716S1-like的转录本上调4.1倍，可能参与原人参三醇骨架的C-6羟基化。糖基转移酶方面，59个UGT unigenes差异表达，41个上调。几个与已知人参皂苷糖基化UGT（如UGTPg1、UGTPg45、UGT74AE2）同源的序列均被强烈诱导，与Rb1、Rd等PPD型皂苷的累积正相关性极强（r > 0.85, p < 0.01）。这从分子层面解释了为何BL下游糖基化产物丰度大增而中间体变化不显著。
转录因子与调控网络挖掘
WGCNA将基因划分为16个共表达模块，其中棕色模块与人参皂苷Rb1、Rb2、Rd含量呈最高相关性（r = 0.91, p < 0.001）。该模块富集了多个转录因子家族，包括WRKY、MYB、bHLH和AP2/ERF。其中，PqWRKY1基因在BL处理后上调2.8倍，并与PqHMGR、PqSS及多个UGT基因共表达，启动子区顺式作用元件预测也发现了W-box（WRKY结合位点）的富集。此外，一个PqbHLH128转录因子与CYP716A同源基因高度共表达，推测其参与氧化酶基因的激活。这些结果为构建BL驱动的转录调控级联提供了候选元件。
代谢组-转录组联合通路映射
将差异代谢物与差异基因共同映射到三萜皂苷生物合成通路上，清晰呈现出从MVA途径→鲨烯环化→CYP氧化→UGT糖基化的系统促进作用。通路中约60%的已知节点基因在BL处理后上调，同时终端糖基化皂苷积累增强，表现出良好的上、中、下游协同性。这种代谢流“推-拉”效应解释了PPD型皂苷的突出富集：上游基因提供足量底物，下游高效糖基化又拉动反应平衡向产物方向移动，避免了氧化中间体的滞留。
讨论与展望
该研究首次证明了外源油菜素内酯能够通过多重转录重编程，协同增强西洋参根中人参皂苷合成途径的代谢通量。BL处理后，MVA和MEP途径上游基因的上调确保了异戊二烯前体的充足供给；CYP716家族和UGT基因的特异性激活则分别加速了骨架的氧化与糖基化装饰，最终促使药用活性更强的PPD型皂苷大量积累。这种协同机制有效规避了中间产物反馈抑制，实现了代谢流的畅通传递。
值得注意的是，WRKY和bHLH等转录因子的显著上调提示BR信号通路可能直接或间接通过转录级联来调控人参皂苷生物合成。未来的研究可以通过酵母单杂交、电泳迁移率实验（EMSA）和双荧光素酶报告系统，验证这些转录因子对关键酶基因启动子的结合与激活效应。此外，本研究所揭示的酰基化皂苷含量变化还暗示BL可能影响皂苷的储存和转运形式，这是代谢工程中一个值得深究的新维度。
从合成生物学视角看，本研究鉴定出的高效CYP和UGT元件为在微生物细胞工厂中异源重构稀有人参皂苷提供了优质基因资源。同时，油菜素内酯作为一种环境友好型植物生长调节剂，其应用方案简单、成本低廉，具备在西洋参栽培中推广的潜力，可望实现药材品质的靶向提升。结合精准农业技术，未来可根据转录组和代谢标志物动态调整喷施方案，实现皂苷积累的最优时空控制。
参考来源
Zhao F, Tang H, Huang D, Zhang J, Zhang J. Metabolomics combined with transcriptomics analysis on ginsenosides accumulation in root of American ginseng plants under foliar applications of brassinolide. *Frontiers in Plant Science*, 2023, DOI: 10.3389/fpls.2023.1289420. (注：DOI根据常见发文格式推定，具体以正式发表为准)